线粒体复合物I缺乏小鼠发生致命性脑肌病

总结

简介

线粒体在能量生产中发挥重要作用，钙²⁺缓冲、凋亡事件和活性氧（ROS）的产生(Nemoto等人，2000年;塞耶，2002年;夏皮拉，1996;Smith等人，2000年;华莱士，1999). 鉴于这些基本功能，线粒体衰竭与多种疾病有关，通常涉及高能需求组织，这并不奇怪(Coskun等人，2004年;Finster，2006年;Kim等人，2001年;Orth和Schapira，2002年;Zeviani等人，1998年). 神经、肌肉和心脏疾病通常由功能失调的线粒体引起，进展性脑肌病是常见的临床表现。线粒体CI相关缺陷是最常见的线粒体疾病(Benit等人，2003年;Kirby等人，1999年;Loeffin等人，2000年;佩特鲁泽拉和爸爸，2002年;Smeitink等人，2001年). CI是电子进入电子传递链（ETC）的主要入口点，由至少45种不同的蛋白质组成(Carroll等人，2006年). 非酶、核编码CI蛋白NADH的缺陷：泛醌氧化还原酶铁硫蛋白4（Ndufs4，18kD）导致人类出现类Leigh表型，导致出生后3-16个月内死亡(巴德，2000年,2003;Petruzzella，2001年;范登·胡维尔，1998). 患者的发现NDUFS4型突变包括生长迟缓、发育迟缓、视力缺陷、肌肉张力减退、脑肌病、心肌病、嗜睡和发育不良(Budde等人，2003年;Petruzzella等人，2001年;Scacco等人，2003年;Ugalde等人，2004年;van den Heuvel等人，1998年). 在人类中，Ndufs4似乎对CI的正确组装至关重要(Petruzella等人，2001年,Scacco等人，2003年).

尽管线粒体的重要性以及细胞呼吸功能障碍导致的许多疾病，但线粒体相关疾病的遗传模型很少。尽管其他小鼠模型会间接影响CI活动(Larsson等人，1998年;Park等人，2007年;Vahsen等人，2004年)，没有一个由CI特异性突变组成。我们创造了一个CI亚基的特异性突变(恩杜夫斯4). 在本文中，我们描述了他们的线粒体脑肌病表型。

结果

的表型恩杜夫斯4-null鼠标

有条件等位基因的小鼠恩杜夫斯4生成了基因（外显子2两侧为loxP位点）(图S1A、B). 纯合子恩杜夫斯4^{液氧/液氧}小鼠表现正常；然而，所有细胞中第2外显子的缺失(恩杜夫斯4^Δ/Δ=KO）导致了下述严重表型。外显子2编码线粒体靶向序列的最后一部分和成熟Ndufs4蛋白的前17个氨基酸。外显子2的切除产生移码，阻止成熟Ndufs4蛋白的合成。Western blot检测到KO小鼠蛋白提取物中未检测到Ndufs4蛋白(图S1C).

删除的小鼠杂合（HET）恩杜夫斯4等位基因与野生型（WT）小鼠无明显区别。到出生后第21天（P21），大多数KO小鼠都比正常小鼠小，并开始失去体毛；然而，在下一个毛发生长周期中，他们的头发又长回来了(图S2). KO小鼠在~P30达到最大体重~15克(图1A). 在P30之前，KO小鼠梳理、喂食、对新事物做出反应、社交，并且通常表现出与对照小鼠相似的行为。他们在白天和晚上都有正常的运动活动，直到~P30，他们变得昏昏欲睡(图1B). 总耗氧量(图1C)，一氧化碳₂在代谢室中测量2天以上（数据未显示），KO小鼠白天、夜间和禁食期间的清除率和食物消耗量均在正常范围内，但P30后体温比对照组低约2°C(图1D). KO小鼠失明，表现为视网膜电图中缺少B波(图1E)以及他们无法识别视觉悬崖（数据未显示）。早在P20，白内障有时出现在单眼或双眼；P35之后，KO小鼠通常不能完全睁开眼睛。直到P35，KO小鼠的声惊吓反应与对照组相似（并且经常超过）(图1F). P35后，随着发病时间的变化，惊吓反应迅速下降(图1F,插入)因此，一些年龄较大的KO小鼠（n=4）不再对高达120 dB的音调作出响应。从第35页开始，KO小鼠出现了严重的共济失调：它们的腿张开，对有力的轻推反应迟钝，扶正缓慢而笨拙，有时会失去平衡而摔倒。这些年长的KO小鼠无法在0.7 mm宽的壁架上保持平衡，它们没有通过负面的趋地性测试，它们试图在尾巴悬吊时抱住后腿，并且它们与对照组一样不能停留在旋转杆上(图1G). 对大脑、脑干、小脑和眼睛切片的光镜研究未发现P35时KO和WT之间有任何显著差异。特别是，甲酚紫或苏木精和曙红染色的切片中，既没有明显的梗死、神经元丢失，也没有明显的胶质增生（数据未显示）。在P35-50之间，KO小鼠停止增重，共济失调加剧，停止梳理毛发，最终死亡。

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图1

的表型恩杜夫斯4KO小鼠

（A） WT、HET和KO雌性小鼠的生长曲线。KO小鼠的体重明显低于HET或WT。n=4至56，取决于天数和基因型。P15学生双尾t检验后所有时间点的平均值±标准差p<0.05。

（B） 年轻（<P30）KO小鼠的运动活性与WT和HET（CT）相当，但年龄较大（>P30）的KO小鼠运动活性降低。*，老年CT小鼠和老年KO小鼠之间存在显著差异（p=0.0001，Student双尾t检验）。给出的数值为平均值±标准误差。

（C） KO小鼠（P26至P37）在代谢室72小时内的耗氧量（升/千克瘦质量/小时）与对照组在白天、夜间和禁食期间的耗氧量相同。n=9（WT），7（KO），p=0.5及以上，适用于昼间、禁食和夜间测量。给出的数值为平均值±标准误差。

（D） 年龄大于P30的KO小鼠的体温比对照组低约2°C。n=3-9，取决于日期和基因型。P30（学生双尾t检验）之后的所有天数p<0.001。给出的数值为平均值±标准误差。

（E） 视网膜电图显示KO小鼠（P21）缺乏B波，表明从感光细胞到双极细胞的神经传递失败。来自4只WT和2只KO小鼠的叠加痕迹。

（F） 与野生型小鼠相比，KO小鼠的惊吓反应（任意单位）增强，直至P36。n=14（重量<P36），14（KO<P36。给出的数值为90、100、105和110 dB时的平均值±s.e.m.*，p<0.0001。学生的双尾t检验。插入，重复测量老年KO小鼠（显示2例）显示惊吓反应逐渐丧失，但发病年龄不同；SR（%max）是最大惊吓响应的百分比。

（G） 年轻（<P20）KO小鼠的Rotarod表现（跌倒潜伏期）正常；然而，在年龄较大时，它们的表现明显不如WT小鼠。到了P40，KO小鼠无法在静止的Rotarod上停留足够长的时间来开始实验。n>20（CT），n=4（KO）。P21以上所有年龄段的数值均为平均值±标准误差*，p<0.0003，Student双尾t检验。

CI活性和丰度的测量

从肝脏中制备富集的线粒体样品，以测量呼吸能力。从WT和HET样品中分离出的线粒体亚颗粒（SMP）中检测到鱼藤酮敏感型CI活性，但从KO样品中未检测到(图2A). KO小鼠呼吸复合物II（CII）的最大酶活性显著升高。KO小鼠体内复合物III（CIII）和复合物IV（CIV）的活性与对照样品相当(图2A)，尽管KO小鼠的CIII活性往往较低。

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图2

呼吸活动

（A） 来源于KO肝脏的SMP没有CI活性，而CIII和CIV活性没有显著差异。CII活性显著升高。将数据归一化为柠檬酸合成酶活性（呼吸复合物活性的ΔAbs/min：柠檬酸合酶活性的△Abs/min）；因此，它们没有单位。三次检测，CI、CII、CIV n=12；n＝4 CIII.*，p=0.003；**，p=0.0001，Mann-Whitney试验。来自大脑和MEF的SMP也获得了类似的结果。给出的数值为平均值±标准误差。

（B） O的比率₂测量WT和KO小鼠（P35）的肝脏CI消耗量。箭头表示添加了：（1）组织，（2）ADP，（3）苹果酸/丙酮酸，和（4）鱼藤酮。O更少₂KO组织在苹果酸/丙酮酸（CI）存在下相对于WT的消耗，并且随着鱼藤酮的添加而停止。

（C） 比率O₂KO小鼠与WT小鼠的肝脏消耗量（氧气/mg组织/min）。KO组织的复合物I活性低于WT的一半，而CII和CIV活性没有显著差异，n=5。给出的值为平均值±s.e.m.*，p=0.0001，学生双尾t检验。大脑和肌肉也得到了类似的结果。

（D） 脑和肝线粒体CI的蓝色天然凝胶电泳（BNGE）。用Western blot检测代表三个主要CI亚复合物的蛋白质；在每种情况下，KO线粒体的复合物I完整性较差。

（E） 代表呼吸复合物I的三个主要亚复合物的蛋白质的SDS-PAGE。加载等量的线粒体蛋白质，MnSOD用作内标。样本与BNGE实验中使用的样本相同(图2D).

与SMPs获得的结果相反，在完整细胞中可检测到CI活性(图2B、C 和 图S3). 通过使用克拉克电极监测耗氧量来测量CI、CII和CIV的活性。以这种方式测量的复合活性意味着功能性呼吸链与作为最终电子受体的氧气耦合。KO和对照小鼠组织样品的耗氧量始终平行测量。KO小鼠组织的CI活性约为对照组的一半，而CII和CIV活性与对照组相当或略高(图2C). 在完整组织中检测到鱼藤酮敏感的耗氧量，但SMPs中缺乏CI活性，这表明在缺乏Ndufs4的SMPs制备过程中，功能性CI是不稳定的。

通过蓝色天然凝胶电泳（BNGE）评估肝和脑线粒体中CI的丰度。将等量的线粒体装载、电泳、印迹，然后用位于复合物不同部位的3种不同CI亚单位（Ndufs3、Ndufb6和Ndufa9）的抗体进行检测(图S4A). 与对照组相比，KO小鼠肝或脑线粒体中完整CI的丰度降低(图2D). 然而，对含有三种抗体的同一样本进行SDS-PAGE分析，可从WT和KO组织中获得等效信号(图2E). 这些结果表明，尽管CI的单个亚单位数量相当，但KO小鼠线粒体中完整CI的数量减少，这可能是KO组织耗氧量降低的原因。

肌肉生理学和代谢物测量

我们使用³¹核磁共振波谱测定ATP转换反应和ATP、磷酸肌酸（PCr）和无机磷酸盐（P_我)后肢缺血再灌注时的浓度体内.休息O₂使用血红蛋白和肌红蛋白饱和度的光学光谱测量消耗率体内在缺血期间，PCr耗竭，而P_我增加(图3A); 当氧气流量恢复时，PCr恢复到正常水平。缺血后PCr恢复率用于测定线粒体磷酸化能力（最大线粒体ATP生成量）。静止ATP需求(图3B)，磷酸化能力(图3C)和静止O₂对照组和KO组小鼠的摄入量（未显示数据）没有差异。实验结束时，测量肌肉总ATP和PCr。KO小鼠（P30岁）肌肉的ATP水平处于正常范围的低端，但PCr、Cr和无机磷酸盐（P_我)都很正常(表1).

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图3

后肢肌肉缺血再灌注时的ATP转换反应体内

（A） 说明PCr和P的代表性数据_我缺血和再灌注期间的动力学。静止ATP酶（相当于ATP需求）等于缺血期间PCr分解的初始速率（黑色回归线）。磷酸化能力是根据缺血后PCr的恢复来计算的（Bliel等人，1993年）。

（B） WT（黑条）和KO（开条）小鼠的静息线粒体ATP生成（等于静息ATP需求）没有差异。平均值±s.e.m.（c）WT和KO小鼠骨骼肌的磷酸化能力没有显著差异，P=0.12；WT组和KO组的n=6。给出的数值为平均值±标准误差。

表1

肌肉中代谢产物的浓度（µmol/克ATP湿重，P_我PCr和游离Cr）和血液（葡萄糖和乳酸的mM，±s.e.m.）

基因型	列车自动防护系统	无机磷酸盐	磷酸肌酸	肌酸	葡萄糖	乳酸
重量	9.13±0.50	4.04±0.68	26.89±1.98	13.31±2.01	7.98±0.49	1.4±0.09
击倒对手	7.85±0.59	3.09±0.40	25.77±2.28	15.08±1.42	7.48±1.32	1.9±0.19*

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P30小鼠测定ATP、P_我，PCr和Cr，通过使用光电二极管阵列检测器的高压液相色谱法；n=6（重量）和n=5（KO）。乳酸测定：P18-56（WT和HET（CT））n=14，P>40 n=6，（KO）。

^*p=0.001，学生双尾t检验。葡萄糖测定：n=22（CT）n=13（KO），p=0.12，Student双尾t检验。

KO小鼠的空腹血糖浓度与对照组无显著差异。大于P40的KO小鼠血清乳酸水平略有升高，为1.90±0.19 mM(表1)而年轻的KO小鼠（~P18）的乳酸水平与WT小鼠相似（数据未显示）。

肌肉线粒体与组织化学

通过使用小鼠线粒体DNA探针对对照组和KO小鼠（>P35）的大脑、心脏、肾脏、肝脏和比目鱼肌总DNA进行Southern blot分析，量化线粒体基因组的相对数量。KO组织中线粒体DNA带相对于核基因的强度与对照组相同(图S5).用电子显微镜检查肌肉组织中的线粒体形态和密度。线粒体超微结构正常；虽然比目鱼肌中存在大量肌下线粒体簇，但KO小鼠的趾长伸肌（EDL）纤维中没有线粒体簇(图4A).

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图4

KO和WT小鼠肌肉的组织学比较

（A） 比目鱼肌肌下鞘层的电子显微镜图像（P35）。KO小鼠50%的比目鱼肌纤维中观察到较大的肌瓣下线粒体簇（6个或更多线粒体深），而WT比目鱼鱼肌中没有线粒体簇大于5个的纤维。

（B） WT和KO小鼠肌肉的光学显微镜观察（P23岁，比目鱼肌；高度氧化的肌肉）。图示为糖化纤维（黄色箭头）和氧化纤维（红色箭头）。H和E，苏木素和伊红染色。格莫瑞三色染色；没有“破烂的红色”纤维。肌原纤维ATP酶染色显示纤维类型。对每种基因型的4只小鼠的玻片进行定量分析，发现糖酵解纤维的比例没有显著差异。SDH公司KO小鼠的染色强度通常稍暗，尤其是在ATP酶染色鉴定的氧化肌纤维中。对每个基因型的5只小鼠的玻片进行定量分析，结果显示没有显著差异。NADH公司KO肌纤维比目鱼肌的氧化酶活性较低，主要是慢氧化型（I型，黑色箭头）；白色箭头指向糖酵解（IIB型）纤维。考克斯KO小鼠的细胞色素氧化酶染色与WT相当。

KO小鼠（>P30）的糖酵解肌和氧化肌具有正常的多边形形态和外周核(图4B). 使用Gomori三色法染色后，对照组和KO组小鼠的肌肉显示正常，没有证据表明存在粗糙的红色纤维表型。肌原纤维ATP酶染色显示，包括胫骨前肌和比目鱼肌在内的各种肌肉均存在所有肌纤维类型。琥珀酸脱氢酶（SDH）染色强度在KO小鼠中通常稍暗，尽管定量分析显示没有差异。KO肌纤维中NADH氧化酶活性显著降低，而细胞色素c氧化酶（COX）活性在对照和KO肌中相当(图4B).

讨论

我们描述了由其45个亚单位中的一个突变引起的CI缺乏小鼠模型的表型。在缺乏Ndufs4蛋白的情况下，呼吸CI活性受损，出现致命表型，类似于在人类中观察到的Leigh样脑肌病NDUFS4型在缺乏Ndufs4的情况下，完整细胞的CI丰度和CI驱动的耗氧率显著降低。然而，ATP、PCr、葡萄糖和乳酸水平接近正常，KO小鼠的总耗氧量未受影响。虽然生长迟缓，但KO小鼠在前4周的活动和行为与WT小鼠相似；随后，尽管耗氧量保持不变，但嗜睡程度增加。P35后，KO小鼠的运动能力迅速恶化，体重减轻，通常死于P50。

我们证实Ndufs4 KO小鼠存在CI功能障碍。令人惊讶的是，当测量泛醌衍生物的还原时，从KO小鼠线粒体中分离出的SMP没有检测到CI活性，然而KO小鼠在出现严重疾病症状之前存活了5周，其总耗氧量似乎正常。我们怀疑CI在KO组织中至少有部分功能，并通过监测完整线粒体的摄氧量证实了这一点。KO小鼠的组织中明显存在CI依赖性耗氧量（鱼藤酮敏感性），尽管其比率不到对照组织的一半。KO小鼠完整线粒体中剩余CI活性与对照组具有相同的鱼藤酮敏感性（数据未显示）。一些完整CI的存在解释了骨骼肌ATP水平的原因体内正常，ATP在缺血后以相当于WT的速度再生。其他呼吸复合物的活性正常，或略有升高，与使用人类成纤维细胞和骨骼肌进行的研究一致NDUFS4型突变(Budde等人，2000年;van den Heuvel等人，1998年).

人类的突变NDUFS4型还可消除SMP中的CI活性，这种活性的丧失与大的亚复合物的出现有关，表明完整CI的稳定性或组装受到影响(Petruzzella等人，2001年;Scacco等人，2003年). 当用BNGE检测KO小鼠的CI时，结果表明完整CI的丰度降低，这与CI活性降低一致。没有亚复合物的证据NDUFS4型人类成纤维细胞的突变。我们的结果与报告的人类NDUFS4突变的结果之间的差异可能反映了用于分析CI完整性的本地凝胶电泳方法的不同效果，或者在两个物种中没有NDUFS4的情况下，剩余CI成分的不同稳定性。这两个物种在SMP中都没有CI活性。

分光光度法无法记录可测量的CI活性可能是由于SMP的制备。超声、冻融或清洁剂用于破坏线粒体，从而使底物能够进入线粒体内膜。我们假设这些操作破坏了一个已经受损的复合体，导致活动完全丧失。在这些条件下，人类Ndufs4缺陷成纤维细胞的非功能亚复合物可能是不稳定复合物的中间产物。由于NDUFS4完全缺失的人可以存活数月，我们怀疑他们也保留了一些CI活性，而来自患者的成纤维细胞系可能并不代表这种情况体内或者，小鼠和人类对Ndufs4缺乏症的反应可能不同。我们观察到，在没有Ndufs4的情况下可以形成一些完整的CI，这表明该亚基在复合物的组装或稳定性中起着重要作用，但完整的复合物可以在没有它的情况下形成，可能是因为其他蛋白质的补偿作用。

我们检查了代谢产物水平是否受到CI缺乏的影响。老年小鼠的血清乳酸稍高，但不足以提示中毒性酸中毒。降低的CI活性可能导致NADH的积累，这将对能量通量产生负面影响，并降低乳酸脱氢酶活性。乳酸中毒发生于线粒体功能异常的人类，包括Leigh综合征患者，但通常不发生于NDUFS4型突变，与我们的数据一致(Loeffin等人，2000年). 血糖水平也正常。KO小鼠肌肉中NADH氧化酶减少，证实CI缺乏。尽管NADH氧化酶活性降低，但肌肉形态似乎正常，支持KO小鼠肌肉中保留一些功能性CI的观点。KO小鼠的COX染色具有可比性，但有时在比目鱼肌等高氧化性肌肉中的染色强度略低于对照组。当SDH活性增加时，观察到COX活性降低(Lopeza等人，2000年;Rifai等人，2004年). KO小鼠氧化肌肉中的SDH染色有时比对照组更强烈，CII-驱动的O₂消耗量通常略高于对照组。此外，从KO小鼠分离出的线粒体能够支持显著更高的CII活性，这表明CII底物可以传递体内可能有治疗作用。虽然线粒体功能障碍患者的线粒体有时会在肌肉中积聚大量功能异常的线粒体(Schmiedel等人，2003年)Southern blot分析表明，KO小鼠肌肉和其他3个器官的线粒体基因组数量正常。电子显微镜显示，在高氧化性KO肌纤维亚群中，线粒体在茎鞘下积聚。尽管如此，用Gomori三色法无法识别出反映肌瓣下区功能失调线粒体堆积的破烂红色肌纤维。这与人类Leigh-syndrome患者肌肉的组织学相似，与线粒体总含量和肌纤维形态正常的观察结果相一致(Loeffin等人，2000年;Munaro等人，1997年;van den Heuvel等人，1998年).

尽管ATP和葡萄糖水平在正常参数范围内，但KO小鼠在幼年时死亡。静息状态下ATP水平和ATP生成率无缺陷，表明外周组织基础能量不足不是死亡原因。然而，在日益需要有效氧化磷酸化的组织中，如在成熟的大脑中，无法产生更多的ATP，可能会导致累积的有害影响。仅在神经元和胶质细胞中缺乏Ndufs4的小鼠（Nestin-Cre KO）的表型与此处描述的完整KO基本相同（未发表的观察结果）。CI缺乏的间接影响也可能导致脑肌病。线粒体运输异常、细胞信号改变、活性氧生成和/或钙受损²⁺缓冲可能是KO小鼠的严重表型的原因。当CI缺乏导致氧化应激时，Mn-SOD表达增加(Abid等人，2004年;Robinson等人，1998年); 然而，KO小鼠线粒体中的Mn-SOD水平正常。同样，在NDUFS4缺乏患者的人成纤维细胞中也未检测到超氧化物水平的增强(Iuso等人，2006年;Piccoli等人，2006年). 此外，KO成纤维细胞和神经元培养并没有增加ROS或细胞死亡（数据未显示），这与ROS在CI疾病中的作用相矛盾。

虽然线粒体功能障碍与多种中枢神经系统疾病和神经退行性疾病有关，但共济失调发病和发育障碍的机制尚未确定(Coskun等人，2004年;Finster，2006年;Kim等人，2001年;Orth和Schapira，2002年;华莱士，1999;Zeviani等人，1998年). 考虑到年长的KO小鼠存在视力缺陷、共济失调、听觉惊吓反应丧失和活动减退，很可能是神经元缺陷导致了脑肌病。KO小鼠过度的惊吓反应可能反映了抑制性神经元功能的丧失(Rajendra，1994年). 此外，凋亡诱导因子（AIF）的缺失导致CI含量降低，并主要影响大脑和视网膜(Vahsen等人，2004年)强调神经元对代谢缺陷的敏感性。有趣的是，KO小鼠的体内温度较低，即使在~4°C的温度下饲养数天，或放置在~42°C的加热垫上，它们也能保持此温度（数据未显示）。这表明P30后下丘脑对温度的控制可能会出现缺陷(Boulant，2000年;Laurberg等人，2005年)如果蛋白折叠受到影响，可能是KO表型的部分原因。

线粒体和CI在人类疾病中的作用尚不清楚。由于缺乏合适的研究动物模型，这一领域的进展受到阻碍。这里描述的KO小鼠具有类似于人类线粒体脑肌病的分子和行为特征，表明恩杜夫斯4KO小鼠将成为研究CI缺陷的有用遗传模型。因为我们设计了一个条件恩杜夫斯4等位基因、CI缺乏症可局限于特定的细胞类型，CI失活的发生可以调节。因此，通过将这些小鼠与各种Cre表达系杂交，应该可以确定哪些细胞以及何时需要CI活性来维持正常的生理、行为和生存。

实验程序

补充材料

致谢

脚注

参考文献