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《计算机神经学杂志》。作者手稿；PMC 2008年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
《计算机神经学杂志》。2007年1月10日；500(2): 222–238.
数字对象标识：10.1002/cne.21144
预防性维修识别码：PMC2590657型
美国国立卫生研究院：NIHMS76065
PMID：17111372

我视网膜变性10（rd10）突变小鼠的视网膜组织：形态学和ERG研究

加吉尼俱乐部,1 伊娃·特尔齐巴西,2 弗朗西丝卡·马佐尼,2和恩里卡·斯特雷托2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

视网膜变性10（rd10）小鼠是一种常染色体隐性遗传色素性视网膜炎（RP）模型，由Chang等人于2002年这些小鼠携带着杆状磷酸二酯酶（PDE）基因的自发突变，导致在P18左右开始的杆状变性。随后，圆锥体也会丢失。由于光感受器退化与视网膜发育不重叠，并且在出生后大约一个月内可以记录到光反应，因此rd10小鼠比众所周知的rd1突变体更接近于模拟典型的人类RP。本研究的目的是对rd10小鼠视网膜在感光细胞最大变性期间的形态和功能进行全面分析，从而为利用这种新模型研究视网膜色素变性提供有用的数据。

我们用定量免疫细胞化学和共聚焦显微镜分析了不同年龄rd10小鼠视网膜细胞的形态和存活情况；我们还通过视网膜电图（ERG）研究视网膜功能，记录在P18和P30之间。

我们发现双极细胞和水平细胞中的光感受器死亡（在P25左右达到峰值）伴随着树突状回缩，最终发生继发性变性。ERG显示早在P18（内部神经元的任何明显形态变化之前），内视网膜的生理学就发生了变化，但与双极细胞的频带放大率降低一致。

因此，rd10视网膜的变化与之前在rd1突变体中发现的变化非常相似。然而，视网膜结构和功能的整体缓慢衰退预示着rd10小鼠可能成为救援方法的优秀模型。

关键词：视网膜色素变性，双极细胞，水平细胞，共焦显微镜，免疫细胞化学，ERG

大量的基因突变影响眼睛。那些发生在感光细胞或色素上皮特异性基因中的基因通常会导致视网膜退化（RD），这是一个以感光细胞功能障碍和死亡为特征的遗传性营养不良家族。

据估计，全世界有1500多万人因遗传性视网膜色素变性而丧失视力。其中包括患有视网膜色素变性（RP）的患者，这种疾病目前尚未治愈(Chader，2002年).

30多年来，啮齿类动物的视网膜为研究遗传性RD的动力学和机制提供了宝贵的工具，因为小鼠感光细胞经历了与人类密切相关的自发DNA突变引起的营养不良。

在小鼠模型中，最具特征的是视网膜变性1（rd1）小鼠，几十年前首次被描述为无杆表型（综述于Farber等人，1994年). 这种动物携带着棒状磷酸二酯酶（PDE）基因的β亚基的自发突变，导致棒状物在出生后的头几周大量死亡。与典型的RP一样，锥体最终也会消亡(LaVail等人，1997年;皮尔斯，2001). 感光细胞的快速退化明显限制了rd1突变体用于救援研究；此外，视杆死亡的发生与视网膜突触发生的晚期相重叠。这一事实使得很难区分杆退化的主要影响和神经元连接异常发育的后果。

最近，又分离出一个自发突变株（rd10；Chang等人，2002年)它携带同一个rod-PDE基因的重突变，导致杆状体的迟发性退化，继而导致球果的死亡。最近的研究表明，由于表型进展较慢（更像典型的人类RP），rd10突变体有可能成为研究这种疾病的细胞生物学和测试治疗工具的模型(Otani等人，2004年;雷克斯等人，2004年).

本论文的目的是对rd10小鼠视网膜在不同时间发生的变化进行详细分析：到目前为止，只有一些关于这种突变的感光细胞和血管变性的时间进程的信息(Chang等人，2002年;Otani等人，2004年;雷克斯等人，2004年). 我们分析了视网膜内细胞，尤其是二级神经元在疾病进展的不同阶段的形态和存活情况。此外，利用相对较慢的rd10表型，我们通过视网膜电图（ERG）研究视网膜功能的衰退，在rd1突变株中，仅在睁眼后几天内才能记录到视网膜功能的衰减。

在rd10小鼠中，我们发现视网膜内神经元发生了深刻的变化，伴随着光感受器的丢失，与我们在rd1小鼠中已经报道的情况类似(Strettoi等人，2002年，2003年；已在中审阅Marc等人，2003年). 然而，在rd10突变体中，视网膜的整体结构和功能保留了更长的时间。考虑到内视网膜是设计用于治疗RP的修复策略的生物平台，如基因治疗(贝内特，2000年;Acland等人，2001年)，移植(Lund等人，1997年)或假肢装置的应用(Loewenstein等人，2004年)，我们的发现表明rd10突变是测试救援方法的良好底物。

方法

所有实验程序均按照视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科学和视觉研究中使用动物的声明进行，神经科学学会规定脊椎动物在研究中的使用，以及意大利卫生部关于动物实验的法律。

动物

rd10菌株的小鼠（在C57Bl6/J背景上）和wt C57Bl6/J对照小鼠（均来自美国杰克逊实验室）用于本研究。动物被饲养在当地的设施中，有水和食物随意，在12小时的光/暗循环中，照明度低于60勒克斯。

免疫细胞化学（ICC）

通过腹腔注射阿维汀（15 mg/kg）麻醉成年（1-9个月）小鼠，并在pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中经心灌注4%对甲酸（PAF）。幼年动物（10–20天）在麻醉下摘除眼球，眼睛浸入PAF中。对于ICC切片，将整个眼睛进行蔗糖过滤，在−20°C下冷冻，并在低温恒温器上连续切片14μm。将同一菌株的3只年龄匹配的动物的切片安装在同一载玻片上，以确保组织处理的差异最小，并允许进行一致的比较。在固定后从眼罩中分离出视网膜后，对视网膜整体支架进行ICC。用于标记视网膜细胞类型的主要抗体在表1次要抗体为抗鼠俄勒冈州绿488、抗鼠Alexa Fluor 488和抗兔Alexa 568。球果用Alexa Fluor 488-共轭花生凝集素染色。核染色采用埃塞俄比亚同二聚体2的微摩尔溶液（所有荧光探针均来自意大利米兰Invitrogen的Molecular probes）。根据制造商关于冰冻切片的协议（分别为Promega Italia和Chemicon International）进行Tunel染色和Fluoro Jade B荧光组织化学。使用配备氪氩激光的徕卡TCS-NT共聚焦显微镜检查视网膜制剂。为了比较野生型和rd10制剂中的视网膜细胞形态，匹配以下参数：年龄；固定和免疫染色方案；视网膜偏心率（与视神经头的距离）；共焦显微镜的放大倍数、针孔尺寸、增益和偏移；扩展焦距图像的厚度。文件以TIFF格式保存，并在配备Metamorp®软件的图像工作站上导出。在垂直切片上，每种毒株的三个胎龄（P10、P20、P30、P45、3.5、7和9个月）的每只幼崽被用于ICC，并与上面列出的全部抗体反应。ICC共使用60只体重为10磅和12磅的动物。

表1

本研究中使用的抗体一览表

一级抗体来源主机代码免疫原公认的乐队
NK3受体美国Novus Biological Inc.Abeam兔子300-102-ab7型15大鼠NK-3（aa 438–452）C末端与牛甲状腺球蛋白偶联的合成肽
去α加利福尼亚州特梅库拉Chemicon鼠标MAB 3073号纯化牛脑Goα39-42 kDa的单个蛋白质带
谷氨酰胺合成酶（GS）加利福尼亚州特梅库拉Chemicon鼠标MAB 302号机组绵羊脑谷氨酰胺合成酶的纯化单波段
恢复素加利福尼亚州特梅库拉Chemicon兔子AB5585型重组人回收素一个26 kDa频段（制造商技术信息）。
mGluR6型加利福尼亚州特梅库拉Chemicon兔子拉13105大鼠序列的合成C末端肽（KKTSTMAAPPQNENAEDAK）96和200 kDa的两条谱带（可能是二聚体）
活性caspase-3 pAb意大利米兰Promega兔子G7481型来自Caspase-3亚单位链29-175的肽（人类Caspase-3的p17片段）
钙结合蛋白D克隆CB-955美国密苏里州圣路易斯市SIGMA鼠标第9848页来源于CB-955杂交瘤，该杂交瘤由小鼠骨髓瘤细胞和BALB/c小鼠脾细胞融合而成，用纯化牛肾钙结合蛋白D-28K免疫。单个28 KDa乐队
钙结合蛋白D（EG-20）美国密苏里州圣路易斯市SIGMA兔子C2724型与KLH偶联的大鼠钙结合蛋白D-28K（氨基酸225-244，N-末端添加Lys-Gly）C末端区域对应的合成肽
胶质纤维酸性蛋白（GFAP）美国密苏里州圣路易斯市SIGMA兔子G9269型从人脑中纯化的GFAP
PKCa克隆MC5美国密苏里州圣路易斯市SIGMA鼠标第5704页纯化牛脑蛋白激酶C80kDa频段
PKCa公司美国密苏里州圣路易斯市SIGMA兔子第4334页与KLH偶联的联会肽（Lys-Val-Asn-Pro-Gin-Phe-Val-His-Pro-lle-Leu-Gin-Ser-Ala-Val）80kDa多肽和45kDa的小条带
神经丝200 kDa克隆N52美国密苏里州圣路易斯市SIGMA鼠标N0142型猪去磷神经丝H亚单位羧基末端尾段200kDa频段

抗体特异性

NK3-R抗体对锥体双极细胞群进行染色，与Casini等人，2000年Goα抗体在蛋白质印迹中识别出39–42kDa的单个蛋白带；在视网膜切片上，这种抗体在双极细胞上染色，与Dhingra等人，2000年谷氨酰胺合成酶抗体在Western blot上识别出一条预期分子量的单条带，并在视网膜制剂中对具有典型Müller胶质细胞形态的放射状细胞进行染色。回收蛋白多克隆抗体在Western blot上识别26kDa的一条带；根据已发表的结果，他们对光感受器进行了特殊染色，并对锥体双极细胞进行了低强度染色(Haverkamp等人，2003年). Western blot检测mGluR6多克隆抗体特异性；通过抗体与合成肽抗原的预吸收，识别的条带消失。染色模式与Nomura等人1993年发表的染色模式一致。针对Caspase-3的抗体仅对酶的裂解形式和识别的凋亡细胞具有特异性。在我们的制备过程中，它对一部分也被TUNEL标记的感光细胞进行了染色。Calbindin D抗体的特异性事先通过Western blot检测；免疫肽的预吸收阻止了染色。免疫印迹法检测PKC抗体的特异性。他们标记了典型的棒双极电池，如Strettoi等人，2002年脑提取物上的免疫印迹证实了GFAP抗体的特异性。最后，通过免疫印迹法评估了神经丝抗体的特异性。染色模式（水平细胞轴突树突和神经节细胞）与以前的文献一致(Peichl等人，1994年).

细胞计数

用PKC抗体和Calbindin D抗体染色的视网膜整体来估计1.5、3.5、7和9个月龄rd10小鼠视网膜中的杆双极细胞和水平细胞数量。每个年龄段使用四对视网膜。以1μm的间隔获得了连续的光学切片，以覆盖整个内核层（INL）的厚度，包括杆双极细胞和水平细胞的胞体。扫描区域为32个场，杆式双极电池为125 x 125μm，水平电池为250 x 250μm。视野沿视网膜背腹经线和鼻颞经线有规律地分布。在Metamorph®软件的帮助下，通过堆叠一系列单个焦平面，对覆盖INL整个厚度的串行重建进行了棒双极细胞计数。每个细胞通过一级树突出现的位置进行识别，并在单个焦平面内进行计数；然后在z堆栈中跟踪每个单元格，并且只统计一次。这种方法不需要额外的修正来补偿与单个节段中细胞计数程序相关的过度计数(吉列里，2002年).

在INL的扩展聚焦图像中计数水平细胞，对应于z平面上12微米的平均厚度。由于水平单元体的间距很大，并且不重叠，因此不需要计算单独的焦平面。使用显微镜摄像头（蔡司Axiocam）采集含有标记杆双极或水平细胞的视网膜轮廓，该摄像头与允许计算视网膜面积的专用软件（蔡斯AxioVision）接口。用平均细胞密度乘以相应的视网膜面积得到细胞总数。使用Excel 9.0进行统计分析（单向方差分析）

使用每个视网膜位置的平均密度值生成8 x 8平方矩阵，然后使用Sigmaplot 8.0软件进行分析，以获得不同年龄段的视网膜等密度图。

电生理学

小鼠在黑暗中适应过夜，然后如上所述进行麻醉。用电热毯将体温维持在37°C。通过记录心电图连续监测动物的一般情况。使用Tropicamide（1%Sigma-Aldrich，Milan，Italy）滴剂扩张瞳孔。角膜用一薄层甲基纤维素溶液保持湿润。在每次实验结束时，动物都被过量麻醉剂杀死。

通过与角膜接触的卷曲金电极记录视网膜电图（ERG）。放在嘴里的一个小金盘既是参考又是地面。通过PC接口（意大利米兰国家仪器实验室5.1）对响应进行差异放大，在0.3–500 Hz下进行带通滤波，并以0.25–0.5 ms的间隔进行数字化。响应（n=5）的平均值为刺激间隔时间，范围从昏暗灯光的20秒到三次最亮闪光的5分钟。

通过直径为30厘米的甘兹菲尔德球体实现全场刺激，该球体的内表面涂有高度反光的白色涂料。电子闪光装置（SUNPAK B3600 DX；日本东京Tocad公司）产生了一个刺激物，其能量随时间衰减，τ=1.7 ms。使用了7.5 nm半带宽的短波带通滤波器（Spindler and Hoyer GmbH u.Co.Göttingen，德国），其暗视有效λ=492 nm。通过传递白光闪光获得饱和a波响应，白光的暗视和明视效能评估如下Lyubarsky和Pugh（1996）.使用校准的中性密度过滤器来衰减闪光强度。使用IL-700光度计（International Light，Newburyport，MA，USA）和暗点滤光片（经修订的Z-Commission International de l'Eclairage，CIE）以光度单位测量角膜平面的闪光亮度，并取20次闪光的平均值。通过该程序获得的最大闪光强度为1076 cd/m2.角膜闪光强度到光异构化棒单位的转换−1每次闪光（Φ）遵循Sazik等人（2002）。我们的估计值是通过使用基于我们测量的小鼠眼睛参数获得的（瞳孔面积：3.2 mm2; 视网膜面积：18 mm2)根据以下数据Lyubarsky等人（2004）因此，估计的最大视网膜照度为3443暗视td/s，对应于5.5 x 105Φ.

a波的前缘与杆状G蛋白转导级联的激活相模型相吻合(兰姆和普格，1992年;普格和兰姆，1993年)根据方程式：

F（t）=exp[−1/2ΦA（t−t效率)2]
(1)

式中，F（t）是归一化为暗值的循环电流的分数，A是放大系数，单位为s−2/Φ，表示为级联级的增益参数和t效率包括响应和仪器中包含的任何延迟。更多详细信息见Gargini等人（2004年）.

光刺激由校准的绿色LED产生，并由计算机辅助的特殊用途函数发生器驱动（参见Demontis等人，2005年). 刺激对比度，定义为：[(L（左）最大值−L（左）最小值) / (L（左）最大值+L（左）最小值)]x 100为85%，平均亮度为36Φ。对稳态条件下获得的扫描进行平均，并使用Origin 6.0（Microcal，CT）中实现的快速傅里叶变换（FFT）例程计算信号的功率谱。

共有30只rd10动物和25只wt对照动物用于电生理实验。

结果

1.光感受器变性

视网膜垂直切片上的乙炔核染色显示外核层的行数逐渐减少（仅限；图1). 出生后第10天（P10）为12-14行，第20天为11-12行。从P20到P25，onl突然下降到2–3层细胞核。在P30，花生胶（PNA）染色显示残留的锥体，其内外节缩短，形状变形。在第45页，只剩下一层感光层。PNA染色表明，剩余的细胞大多是异常的视锥(图1).

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rd10小鼠视网膜的垂直切片，显示感光细胞的进行性变性。红色信号：乙炔核染色；绿色信号：opl锥体内节和突触末梢的PNA染色。

答：在P20处，在感光细胞主动死亡的中央视网膜中可以看到许多外显核（箭头所示）。在同一年龄段，周边的感光细胞死亡略落后（B中的箭头）。C和D：在接下来的10天里，感光细胞数量持续下降；onl在中央（C）减少到3行，在外周视网膜（D）减少到5-6行。锥体仍然清晰可见，尽管其外部和内部部分看起来很短且变形。E和F：感光细胞退化的晚期；晚期PNA染色不足以显示锥体。在P45，只有一行核存在于onl（E）。9个月时，该行是不连续的（F）。棒材为20微米。

荧光PNA染色可显示5个月大的动物外丛状层（opl）的分散轮廓。这些轮廓对应于退化球果的剩余部分，其花梗在内外节缺失后仍然存在。核染色显示，早在9个月大时，onl的卵圆形轮廓(图1). 最有可能的是，一小部分锥体细胞在选定的视网膜区域存活很长时间，正如rd1突变株所显示的那样(LaVail等人，1997年;Ogilvie等人，1997年).

rd10视网膜光感受器的退化遵循明显的中心-边缘梯度。首先，中央视网膜上的行数减少明显，而外围的退化稍有延迟（约2-3天）(图1).

乙锭染色显示在上皮细胞中的许多细胞中存在核浓缩（比重瓶）(图1); 此外，退化的光感受器可以标记为常见的细胞凋亡标记。Fluoro-Jade组织化学和TUNEL染色分别表明神经元损伤和DNA断裂，突出显示视网膜外侧的浓缩细胞轮廓，P20–P25颞窗染色最多(图2). 正如预期的那样，TUNEL和Fluoro-Jade染色也显示出中心-边缘梯度：在P26处，标记的轮廓在中央的出现频率是外周视网膜的2-3倍。相反，P30后，TUNEL阳性小体更常见于视网膜周边。

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感光层中的凋亡标记。A： 荧光素阳性分布在P20视网膜的最外层。B： 感光细胞在P25处用TUNEL法染色阳性。凋亡轮廓清晰可见（插图：onl放大4倍，与B所示相似）。棒材为20微米。

抗前凋亡酶Caspase 3激活形式的抗体也在onl中显示出一种特殊的染色模式，这在P30周围尤为明显。几乎没有染色的剖面（标记强烈）不规则地分布在整个线上（数据未显示）。

对于每个视网膜偏心率，荧光翡翠组织化学标记的轮廓数量最多，TUNEL染色居中，活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体标记的轮廓最少。这与三种方法揭示的不同标记物一致(Schmued等人，1997年;蔡司等人，2004年). 因此，在rd10小鼠视网膜中，在2第和3个第产后周；死亡波在4号期间最大第个出生后一周，大约2周后与密切相关的rd1突变体相比。大多数视锥细胞在出生后2个月内消失，尽管直到9个月大时仍存在一排不连续的细胞核。光感受器死亡似乎是通过凋亡机制发生的，因为它们的细胞核是尖刺状的，它们的DNA片段化，其中一些细胞中表达一种激活形式的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。

2.杆式双极电池

在P10–P20的时间间隔内，杆状双极细胞的形态和层压没有明显变化。这些神经元具有众所周知的形态，其特征是直径约10μm的椭圆形细胞体、浓密的枝状树枝状结构和长轴突，最后在内网状层（ipl）的深层出现大的静脉曲张。杆状双极细胞用抗PKCα抗体均匀染色。P25左右，杆状双极细胞树突变短；这一过程在中央视网膜中更为明显(图3). 在感光细胞退化的同时，树突状细胞退化进一步发展，并在P30处变得明显。在P45，外周视网膜的杆状双极细胞上只剩下少量树突，而中央大部分神经元完全没有突起(图4). ipl中杆状双极细胞轴索的形态、大小和复杂性没有明显变化(图3和​和44).

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在rd10小鼠的视网膜中，与野生型细胞相比，杆双极细胞在P30处的树突补体明显减少（a中的箭头）。棒材为20微米。

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杆状双极细胞的PKC染色（绿色）显示树突进行性回缩，在P30（A）和P45（B，箭头）之间完全消失。mGluR6聚集体（红色标记）也随着时间的推移而减少，并转移到双极细胞的细胞体膜和轴突上（箭头所示）。opl中的残余簇大多位于锥形双极细胞的树突状尖端。

棒材为20微米。

树突的退化伴随着mGluR6的分布变化，mGluR6是负责杆-杆双极细胞突触通讯的主要谷氨酸受体(图4). 正常情况下，该受体在opl中有选择性地大量表达，修饰双极细胞树突的顶端部分，这些双极细胞对光的反应具有梯度去极化作用（杆状和“ON”锥状双极细胞）。用mGluR6抗体对轻度固定的视网膜切片进行染色，显示典型的点状簇，对应于opl中双极突触后膜上的受体聚集。

在rd10突变小鼠的视网膜切片中，mGluR6的染色模式相对正常，直至P25，尽管染色不限于生长的双极树突尖端，如wt对应物，但也存在于细胞体膜中。从P25开始，opl中的染色逐渐减少，而在细胞体膜和细胞轴突中检测到越来越多的点状物，沿着它们在inl中的过程(图4A). 免疫反应性降低和mGluR6移位随时间推移而进行；在P45，opl中的残留染色与杆双极细胞的树突无关(图4B); 最有可能的是，mGluR6簇与ON锥双极细胞的树突相连。因此，与杆状双极细胞的树突一起，它们的主要谷氨酸受体也经历了相应的减少和错位。

3.锥形双极电池

小鼠视网膜至少有9种锥状双极细胞(Ghosh等人，2004年;Pignatelli和Strettoi，2004年); 由于这些神经元相似，并且具有密切相关的分子决定簇，因此无法获得能够单独标记每种类型的抗体。抗肽Neurokin 3受体的抗体标记大量锥体双极细胞，在ipl的最外层亚层有轴突树突，在opl的扁平树突(Casini等人，2000年). 这些是假定的非共线双极电池。我们从P10开始对rd10小鼠视网膜垂直切片进行NK3-R抗体染色，以确定染色模式是否正常。我们发现NK3-R标记模式在P45之前没有明显异常。标记细胞形成一个规则的层，在ipl的最外层有浓密的轴索。opl中树突扁平且清晰可见(图5). 大约两个月大时，opl中的树突丛开始逐渐不连续；4-5个月大的动物在NK3-R阳性细胞中显示出明显的树突状分支收缩。然而，我们发现，在2个月以上的动物中，NK3-R抗体没有以可重复的方式起作用，然后我们使用了标记类似形态的锥体双极细胞的恢复素抗体(Ghosh等人，2004年;Pignatelli和Strettoi，2004年). 在广泛的光感受器变性后，恢复素特别有用，因为只有锥状双极细胞被染色，并且它们的树突可以清楚地看到。在9个月大时，恢复素抗体显示免疫反应性锥双极细胞中几乎没有树突(图5B).

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rd10变性晚期锥体双极细胞的树突丢失。A： 锥体双极细胞的NK3-R染色显示，外半部有轴突树突，树突形态正常。B： 在9个月及以上的动物中，相同类型的锥状双极细胞，用受体抗体（红色）标记，已经完全失去树突；细胞体看起来完全平滑（左箭头）。绿色信号：双极神经元的Goalpha标记显示opl中没有进程（双箭头）。棒材为20微米。

Goα抗体标记杆状双极细胞和ON-cone双极细胞(Dhingra等人，2000年). 在7-9个月时，用该标记物染色更明显地突出了树突回缩的过程。Goα和recoverin双重标记显示opl双极神经丛净减少(图5B).

4.水平单元格

啮齿动物视网膜包含一种单一类型的水平细胞，其中来自细胞体的树突状树枝状突起位于opl的锥体末端的突触后。广泛的轴突树枝状突触通过一个薄的水平轴突与细胞体相连，是与杆的突触后缘。Calbindin D免疫染色可显示整个水平细胞丛；相反，神经丝抗体标记轴突分支(佩奇尔，冈萨雷斯-索里亚诺，1994年). 我们使用这两种抗体来观察不同年龄段rd10视网膜的水平细胞。

水平细胞的形态在P10到P45的时间间隔内没有发生重大变化。大约两个月大时，位于视神经头附近的视网膜中央区域的水平细胞的轴突分支发生了微妙的变化，失去了从高级分支出现的精细的末端突起。随着时间的推移，细丛的逐渐衰减更加明显；3个月龄时，opl中神经丝抗体染色的神经丛较薄，不太复杂。同时，属于轴突分支的较厚突起变得更加明显；与wt相比，它们在opl中形成了更松散的网状结构(图6).

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Calbindin（红色信号）和神经丝（绿色）染色显示，与wt对应物（B）相比，rd10小鼠P30（A）水平细胞树突和轴突树枝状结构的复杂性降低。wt水平细胞的细树枝状分支（箭头所示）在突变体中完全缺失。棒材为20微米。

用相同抗体染色的视网膜整体支架揭示了水平细胞中树突状回缩过程的广泛性(图7). 到4个月大时，树突和细枝的轴突补体都完全消失了。在研究期间，我们没有发现水平细胞树突状突起与轴突突起的丢失在时间上存在明显的不匹配。此外，以前在其他突变体的视网膜中描述的水平细胞轴突树枝状突起的过程，在rd10小鼠中几乎无法检测到。

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视网膜整体支架的钙结合蛋白染色显示，与wt型（B）相比，rd10小鼠（A）的视网膜水平细胞突起大量丢失。年龄（7个月）、偏心率（背周）和投影图像厚度匹配。棒材为20微米。

5.米勒细胞

通过针对谷氨酰胺合成酶（GS）的抗体，催化谷氨酸转化为谷氨酰胺，以及针对细胞骨架纤维组分GFAP的抗体，研究了rd10小鼠视网膜中的Müller胶质细胞，已知GFAP在胶质活化中上调。

GS抗体适当地显示了从P20开始的Müller细胞的典型形态。在年轻时，这些抗体不能正常发挥作用，可能是GS酶的低水平表达。P20后，在整个9个月大的婴儿中，rd10视网膜的GS染色始终正常，并有规律地分布在视网膜表面。只有Müller细胞外部长度的减少是明显的，这明显与感光细胞的大规模变性导致的外视网膜变薄有关。

在正常、健康的视网膜中，GFAP在星形胶质细胞和眼睛远端的少数Müller细胞中表达。在rd10视网膜中，这种wt样表达仅限于P10-P20期。伴随着感光细胞的峰值变性，P20后，越来越多的Müller细胞出现GFAP阳性(图8). 抗体染色显示出与GS相似的模式，但Müller细胞末端标记更强烈。我们在14个月大的rd10动物的视网膜中央检测到GFAP阳性反应，明显属于Müller细胞。在动物的一生中，米勒细胞中的GFAP很可能一直很高，这可能也与突变体内视网膜发生的主要血管改变有关(Otani等人，2004年).

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P20（A）和P60（B）年龄段rd10视网膜Müller细胞中GFAP的上调。请注意，视网膜厚度从A减至B。Bar为20微米。

6.杆双极和水平电池的存活

杆式双极电池

我们通过计算1.5、3.5、7和9个月大的小鼠全坐骑制剂中PKC阳性细胞的数量来评估rd10突变中的杆状双极神经元的存活率(图9，顶部面板）。在3个月大的rd1小鼠的中央视网膜中，这些神经元的数量减少(Strettoi和Pignatelli，2000年).

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显示1.5个月、3.5个月、7个月和9个月龄rd10视网膜中杆状双极细胞和水平细胞存活率的直方图。列是细胞/视网膜的平均总数，带有标准误差。星号表示每个年龄组的细胞数量与1.5个月时的细胞数量之间存在显著差异。数据由4个独立实验获得，实验一式三份，并用单因素方差分析（**表示p<0.05，***表示p<0.01）。

在1.5个月大时，杆状双极细胞通常分布在视网膜表面，具有典型的中心-边缘梯度，在等密度图上很容易看到(图10，左侧面板）。在1.5到3.5个月大的婴儿中，我们发现双极杆细胞的数量减少了20%。在随后的年龄段，细胞总数保持相对稳定，在9个月龄时达到最低值，相当于减少23%(图9，顶部面板）。

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在1.5个月（上）和3.5个月（下）大时，rd10视网膜的双极杆细胞（左）和水平细胞（右）的等密度图。每张地图都基于4个不同年龄匹配视网膜的平均密度。图例为单元格/mm2注意鼻视网膜中杆双极细胞密度的净减少；相反，颞视网膜中的水平细胞减少得更快。在3.5个月时，两种细胞类型的存活图沿背腹轴几乎对称。

等密度曲线显示了杆状双极细胞丢失的各向异性：叠加在中心-周边梯度上，我们观察到视网膜鼻象限的细胞数量减少更为明显(图10，左侧面板）。

水平单元格

我们估计了1.5、3.5、7和9个月龄的rd10小鼠在用Calbindin D抗体治疗的视网膜整体支架上的水平细胞数量。对于棒型双极电池，我们观察到在1.5到3.5个月的时间间隔内水平电池的净损失（约19%）(图9，底部面板）。细胞数量随着时间的推移继续减少；9个月时，细胞丢失率约为29%。等密度曲线显示了水平细胞丢失的各向异性：叠加在中心-周边梯度上，视网膜颞象限的减少更为明显(图10，右侧面板）。

7.其他影响

对视网膜整体支架进行细胞计数检查，发现了与后期光感受器变性相关的其他结构重塑因素。我们发现几个杆状双极细胞的细胞体明显错位，朝向视网膜外侧；这些细胞看起来完全没有树突，形成了第二层，位于通常放置在inl中的细胞的外层。有时，外排细胞体到达外界膜。有时这些细胞也可以在垂直切片中观察到（参见图4). 在用PKC或钙结合蛋白染色的视网膜整体支架中，可以最佳地估计opl中树突的渐进性丢失和树突焦平面的明显变薄。

9个月大时，PKC抗体染色显示视网膜内部出现模式化的紊乱，双极细胞排列在圆形区域中，很像视网膜玫瑰花结（未显示）。这些模式是其他形式视网膜变性的特征(Marc等人，2003年). 视网膜表面上成簇出现的玫瑰花结，主要通过在ipl中的杆双极轴突和轴突树突染色显示，而在用钙结合蛋白抗体染色的整个视网膜中不太明显。然而，水平细胞的细胞体以非常不规则的马赛克分布在视网膜表面，有明显的空区。因此，尽管观察到的细胞丢失总体上是有限的，但视网膜内神经元的细胞体重组确实发生在rd10小鼠视网膜的后期。

8.电生理学

通过分析对闪光和周期性刺激（包括平均亮度时间的正弦调制）的全场视网膜电图反应（ERG），探索rd10视网膜的功能特性。对不同年龄段的动物进行ERG追踪，并将rd10的反应与年龄匹配的野生型动物的反应进行比较。

早在P14到P28时，rd10小鼠就可以记录到ERG反应。在那个年龄之后，反应变得迟缓，最终无法察觉。由于rd10中的视网膜变性从中央视网膜开始，向周边发展，并且考虑到全视野ERG的主要贡献源于周边，因此在变性的很晚阶段可能检测到残余ERG反应。

P18和P26岁的野生型和rd10小鼠对微弱、中等和明亮闪光的平均反应如图所示图11与野生型相比，突变体的a波和b波都延迟、较慢且减小。此外，反应幅度随着rd10小鼠年龄的增长而降低。所有这些特征都可能归因于P20和P25之间最大程度的退化，主要影响视杆，从而导致大量ERG反应的视觉细胞数量显著减少；据推测，单个视觉细胞的贡献也改变了动力学。因此，预计a波和b波都会变慢并缩小，从而降低rd10视网膜对光的整体敏感性。

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暗视条件下rd10小鼠（P18：蓝线；P26：红线）和P25野生型小鼠（黑线）对三种不同光的闪光反应。（Φ=光异构化棒−1每次闪光；尺寸：Φ=40；中间：Φ=15000；光亮：Φ=38000）。

暗视ERG b波峰值的振幅和时间绘制为图12作为P26野生型小鼠和P18和P26 rd10突变体闪光强度的函数。对于所使用的所有强度，突变体的响应幅度都小于野生型小鼠的响应幅度。相比之下，对照组和rd10组小鼠的峰值时间差异在微弱闪光反应中显著，但在明亮刺激中消失。对这一发现的一个可能解释是，在目前的实验条件下，明亮的闪光可能也会引起锥体的反应，尤其是当大多数杆已经退化时，锥体的作用可能会变得很大。形态学发现支持了这种可能性，即在P20至P28岁之间，当视网膜变性已经影响到大部分视杆时，rd10视网膜中的视锥仍然基本上没有受到影响。

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暗视ERG b波分量的振幅和达到峰值的时间，绘制为刺激强度的函数。图示为：P25 wt小鼠（黑线；n=8）；P18 rd10小鼠（蓝线；n=5）；P26 rd10小鼠（红线；n=5）。数据采用单因素方差分析（*P<0.05；**P<0.001）。

对短暂闪光的反应而记录的ERG的a波已被广泛用于定量评估健康和疾病中的视杆感光器功能(Breton等人，1994年). 在本研究中，将a波的前缘拟合到杆状G蛋白转导级联的激活阶段模型(兰姆和普格1992)根据方程：F（t）=exp[−1/2ΦA（t−t效率)2]式中，F（t）是归一化为暗值的循环电流的分数，A是放大系数，单位为s−2/Φ表示为级联级的增益参数和t效率包括响应和仪器中包含的任何延迟。参数A（定义为放大因子）与分析棒的rd10响应特别相关，因为它将光转导激活步骤中涉及的三个不同参数集中在一起，其中两个与PDE激活有关。分析结果总结如下图13在A和B中，比较了野生型动物对闪光强度增加的A波反应和rd10小鼠的反应。通过拟合a波的前缘，得到了叠加在响应轨迹上的虚线，从而得到了a波的两个参数，即放大参数（a）和有效延迟（t效率)，如所示图14可以观察到，rd10小鼠的反应中放大因子严重降低，总延迟显著增加。

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wt小鼠（A）和P21 rd10小鼠（B）的记录归一化为饱和A波反应。叠加在响应轨迹上的红色虚线是根据方法中报告的方程拟合a波前缘得到的。刺激强度为Φ=2.400；15.000; 38.000; 体重为143.000的动物；Φ=2.400；15.000; 对于rd10小鼠为38.000。

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a波两个参数的平均值：放大参数（a）和有效延迟（t）效率)，在15.000光异构化棒处测量−1对wt和rd10小鼠的5只动物进行了测量。（**P＜0.001）。棒材为S.E.M。

通过使用由平均亮度在时间频率范围内的正弦调制组成的光刺激，进一步评估ERG反应的动力学。这种方法特别适用于分析主要反映ON-bipolar细胞突触后活动的b波动力学。对正弦刺激的响应实际上是一种复合响应，其单个成分在电极上独立添加，但ON-偶极的贡献是显著的。在图15平均亮度正弦调制的响应幅度绘制为刺激物时间频率的函数（衰减特性）。看来，尽管野生型和rd10小鼠对低频刺激（高达1Hz）的反应相似，但对rd10 1-10 Hz范围内的刺激频率的反应明显小于对照组。对衰减特性的检查也表明，rd10的总体趋势令人联想到低通滤波，而在野生型中，它们更类似于带通滤波器。

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正弦ERG。蓝线和红线分别指年龄为P18和P26的rd10小鼠。黑线表示体重，年龄匹配的动物。灰色线条代表正弦光刺激。

左面板：正弦ERG对4种不同时间频率的响应。

右侧面板：使用时间正弦调制的光刺激，从P18（A；n=8）和P26（B；n=9）年龄段的rd10小鼠和年龄匹配的wt小鼠（n=8，黑线）获得ERG反应的动力学分析，从0.3到30 Hz。作为刺激的时间频率（衰减特性）的函数绘制的响应幅度在2–10 Hz的频率范围内似乎受到抑制。

讨论

本文对最近分离出的一株自发突变小鼠的一般视网膜组织进行了后续研究，有望成为研究人类视网膜色素变性生物学的优秀模型。在rd10小鼠中，杆状体在P20和P25之间最大程度退化，呈明显的中心-边缘梯度。锥体的次生退化以较慢的速度平行进行；异常锥体细胞的分散分布至少持续到9个月大。这些发现与之前基于该突变体的研究一致，并显著扩展了这些研究(Chang等人，2002年;Otani等人，2004年).

与其他视网膜变性模型一样（Chang等人，1993年；雷姆等人，1998年)rd10小鼠光感受器的死亡显示出凋亡的特征：onl的细胞核呈强嗜酸性，并用Tunel和Fluoro-Jade方法染色；其中一些表达一种活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。视网膜中的凋亡标志物以中心到边缘的梯度出现。

本文主要关注影响视网膜内细胞的次生变化。在大约一个月大的时候可以检测到它们形态的改变，在2个月大时更为普遍。大多数情况下，变化影响杆双极和水平电池。它们的树突状补体逐渐变得越来越稀少和紊乱，最终完全退化。锥形双极细胞以较慢的速度跟随。携带mGluR6受体的双极细胞中的树突状回缩之前，该标记物的免疫反应性降低，并且其移位到inl中的细胞体和双极细胞轴突。在rd10中，感光细胞在视网膜突触发生的后期开始死亡(Sharma等人，2003年)与rd1对应物相比，其消亡速度较慢：这导致二级神经元树突的正常发育。只有在广泛的光感受器死亡后，rd10双极细胞的树突才会出现回缩，可能是因为缺乏营养信息和局部线索（Leveillard等人，2003年）。

目前，已证明在rd10和rd1突变体、crx-null小鼠和其他视网膜变性啮齿类动物模型中发生了opl树突的回缩(Jones等人，2003年;Cuenca等人，2004年;Wang等人，2005年). 我们小组的初步结果表明，这也发生在人类RP中(Strettoi等人，2005年). 因此，这种形式的重塑可以被认为是光感受器死亡的次要影响的标志，与潜在的遗传缺陷和受影响的物种无关。

与在rd1突变体中观察到的情况类似，rd10视网膜中出现的双极细胞和水平细胞的形态学变化伴随着它们的死亡：在感光细胞变性高峰后，杆状双极细胞与水平细胞的存活率立即下降，在接下来的几个月内缓慢下降。随后，内部结构紊乱，出现典型的玫瑰花结。其他类型的细胞，如AII和胆碱能无长突细胞，在出生后的前5个月内似乎不会受到影响。我们实验室正在对这种突变体的锥体通路和神经节细胞改变进行形态功能研究。

在活动性光感受器变性期间，尤其是P20和P30之间，以及后期，Müller细胞中GFAP上调。与大多数视网膜病理学一样，伴随着光感受器死亡并伴随着中间纤维肥大的胶质细胞反应（参见Marc等人，2003年).

总的来说，与侵袭性rd1相比，rd10突变似乎更温和，因为rd10内视网膜对重塑更具抵抗力；然而，最终，二次修饰在两个突变体中显著相似，并回忆起在光感受器疾病的其他模型中描述的改变模式（Milam等人，1998；Jones等人，2003年;Cuenca等人，2004年;Wang等人，2005年). 显然，一系列刻板印象的事件与光感受器的丢失有关。报告对rd1和rd10小鼠视网膜在不同时间发生的主要事件进行了简要比较表1.

这里描述的几个形态变化具有明显的生理相关性。正常小鼠和rd10小鼠闪光ERG之间的观察差异与主要影响远端杆通路的严重损伤一致。假设产生a波的电场与光抑制暗电流成正比(Breton等人，1994年)，目前的数据表明rd10棒中的暗电流减小。P20和P30之间的rd10突变体中发生的功能性杆的缺失在很大程度上导致了标准化最大a波的急剧减少。然而，正如放大因子分析所证实的那样，这也可能表明残余杆的反应性随之而来的降低，这在rd10小鼠中显著降低。这些观察结果与rd10突变体中的一个或多个激活步骤（有助于放大参数（A））的增益降低的想法一致。考虑到rd10突变的性质，似乎可以假设电极特异性PDE的催化活性降低。饱和率的降低值强化了这一概念。

通过使用平均亮度的正弦调制获得的ERG测量证实并扩展了闪光ERG的结果。rd10的衰减特征与正常小鼠在低频和高频时的衰减特征相匹配，但在中频和高频时要小得多，这一观察可能表明，即使在退行性过程的早期阶段，双极神经元也显示出损伤迹象。这个想法是基于之前对猫的研究，其中各种ERG成分是通过药理学方法分离出来的。已经表明，PIII（感光元件）的衰减特性符合低通滤波，而被认为反映双极神经元激活的PII表现为带通滤波器(Gargini等人，1999年). 如单细胞电生理实验所示，目前的结果与双极细胞中的杆退化与功能改变有关的观点一致(Varela等人，2003年).

值得注意的是，b波的形状和相对振幅的变化早在P18就被检测到；在这个年龄段，视网膜内部没有发生重大的形态学改变。只有感光细胞的主动变性是明显的。因此，ERG在b波中发生变化先于视网膜内部主要形态异常的检测早在opl树突广泛丢失之前就已发生。杆-杆双极细胞突触通讯效率的改变可以解释使用正弦刺激在ERG中发现的变化。最有可能的是，在大约一个月大时通过免疫细胞化学检测到的mGluR6的净减少在几天前开始逐渐减少，尽管免疫细胞化学方法无法揭示。这种减少可能导致双极细胞对感光细胞释放的谷氨酸的敏感性降低，最终导致此处报告的ERG b波的变化。显然，这里没有检测到的其他分子，包括双极细胞树突状结构中的离子通道或第二信使，可能对视网膜外层的通讯至关重要(Vardi等人，2002年)，也已丢失。这里报告的b波变化是视网膜透视衰退的最早迹象之一，这一信息本身似乎是相关的：这些变化可能对及时诊断该疾病很重要，从而证实了ERG评估对RP识别的重要性(Fleischhauer等人，2005年).

rd1小鼠中同一PDE基因突变的不同突变导致较慢和较温和的表型，这一事实证明了决定病理结果的关键因素：较慢的表型可能是由感光细胞延迟死亡引起的。至于pde6b基因的其他突变(Hart等人，2005年)，错义rd10突变确保了残留PDE活性的保留。因此，可以想象cGMP积累和钙升高都与PDE缺陷有关(Bowes等人，1989年,1990)在较长的时间间隔内达到毒性水平。此外，在突变的感光细胞中发生的代谢超载，通过主动泵送挤出多余的钙，在rd10视网膜中可能不太强烈。因此，与rd1相比，光感受器死亡开始较晚，持续时间更长。

总的来说，rd10突变体是人类典型RP的良好模型，代表了救援研究的良好背景。事实上，rd10小鼠已经被用于干细胞移植和药物治疗(Otani等人，2004年;雷克斯等人，2004年).

本研究的一个重要迹象是，鉴于rd10突变体的视网膜内部次级事件的发生相对较慢，因此使用该模型测试恢复策略具有重要意义之后杆端变性；这将更接近人类的情况，因为通常在大部分感光细胞已经退化的情况下设想对人类患者进行干预。

​

表2

rd1和rd10突变小鼠视网膜主要变化随时间变化的定性比较。数据来自本文和文本中引用的参考文献。

小鼠菌株突变和遗传退化特征杆退化开始可记录ERG响应mGluR6分布的变化杆状双极细胞的树突状回缩棒双极和水平细胞死亡的发生锥体双极细胞的树突状回缩
第1版杆特异性PDE（β亚单位）无感觉

常染色体隐性		棒-锥

中心到边缘梯度		第8页第14页至第16页第18页-第10页-
（可能生长停滞）		对
（数据仅适用于P90）		P30后可检测
第10行杆特异性PDE（β亚单位）错觉

常染色体隐性		棒锥

中心到边缘梯度		第18页第14页至第28页第25页-第25页-
（完全发育的枝晶退化）		对
（第45至7个月的数据）		P60后检测最佳

致谢

作者感谢N.Hawes博士和B.Chang博士为创始人rd10小鼠提供的礼物，感谢L.Cervetto教授和L.Galli-Resta博士批判性地阅读手稿，感谢A.Asta博士和E.Novelli博士为GC提供的技术支持。Cappagli和C.Orsini寻求计算机帮助。由国家自然资源委员会资助，国家卫生研究院向ES拨款R01-EY12654，向CG拨款MIUR 2006。

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