转座子的核心成分SecY或Sec61α有十个跨膜（TM1–TM10）、六个细胞质（C1–C6）和五个周质/管腔（P1–P5）区域5（请参见补充图1). SecY的氨基端（TM1–TM5）和羧基端（TM6–TM10）半体组装成一个伪对称结构，其内部有一个沙漏形通道，通过“塞”螺旋从周质侧把门4转座子还有一个侧门，前蛋白的信号肽可以通过它进入通道启动移位过程，而膜蛋白的疏水段可以进入脂质相以建立跨膜结构。尽管报告了詹纳西伊先生SecYEβ结构处于封闭、静止状态，在单个异源三聚体内形成的通道确实介导易位6-8然而，全功能转座子可能需要SecY（Sec61）复合物的齐聚9，为细胞质伴侣（如核糖体）提供结合平台10,11和SecA12)或形成更大的通道13在大肠杆菌SecYEG–SecA系统12SecYEG的一个拷贝为SecA提供了一个对接位置，而另一个拷贝则用作一个易位孔。SecA公司2,三,5与SecYEG互动14，部分激活其ATP酶15（“膜ATP酶”），在活跃的、持续的易位过程中，前蛋白（“转运ATP酶”。SecY的C4和C5区域（参见补充图1)对激活SecA至关重要5,16,17，含有与SecA的ATP酶域接触的残基12,18虽然SecA被认为通过大的构象变化发挥作用19，其功能性低聚物状态9,20（请参见补充讨论)以及运动功能的分子细节仍然难以捉摸。我们选择从嗜热菌21包括SecA的晶体结构测定20以及本报告主题SecYE。
初始晶体嗜热杆菌SecYE显示分辨率极限为~6 Au。当SecYE与针对嗜热杆菌秒。用多重反常色散（MAD）法测定了晶体结构，其中SecYE被硒代蛋氨酸标记(补充表1). 精细模型的分辨率为3.2º，包括Fab、SecY和SecE的大部分残留物(). 电子密度图显示了这些成分的大多数氨基酸侧链(补充图2). SecYE的总体架构与詹纳西伊先生SecYEβ4(补充图3)因为它有一个倒置的、伪对称的跨膜螺旋排列，一个带有“孔环”收缩的沙漏形导管(补充图2b)和一个螺旋塞。胞质C4–C5环，SecA和核糖体与之结合4,10-12,18，突出于膜包埋区。Fab与SecY C5环中高度保守的Ile 347–Phe 359片段紧密结合(补充图4a).
的总体结构嗜热TSecYE公司a、 b、，从侧门侧看SecYE综合体(一)和细胞质(b条). SecY跨膜从N到C末端为浅蓝色到红色，SecE为粉红色。参数351（参考。17)为红色，以杆表示形式显示。将棒状图中呈绿色的残基突变为半胱氨酸，用于分子间交联实验。
尽管总体相似，但与詹纳西伊先生SecYEβ揭示了它们的C末端半部分占据不同的构象(补充图3和5). TM1–TM5和TM6–TM10的Cα均方根偏差分别为1.36º和2.85º。TM6、TM8和TM9嗜热杆菌SecYE显示，与詹纳西伊先生SecYEβ，在前者的侧浇口区域扩大TM2–TM8距离（如箭头所示补充图5b). TM6和TM8分别倾斜约25°和约10°，TM9显示了向通道外围的平移运动(补充图5c). 将SecYE结构与大肠杆菌SecY结构10,22(补充图6). 改变的跨膜排列产生了一个~6×15Å的疏水性裂纹，由TM2、TM7和TM8的细胞质片段形成(和补充图7). 带有外露裂纹的SecYE可能代表我们称之为“预开放”的易位锁的另一种构造，与之相反，或将其与闭合状态区分开来詹纳西伊先生SecYEβ。
比较嗜热杆菌SecYE和詹纳西伊先生SecYEβ结构a、 b、，SecYE的分子表面(一)和SecYEβ(b条)，颜色如.对跨膜区域进行编号。c、 日期：，SecY的TM2、TM8和TM9的细胞质区域。预打开(c（c）Fab–SecYE的晶体结构）和闭合形式(d日，无Fab，分子动力学分析（72.93 ns）。数字表示α碳之间的距离。e（电子），通过定量羧甲基化评估SecY中分子内二硫键的形成。三次分析的平均值用s.d表示。（f），SecA介导的在AMP-PNP存在下对SecY（Thr92Cys–Val329Cys）分子内二硫键形成的抑制。
要解决以下问题：嗜热杆菌SecY在预开态和闭合态之间经历构象转换，我们进行了分子动力学模拟(补充讨论). 在100-ns模拟期间，SecYE经历了巨大的构象变化，其中TM8和TM9从开放状态向闭合状态移动(补充图8和补充电影1和2). 无抗体SecYE的低分辨率晶体结构(补充表1和补充讨论)随着TM8的摆动和弯曲，也显示出向封闭形式发展的趋势(补充图9). 综上所述，封闭形式似乎代表了在没有任何相互作用成分的情况下，能量上受欢迎的SecYE基态。反过来，可以想象，预开放形式是由抗体结合和可能由生理配体SecA的结合诱导的构象亚状态。
嗜热杆菌SecA与C5中相同的（Pro-Gly-Ile-Arg-Pro-Gly）基序结合（参见)作为Fab(补充图4a)，它抑制了在体外易位子的易位活性(补充图4b). 通过放置在六对不同位置的半胱氨酸之间的分子内二硫键形成来研究SecYE跨膜段的排列()通过还原性和非还原性羧甲基化进行评估。这些数据表明，SecY（Thr92Cys–Ala328Cys）、SecY（Thr92Cys-Tr329Cys）和SecY（Tr327Cys–Val368Cys(). 92–328和92–329连锁表明，分离的SecYE主要呈闭合构象，而不是预开放构象(). SecA减少了膜包埋SecYE中92–329二硫键的形成(和补充图10). 这与SecA促进SecYE从封闭状态到预开放状态的构象转换的概念是一致的。TM8的摆动可能通过疏水裂纹的暴露启动通道闸门的打开(和补充图3). 裂纹包含一些进化上保守的疏水残基（Ile85、Pro273、Phe276、Ala277、Phe322和Tyr326）(补充图2a、7和11a)我们的突变研究表明其在功能上很重要(补充讨论和补充图11b、c). 考虑到信号肽接触TM2、TM7和TM8的观察结果23，很容易推测裂纹参与了SecA信号肽的接收。
接触残留物嗜热杆菌SecA和SecYE一，SecA结构（蛋白质数据库2IPC）为其结构域的彩色编码30，但浅粉红色表示SecA-特定区域。本研究中发现的SecY接触残留物以绿色和紫色填充。b条，模体IV中α-螺旋的特写图；进化上保守的区域用红色表示，被半胱氨酸取代的位置用棒状表示。c（c），SecA和SecY之间的二硫化物交联。二硫络合物用实心圆表示。d、 e、，SecA和SecY的二硫化物和BMOE交联。
SecA包含两个核苷酸结合折叠（NBFs；也称为NBD）、一个前蛋白交联域（PPXD）和C末端易位域（HWD和IRA1），它们都由长α螺旋支架域（HSD）连接(顶部面板和补充图12). 要识别嗜热杆菌与SecY的C4–C5细胞质域接触的SecA残基（参考文献12,18)，我们将单个半胱氨酸引入SecA的选定位置(补充图12). 我们首先在NBF1表面上突变残基，因为NBF1已被证明与SecY的物理接近（参考文献。12). 单半胱氨酸也被引入SecY位置259、341和352(和)用于检查分子间二硫键的形成(,补充图13和补充讨论). SecA（Pro202Cys）–SecY（Ala259Cys）和SecA（Leu775Cys）-SecY（Pro352Cys）两种组合在氧化过程中形成了二硫键(，通道1和7），其中SecYE必须是蛋白质脂质体整合的(补充图13a、c，车道9和15). 因此，残留物775(，紫色）和202(，绿色）分别与SecY的C5和C4残基相邻（参见补充讨论，补充图13和参考。12关于涉及SecA的分子相互作用的特异性）。
假设202的SecA和259的SecY以及775的SecA与352的SecY同时发生分子接触，则SecY的两个细胞质突起必须位于SecA的NBF1和C末端易位域之间(). 然而，SecA原单体结构在该区域缺乏足够大的开口(，箭头），增加了SecY相关形式SecA发生构象变化的可能性。我们发现一个进化上保守的(补充图14)地区(180Gly-Phe-Asp-Tyr-Leu-Arg-Glu-Gln-Met188)对应于基序IV的C端半24()与SecY互动。虽然引入天然SecA基序IV位置的半胱氨酸不容易通过疏水修饰剂进行烷基化(补充图15和补充讨论)它们与SecY的C5处的特定半胱氨酸形成二硫键或双-马来酰亚胺乙烷（BMOE；臂长8º）介导的交联(和补充图16). 因此，与转座子的相互作用导致分子表面的残基182、185、186和188暴露(补充讨论). 基序IV区域确实经历了构象变化，与马达-转换子复合物的形成相协调。
SecA的ATP酶通过ATP酶和IRA1结构域之间的相互作用在静息状态下（内源性ATP酶）被紧密下调25(). 我们观察到，与转座子的结合在物理上分离了NBF1和IRA1，这很好地解释了转座子介导的膜ATP酶的触发。基序IV片段与反平行β-片通信，该β-片参与前蛋白结合信号到ATP酶结构域的传播26(). 模体IV的表面暴露和转座子相互作用可能调节SecA功能，不仅是通过远离IRA1，还通过使β-表进一步激活ATP酶，以响应前蛋白结合（转位ATP酶）。
SecA至少以两种不同的模式与SecY交互18：一个涉及SecY C4–C5结构域的结构域可能是ATP酶激活所必需的，而另一个涉及C6的结构域则伴随着实际的SecA驱动的易位。我们在本研究中确定的SecA–SecY界面似乎与第一种交互模式相对应。根据参考文献SecY二聚体模型。12，SecY的非转移拷贝需要必需的Arg 357残基17我们在这里观察到的SecA–SecY相互作用直接涉及Arg 351（对应于大肠杆菌SecY Arg 357），可能对应于涉及非转移SecY拷贝的(). 鉴于SecA与转座子结合的第二种模式的出现，易位的SecY拷贝也应该与SecA相互作用。
SecA–SecY交互的多种模式根据二聚体模型12，SecY的一个拷贝用作SecA-对接位点，另一个充当易位孔。此处观察到的SecA–SecY相互作用应该代表SecY和SecA的非转移拷贝之间的相互作用，并且对于SecA ATP酶的激活至关重要。SecA和SecY组分在相互作用时都会发生构象变化，如双向箭头所示。SecY原聚体在二聚体中的取向是任意显示的。
Fab片段或SecA与SecY细胞质区域的结合似乎诱导了转座子的前开放状态。开放可能发生在SecY的两个拷贝中，并在信号肽-SecA复合体的初始接收中起作用，随后可能在转座子内进一步传播构象变化(). 预开放对SecA ATP酶的激活也很重要(). 我们关于易位和易位驱动运动发生协同构象变化的建议应该通过与结合的前蛋白底物的SecA-易位复合物的结构测定来证实。
