公共科学图书馆一号。2008; 3（12）：e3898。
环磷酰胺诱导的膀胱炎增加膀胱CXCR4表达和CXCR4-巨噬细胞迁移抑制因子相关性
,1,2,* ,三 ,1,2和1,4
佩德罗·维拉
1美国佛罗里达州Bay Pines VA Healthcare System，Research&Development（151）
2美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学医学院外科
肯尼思·伊茨科夫斯基
三美国科罗拉多州奥罗拉科罗拉多丹佛大学前列腺癌研究实验室
王西海（Xihai Wang）
1美国佛罗里达州Bay Pines VA Healthcare System，Research&Development（151）
2美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学医学院外科
凯瑟琳·梅耶·西格勒
1美国佛罗里达州Bay Pines VA Healthcare System，Research&Development（151）
4美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学医学院分子医学系
Patricia Bozza，编辑器
1弗吉尼亚州Bay Pines医疗保健系统，研发（151），美国佛罗里达州Bay Pines
2美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学医学院外科
三美国科罗拉多州奥罗拉科罗拉多丹佛大学前列腺癌研究实验室
4美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学医学院分子医学系
巴西奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所和FIOCRUZ
构思并设计了实验：PLV KLMS。执行实验：PLV XW KLMS。分析数据：PLV KAI XW KLMS。贡献的试剂/材料/分析工具：PLV KLMS。撰写论文：PLV KAI XW KLMS。
收稿日期：2008年8月11日；2008年11月15日接受。
版权这是一篇根据知识共享公共领域声明条款发布的开放存取文章，该声明规定，一旦将本作品置于公共领域，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传播、修改、构建或以其他方式使用本作品。 这是一篇根据知识共享公共领域声明条款发布的开放存取文章，该声明规定，一旦将本作品置于公共领域，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传播、修改、构建或以其他方式使用本作品。
摘要
背景
巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种与膀胱炎有关的促炎细胞因子，也是体外趋化因子受体CXCR4的非同源配体。我们研究了CXCR4-MIF是否与大鼠膀胱发生关联以及实验性膀胱炎的影响。
方法和发现
20只雄性大鼠接受生理盐水或环磷酰胺（40 mg/kg；i.p.；每3只第个天）诱发持续性膀胱炎。八天后，收集尿液并在麻醉下切除膀胱。用免疫组化方法检测膀胱CXCR4和CXCR4-MIF的共定位。ELISA测定MIF和基质衍生因子-1（SDF-1；CXCR4的同源配体）水平。检测膀胱CXCR4表达（实时RTC-PCR）和蛋白质水平（Western blotting）。共免疫沉淀研究了MIF-CXCR4的相关性。含CXCR4的盐处理大鼠尿路上皮基底细胞和中间细胞（但非浅层）与MIF共定位。环磷酰胺治疗引起：1）CXCR4免疫染色显著重新分布到所有尿路上皮层（尤其是浅表细胞的顶端表面），并增加膀胱CXCR4的表达；2） 尿MIF升高，膀胱MIF降低；3） 膀胱SDF-1增加；4） 增加了CXCR4-MIF关联。
结论
这些数据表明CXCR4-MIF相关性在大鼠膀胱内发生，在实验性膀胱炎中增加。因此，CXCR4代表了MIF介导的膀胱炎症信号转导的替代途径。在膀胱中，MIF可能与SDF-1（同源配体）竞争，以激活CXCR4介导的信号转导。
介绍
巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种普遍存在的多效性细胞因子，参与细胞增殖和炎症[1],[2]MIF在炎症中起着重要而独特的作用，因为MIF位于其他促炎症介质的上游，可以对抗糖皮质激素的抗炎作用[2]MIF与炎症疾病的动物模型有关，包括关节炎、肾小球肾炎、急性肺损伤和脓毒症[3]).
我们最近的实验证据表明，MIF参与膀胱炎症，因为：（1）MIF在尿路上皮中组成性表达[4],[5]; （2） 不同动物实验性膀胱炎模型中膀胱MIF表达上调[6],[7]; （3） 实验性膀胱炎时，MIF从膀胱释放[6],[8],[9]和人类尿路感染[10]最后，（4）用膀胱内抗体中和MIF可降低实验性膀胱炎症[7]因此，根据我们的实验观察，我们关于MIF在膀胱炎症中的促炎作用的假设与MIF在几种疾病模型（如关节炎、克罗恩病）中的促炎作用非常一致，在这些疾病模型中，用中和MIF抗体治疗可减少炎症[11],[12].
MIF的行动机制尚未完全确定，仍然是一个活跃的调查领域。MIF可能通过结合细胞内JAB1发挥自分泌作用[13]以及与细胞表面受体结合的旁分泌效应[14]直到最近，MIF和细胞表面CD74之间的复合物形成是MIF受体相互作用的唯一描述机制[15]CD74是主要组织相容性II类（MHC-II）复合物的一部分；然而，在与MHC-II无关的细胞表面可以发现少量CD74[16].MIF与细胞表面CD74结合[15]然后MIF-CD74复合物通过与另一种细胞表面受体CD44结合来激活信号转导[14]我们发现，在大鼠实验性炎症后，尿路上皮中的MIF、CD44和CD74均上调[6],[17]因此，在膀胱炎症期间，MIF激活的信号转导发生时，所有成分都到位。
然而，最近在T细胞中发现MIF与趋化因子受体CXCR2和CXCR4之间的一种新的功能关联[18]趋化因子是将白细胞运输到炎症或损伤部位的小蛋白质[19]CXCR4是基质细胞衍生因子-1（SDF-1/CXCL12）的G蛋白偶联受体。虽然趋化因子通常表现出高度的受体混杂，但CXCR4（直到最近）被认为只与SDF-1结合[19]然而，MIF与公认的CXCR4配体（SDF-1/CXCL12）竞争与CXCR4的结合[18].
CXCR4由正常尿路上皮表达，可能与膀胱癌有关[20],[21]因此，我们假设CXCR4-MIF复合物也可能发生在膀胱中（如体外所述[18]). 除了已经描述的MIF-CD74关联外，如果存在这种关联，则表明膀胱炎期间MIF的另一个可能受体靶点[15].
本研究的目的是确定MIF和膀胱CXCR4受体之间是否存在关联。因此，我们检测了：1）细胞因子受体CXCR4在大鼠膀胱中的位置；2） 膀胱基线SDF-1水平（CXCR4同源配体）和对化学诱导（环磷酰胺；CYP）膀胱炎症模型的反应变化；3） CYP诱导性膀胱炎后CXCR4表达发生变化，4）CYP诱发性膀胱病前后膀胱中CXCR4和MIF的相关性。
我们的结果表明，CXCR4和SDF-1在正常大鼠膀胱中组成性表达，并在CYP诱导的膀胱炎期间上调。使用双重免疫组织化学，我们发现MIF和CXCR4在尿路上皮的同一细胞内共定位，共免疫沉淀研究表明MIF-CXCR4在膀胱中存在关联。在CYP诱导的膀胱炎期间，MIF-CXCR4相关性增加。
结果
环磷酰胺致膀胱炎症
重复测量的方差分析显示，生理盐水和CYP治疗组大鼠的体重存在差异，早在第3天，CYP处理组大鼠体重显著下降，并在整个实验期间持续下降（第8天；)但保持在10%的减肥阈值以下，这是一个协议终点。
表1
环磷酰胺对体重的影响（g）
| 治疗 | 第0天 | 第3天 | 第6天 | 第8天 |
| 盐分（N=10） | 321±2.6克 | 322±2.8 | 326±3.5 | 326±3.6 |
| CYP（N=10） | 320±3.6 | 303±2.5***
| 300±3.0***
| 295±3.0***
|
与我们之前对雄性Sprague-Dawley大鼠的研究结果一致[6]，多次注射CYP（连续8天，每三天注射40 mg/kg，低于雌性Wistar大鼠的有效剂量；75 mg/kg[22])诱发膀胱炎症。然而，在任何经CYP治疗的大鼠中均未观察到出血性膀胱炎。在解剖显微镜下对膀胱进行的大体检查显示，所有CYP治疗大鼠的腹腔表面都有损伤，但没有一只接受过盐治疗的大鼠出现损伤。盐水处理大鼠的H&E切片显示膀胱形态正常(;B） ●●●●。另一方面，CYP治疗的大鼠表现出明显的炎症迹象，包括粘膜下水肿、尿路上皮破坏、细胞浸润、出血和成纤维细胞增殖(). 而盐水处理大鼠的尿路上皮表现出典型的三层外观()，CYP治疗大鼠出现增生().
环磷酰胺（CYP）治疗对膀胱组织学、膀胱和尿液MIF水平的影响。用H&E染色的膀胱石蜡切片显示出正常的形态，如A、B所示。然而，CYP治疗引起了显著的水肿和慢性炎症（C、D），一些膀胱有急性炎症细胞。C、D中的星号表示水肿区域和大量细胞浸润。还观察到尿路上皮增生。此外，CYP治疗增加了尿MIF水平（E；*=p<0.05），而CYP处理增加了膀胱MIF水平。校准棒：1A，1C=500µm；1B，1D=100µm。
与盐水治疗相比，CYP治疗增加了尿MIF水平（通过ELISA测定；; 生理盐水组和CYP组分别为22.2±2.8和57.3±20.5；p＜0.0464），同时降低膀胱MIF水平(; 生理盐水和CYP治疗中的244.1±39.7 vs 136.0±38.1 ng MIF/mg蛋白质；p=.002），证实了我们最近的观察结果[6]循环MIF是MIF的重要来源[9]在检查MIF的器官水平时，可能会出现混淆。本研究开发的MIF ELISA无法检测血清MIF。因此，我们目前的研究结果表明，MIF的组织水平（或释放）发生了变化，而膀胱或尿液中没有血液/血清MIF的混杂存在。
尿路上皮CXCR4免疫染色：与MIF共定位及环磷酰胺治疗效果
使用标准的免疫过氧化物酶方案，在盐处理大鼠的尿路上皮中观察到中度到强的CXCR4免疫染色，位于基底层和中间层，但不在浅层细胞中(). 然而，CYP治疗后，CXCR4免疫染色出现局部重新分布，浅表细胞（尤其是其顶端）显示中度斑片状染色()而基底细胞和中间细胞的染色强度似乎降低。总体尿路上皮染色强度评分（由盲法观察者评定）表明，环磷酰胺治疗组大鼠的中位数评分（1+0.75）低于盐水治疗组（3+1；p=0.0172；Wilcoxon秩和检验）。免疫染色强度的计算机分析表明，CYP治疗后基底细胞和中间细胞染色减少（生理盐水=127.4+8.57；环磷酰胺=77.2+12.08；p=0.0011），从而证实CXCR4免疫染色的重新分布。
盐处理（A；B）和CYP处理（C，D）大鼠尿路上皮中代表性CXCR4免疫染色。生理盐水处理大鼠（A；B）尿路上皮的基底细胞和中间细胞中可见中度到强的CXCR4免疫染色，浅层细胞中几乎没有染色（B；箭头）。在CYP治疗的大鼠中，CXCR4免疫染色有显著的重新分布，基底细胞和中间细胞染色（C；D）减少，而表面细胞出现染色，顶端区域出现中度染色（D；箭头）。校准棒：2A，2C=200µm；2B；2D=50µm。
我们使用双重免疫荧光检测了CXCR4和MIF在尿路上皮中的共同定位。显示了每组的代表性膀胱切片，MIF（FITC色）、CXCR4（TRITC色）免疫染色，以及这两个面板的重叠（橙色表示共同定位；蓝色表示DAPI核染色）。在盐水处理的大鼠中，MIF和CXCR4都可以定位在尿路上皮的基底层和中间层（但不能定位在浅表细胞中）(). CYP治疗后，MIF和CXCR4很容易定位于整个尿路上皮()甚至在以前没有MIF或CXCR4的浅表细胞上（如箭头所示).
尿路上皮CXCR4和MIF的共放大。显示了用生理盐水（A–C）或CYP（D–I）处理的大鼠的代表性切片。图中显示了MIF免疫染色（绿色免疫荧光）、CXCR4免疫染色（红色免疫荧光）和结合免疫染色和DAPI核染色的覆盖面板。MIF免疫染色见于经盐水处理的大鼠（A）的基底细胞和中间细胞以及固有层的成纤维细胞，而表面细胞没有MIF染色。箭头显示尿路上皮的管腔边缘。CXCR4仅限于尿路上皮（B）的基底细胞和中间细胞，固有层未染色。这些面板的叠加（C）表明MIF和CXCR4作为细胞的橙色共同定位。CYP治疗导致MIF（D，G）和CXCR4（E，H）的表面细胞染色，覆盖面板（F，I）在尿路上皮细胞中显示为橙色的共同定位。箭头指向表面细胞，显示MIF-CXCR4共定位。校准棒=50µm。
SDF-1免疫染色。A） 皮肤角质形成细胞（箭头）和血管内皮细胞（短箭头）中观察到SDF-1免疫染色。B） 初级抗血清的省略消除了免疫染色。C） 膀胱切片未显示SDF-1免疫染色。校准棒=50µm。
环磷酰胺增加膀胱SDF-1水平
我们使用ELISA测定了CXCR4的同源配体SDF-1的膀胱水平。生理盐水（4.4±1.0）和CYP处理的膀胱（7.6±0.7 ng SDF-1/mg蛋白质；p<0.05）SDF-1水平存在显著差异。脾脏和皮肤被检测为阳性对照，并显示脾脏中SDF-1的量与膀胱中发现的SDF-1的量相当（7.94ng SDF-1/mg蛋白质）。另一方面，皮肤中SDF-1的含量较高（16.04纳克SDF-1/mg蛋白质），分别约为生理盐水和CYP处理膀胱中SDF-2含量的四倍和两倍。
SDF-1免疫荧光在皮肤角质形成细胞和皮肤血管内皮细胞中很容易观察到()如前所述[23]然而，膀胱中未检测到SDF-1免疫染色()或脾脏（未显示）。
环磷酰胺上调膀胱CXCR4表达：膀胱中MIF-CXCR4的相关性
实时PCR显示CYP治疗后膀胱CXCR4 mRNA显著上调(; ≈ 增加9倍）。另一方面，Western blotting显示，与CYP治疗组相比，生理盐水治疗组大鼠的膀胱中CXCR4蛋白水平相当().
A） 与生理盐水相比，CYP治疗的实时RT-PCR显示膀胱CXCR4显著上调（p=0.004）。B） CXCR4 Western-blotting显示，生理盐水和CYP治疗大鼠之间的CXCR4数量没有差异。GAPDH被用作加载控制。C） 共免疫沉淀研究显示CXCR4-MIF与膀胱相关。显示了一个代表性实验，其中从CXCR4抗体柱收集来自盐水和CYP处理的大鼠的膀胱的级分的MIF蛋白质印迹。用CXCR4抗血清“下拉”膀胱匀浆中的CXCR4复合物，然后用MIF Western blotting检测CXCR4-MIF复合物。“流通”是指不粘附于CXCR4抗体柱的部分（因此不含CXCR4复合物），而“抗-CXCR4”是指从CXCR4抗原柱洗脱的部分（因而含有CXCR4络合物）。大多数膀胱MIF没有粘附在CXCR4抗体柱上（“流通”），并且与CXCR4无关。然而，在经盐处理的大鼠中发现少量与CXCR4共免疫沉淀，并且这些CXCR4-MIF复合物在CYP治疗后增加（箭头所示）。密度分析显示，与生理盐水对照组相比，CYP治疗组大鼠的CXCR4-MIF复合物增加了3.5倍。
用CXCR4抗血清对膀胱匀浆中的“下拉”CXCR4蛋白复合物进行共免疫沉淀研究，然后进行MIF Western blotting，以检测膀胱匀浆内的CXCR4-MIF复合物。显示了一个具有代表性的实验，其中从CXCR4抗体柱中收集了来自生理盐水和CYP治疗大鼠膀胱部分的MIF western blotting。“流通”是指不粘附于CXCR4抗体柱的部分（因此不含CXCR4复合物），而“抗-CXCR4”是指从CXCR4抗原柱洗脱的部分（因而含有CXCR4络合物）。请注意，大多数膀胱MIF没有粘附在CXCR4抗体柱上（“流通”），并且与CXCR4无关。然而，在盐处理的大鼠中，发现少量CXCR4与CXCR4共免疫沉淀，并且这些CXCR4-MIF复合物在CYP处理后增加。密度分析显示，与生理盐水对照组相比，CYP治疗组大鼠的CXCR4-MIF复合物增加了3.5倍。
讨论
本研究的结果表明，CXCR4是一种趋化因子细胞表面受体，在正常大鼠尿路上皮中组成性表达，定位于基底细胞和中间细胞。CYP治疗（除了产生膀胱炎症和尿路上皮增生外，环磷酰胺在膀胱中的作用也很明确[24],[25])也导致膀胱CXCR4 mRNA上调，CXCR4重新分布到整个尿路上皮区域（包括之前缺乏CXCR4的浅表细胞的顶端区域；). 我们对浅表尿路上皮细胞的顶端CXCR4染色的发现与结肠上皮细胞的观察结果一致[26].
CYP治疗虽然产生CXCR4 mRNA上调（一项新发现），但并没有导致CXCR4蛋白水平升高，CXCR4免疫染色评分实际上显示CYP处理后染色强度降低。据报道，大鼠神经元中CXCR4 mRNA表达和蛋白质水平之间存在类似差异，这反映了CXCR4受体的激活、内化增加和降解[27]CXCR4受体的这种激活、内化和降解也可以解释尿路上皮中斑片状CXCR4免疫染色（尤其是浅表细胞顶面的免疫染色），并可能代表CYP诱导的CXCR4反应的焦点区域。
以前曾报道过正常人尿路上皮、膀胱癌和膀胱癌细胞系（J82和T24）中CXCR4 mRNA的表达[20]SDF-1的加入（可能激活CXCR4受体）增加了Matrigel的侵袭和细胞生长，但对这些特定尿路上皮癌细胞的细胞内钙的增加无效[20]然而，使用不同膀胱细胞系（RT-4）的其他研究人员确实报告了SDF-1刺激后细胞内钙的增加[21]总之，这些结果表明CXCR4受体在尿路上皮中具有功能。也有证据表明CXCR4 mRNA在人类泌尿生殖系统的其他区域（例如尿道、宫颈）表达[28].
我们使用ELISA检测了盐处理和CYP处理大鼠膀胱中SDF-1的蛋白质水平。我们报告了经盐处理的膀胱中SDF-1的组成水平，在CYP治疗后增加。虽然SDF-1免疫荧光在皮肤角质形成细胞中很容易检测到，但我们在膀胱（或脾脏）中通过免疫组织化学检测SDF-1失败。由于皮肤中SDF-1的水平（通过ELISA测定）大约是膀胱或脾脏中SDF-2水平的两倍，我们认为这些器官中的SDF-1水平可能低于免疫组织化学检测水平。
最近，据报道，阴道扩张后膀胱（和其他盆腔脏器）SDF-1 mRNA表达下调[29]据我们所知，我们的发现首次证明了膀胱中SDF-1蛋白水平。因此，我们的研究结果表明，CYP治疗产生的膀胱损伤导致趋化因子受体CXCR4的mRNA上调，并增加其同源配体SDF-1的蛋白水平。除了CYP治疗后膀胱中的几种细胞因子上调外[30]，另一种趋化因子（CX3CL1）及其受体（CXC3R1）的变化被描述为环磷酰胺治疗的结果[22]因此，趋化因子（除细胞因子外）可能代表膀胱损伤的重要介质和改善膀胱炎症的可能靶点。
直到最近，CXCR4还被认为只与SDF-1绑定[19]然而，最近的体外证据表明CXCR4也能结合MIF[18]在本研究中，我们证实了这些体外发现，因为我们证明了1）CXCR4和MIF在泌尿上皮中的共同定位，无论是在盐水治疗的大鼠还是在CYP治疗后；2） CXCR4-MIF相关性存在于经盐处理的膀胱中，并且在CYP治疗后增加。因此，尽管在本研究中没有直接测试，但我们的结果表明，膀胱中的MIF可能通过与尿路上皮中的CXCR4结合而参与膀胱炎症（以前认为仅与SDF-1结合，但最近显示也与MIF结合[18])或CD74（MIF的公认结合蛋白，在膀胱炎症中上调[6])激活导致产生其他炎性细胞因子的信号转导途径。鉴于膀胱MIF浓度约为膀胱SDF-1浓度的30倍，MIF可能是尿路上皮CXCR4受体的主要配体。此外，CYP治疗在以前缺乏CXCR4（或MIF）免疫染色的浅表尿路上皮细胞中诱导了CXCR4的免疫染色。这增加了这些细胞被尿液中的MIF激活的可能性，事实上，CYP（目前的研究）和其他炎症刺激物[8]–[10]增加管腔MIF释放。我们不能排除肾或输尿管MIF释放对本研究中观察到的CYP治疗后尿液MIF水平升高的贡献。然而，我们目前的尿液MIF-增加伴随膀胱MIF-蛋白水平降低的发现与早期的发现一致，其中，在膀胱与肾脏分离的动物中（从而消除潜在的肾脏和输尿管贡献），我们观察到类似的结果[7],[9]). 因此，根据我们的实验证据，我们认为MIF很可能在炎症期间从膀胱中预先形成的储存物释放到内腔。因此，腔MIF可能通过与至少这两种尿路上皮细胞表面受体结合而导致膀胱炎症，并提示阻断MIF或与MIF相关的细胞表面受体可能预防或改善膀胱炎症。
CXCR4和MIF-CXCR4在膀胱中的确切作用在本研究中未提及，尚待研究。然而，来自其他模型的最新证据表明，CXCR4参与膀胱炎症和损伤修复至少有两种有趣且重要的可能性。首先，CXCR4可能介导尿路上皮细胞增殖和修复。CXCR4和SDF-1也在人类肠上皮细胞中表达，最近的证据表明，它们参与损伤后的上皮修复并维持粘膜屏障的完整性[31],[32]在这个模型中，趋化因子和趋化因子受体（尤其是CXCR4/SDF-1）可能代表一个自分泌/旁分泌回路，帮助维持粘膜屏障的完整性和修复，并调节粘膜发病机制（包括炎症性肠病的慢性炎症和结肠癌的进展）[33]本研究结果表明，MIF通过与膀胱中的CXCR4受体（可能起源于尿路上皮）结合，可能在CXCR4的受体上与SDF-1竞争，参与损伤后的上皮修复。其次，CXCR4激活可能介导膀胱内的疼痛超敏反应。最近的证据清楚地表明CXCR4（和其他趋化因子受体）在背根神经节（DRG）神经元上的表达[34]此外，这些受体的激活对DRG神经元产生兴奋作用并刺激P物质的释放[34]此外，CXCR4（以及其他趋化因子受体和趋化因子）在持续性神经病啮齿类动物模型后的DRG神经元中表达[35],[36]这些受体是功能性的，因为在体外给予SDF-1后细胞内钙增加[35]因此，根据他们的发现，这些作者认为趋化因子和趋化因子受体可能是治疗慢性疼痛的重要靶点。因此，在CYP诱导的膀胱炎中，CXCR4受体的激活，无论是通过其识别的配体SDF-1（由于CYP而上调）还是由于与MIF的相互作用（由于CYP而上调，并且其数量大于SDF-1），实际上都可能导致疼痛超敏反应。在CYP诱导的膀胱炎期间，另一种趋化因子CX3CL1及其受体也已被提出类似的建议[22]。我们的结果有助于这一假设，并将其扩展到不同的趋化因子/受体系统。
总之，趋化因子受体CXCR4在大鼠尿路上皮（基底细胞和中间细胞）中组成性表达，而CYP诱导的膀胱炎症导致CXCR4的上调和浅层细胞的免疫染色（以前没有CXCR4）。其同源趋化因子配体SDF-1也被CYP治疗上调。CXCR4和MIF共同定位在尿路上皮细胞中，CYP诱导CXCR4与MIF共同分布于尿路上皮浅层细胞。免疫沉淀显示CXCR4与膀胱MIF之间存在关联。因此，我们的结果表明CXCR4作为尿路上皮细胞中MIF的受体，可能参与MIF介导的膀胱炎症。因此，研究CXCR4受体的MIF激活与CD74受体MIF激活之间的差异，可能会为MIF在膀胱和可能的其他部位介导效应的实际机制提供见解。
方法
所有实验均在获得机构动物护理和使用委员会的全面批准后进行，并符合NIH动物实验指南。使用最近发表的一项方案产生膀胱炎症，即对雄性Sprague-Dawley大鼠给予减少剂量的环磷酰胺（CYP），以避免严重的体重减轻和死亡[6].
环磷酰胺性膀胱炎
雄性Sprague-Dawley大鼠（N=20；250–300克；美国印第安纳州哈兰市）用氟烷麻醉，每三天接受一次生理盐水（溶媒对照组；0.1 ml/100 g体重；静脉注射；N=10）或环磷酰胺（CYP；美国密苏里州圣路易斯市西格玛；生理盐水；40 mg/kg；0.1 ml/100 g体重；腹腔注射；N=10）诱导膀胱炎[6]在注射当天，还向每只大鼠施用盐酸丁丙诺啡（0.03mg/kg；皮下注射；美国弗吉尼亚州里士满利洁时制药公司）。首次注射后8天，10只大鼠（5=生理盐水；5=CYP）用戊巴比妥钠（60 mg/kg；i.p.；Ovation Pharmaceuticals，Deerfield，IL，USA）麻醉，然后用生理盐水灌注，随后用4%多聚甲醛灌注，收集膀胱进行组织学检查。或者，用氟烷（N=10；5=盐水；5=CYP治疗），膀胱通过腹部切口暴露，并收集尿液（使用带有32号针头的注射器）。切除膀胱并快速冷冻（−80°C）以提取蛋白质或mRNA，并对大鼠实施安乐死。
组织学和免疫组织化学
通过逼尿肌中段冠状切割甲醛固定膀胱，并将其嵌入石蜡中。石蜡切片（4µm）用苏木精和伊红染色或进行CXCR4免疫组织化学处理，如下所示：将载玻片脱蜡，并使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0；95°C，30分钟）进行抗原回收。通过在3%H中培养载玻片来阻断内源性过氧化物2O（运行）2将切片在4°C下暴露于CXCR4抗血清（1∶2000；兔多克隆；Sigma；#C3116）过夜，然后根据制造商的协议（IHC Select；Chemicon，Temecula，CA，USA）使用标准ABC反应进行处理。切片用苏木精轻微复染，盖玻片并用徕卡倒置显微镜检查。免疫染色强度由病理学家（KAI）对实验条件盲评，从0（无染色）到4（强免疫染色）。此外，使用Image J（NIH；Bethesda，MD）和专有定制插件（Colorado-Denver大学；Aurora丹佛前列腺诊断实验室）对数字图像进行CXCR4免疫染色强度分析。
将中逼尿肌冷冻（冠状）膀胱切片（12µm）同时暴露于MIF（1∶200；山羊多克隆；美国科罗拉多州利特尔顿市Novus Biological；#NB100-1789）和CXCR4抗血清（1∶2000；兔多克隆；Sigma；#C3116）。通过使用大鼠重组MIF（托里松树的礼物）和大鼠组织匀浆（数据未显示）的初步西区试验，验证了这种MIF抗体识别MIF的能力。使用与荧光素异硫氰酸盐（FITC；Jackson Immunochemicals；West Grove，PA，USA；#705-095-147）或四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC；Jackson-Imunochemisticals；#711-025-152）偶联的适当二级抗血清来观察一级抗血清。用防褪色介质（Prolong Gold with DAPI；Invitrogen；Carlsbad，CA，USA）覆盖切片，并使用配备徕卡数码相机的徕卡（Leica microsystems，Wetzlar，Germany）倒置显微镜进行检查。使用Leica软件获得MIF（绿色；FITC）、CXCR4（红色；TRITC）和DAPI核反染的叠加图片。对照组包括遗漏一种或两种初级抗血清，或遗漏一种或者两种次级抗血清。
对于SDF-1免疫组织化学，将冷冻膀胱切片暴露于SDF-1抗血清（兔多克隆；Torrey Pines Biolabs，Houston，TX，USA；TP201；1∶200；过夜4°C），并用TRITC观察。脾脏和皮肤切片作为阳性对照。
MIF和SDF-1 ELISA
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对生理盐水和CYP治疗大鼠的尿液和膀胱进行MIF和SDF-1水平的检测（仅膀胱）。还测试了MIF-ELISA检测血清MIF的能力。简单地说，在室温下用100µl一级抗体（1µg/ml；抗MIF；Abcam；Cambridge，MA，USA；#ab7207或抗SDF-1；Torrey Pines Biolabs；TP201）涂布高结合ELISA板（Microlite 2，ThermoScific，Waltham，MA，US）过夜。通过使用大鼠重组MIF（托里松树的礼物）和大鼠组织匀浆（数据未显示）的初步西区试验，验证了这种MIF抗体识别MIF的能力。在室温下，用200µl试剂稀释剂（PBS pH 7.4中的1%BSA）封闭平板1小时。使用重组大鼠MIF（Torrey Pines的礼物）或重组SDF-1（Preprotech Inc；Rocky Hill，NJ，USA）在试剂稀释剂中生成1.6至100 ng/ml的标准曲线。将样品在试剂稀释剂中稀释至适当浓度，并在两个孔中使用。用胶带覆盖板，并在室温下培养2小时。然后使用自动洗板机（ThermoScientific）用洗涤缓冲液（PBS含有0.05%吐温-20，pH值7.4）对单个微孔进行三次洗涤。以200ng/ml的最终浓度加入检测抗体（生物素化山羊抗MIF，BAF289，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA或生物素化山羊抗SDF-1，R&D Systems），用粘合剂回收板，并在室温下孵育2小时。如上所述清洗微孔，向每个微孔中添加100µl链霉亲和素-辣根过氧化物酶（在试剂稀释剂DY998、R&D Systems中稀释1∶200），并在室温下培养盖板20分钟。如上所述清洗微孔，添加100µl过氧化物酶底物（R&D；DY999），并使用平板读取器读取每个微孔（Biotek，Winooski，VT，USA）。使用线性回归和插值计算的样品浓度创建标准曲线（PRISM 4.02，GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）。MIF和SDF-1的板间和板内变异系数分别为15.3%和18%和7.2%（板内和板间）。膀胱MIF和SDF-1水平表示为样本中存在的蛋白质量（BCA、Thermo Scientific）。尿肌酐采用商用分析法（Exocell，Philadelphia，PA，USA）测定，并根据制造商的方案进行。尿液MIF水平归一化为样本中的尿肌酐水平。
膀胱CXCR4 mRNA表达、Western blotting和CXCR4-MIF联合免疫沉淀
使用Trizol（Invitrogen）和CXCR4（SuperArray引物；PPR06440A；SABiosciences，Frederick，MD，USA）从膀胱组织中分离出总RNA，使用SYBR Green掺入和ΔΔCT分析方法，通过实时RT-PCR（Option，Bio-Rad，Hercula，CA，USA。使用Student’s t检验测定了经盐处理和环磷酰胺处理的大鼠膀胱CXCR4 mRNA表达的差异。p<0.05为显著性。
按照制造商的协议（NuPAGE Bis-Tris凝胶，Invitrogen），在非还原条件下对膀胱匀浆进行Western blotting，如前所述[8]简单地说，将20µl膀胱匀浆加载到NuPAGE Bis-Tris凝胶（4-12%；Invitrogen）上。电泳后，将分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上。使用CXCR4多克隆抗体（Sigma；C3116）和化学发光底物（Sigma1∶1000）检测CXCR4蛋白带。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作负荷控制。使用柯达图像工作站（美国纽约州罗切斯特柯达市）对色带强度进行量化，并以生理盐水组的比例表示。
为了检测膀胱中MIF与CXCR4的结合，我们使用CXCR4联合免疫沉淀法，然后进行MIF蛋白印迹。使用CXCR4抗体（5µg，Sigma；#C3116）从冷冻膀胱组织匀浆（200µg总蛋白）中沉淀CXCR4。使用蛋白G琼脂糖珠分离含CXCR4的蛋白质复合物，然后通过变性、还原SDS电泳分离。使用生物素化抗MIF抗体（1∶1000稀释，R&D系统）通过Western blotting鉴定含MIF的条带。
统计分析
通常，数据以平均值±S表示。E、M和组间差异通过t检验确定。CXCR4免疫染色的视觉评分显示为中位数±四分位数范围，两组之间的差异通过Wilcoxon秩和检验进行评估，而数字化CXCR4的免疫染色显示为平均值±S。使用t检验分析任意强度得分和差异的E.M。使用双向（治疗x时间）重复测量方差分析（ANOVA）测试作为环磷酰胺治疗的函数的体重减轻。Bonferroni事后t检验检查了生理盐水组和环磷酰胺组在特定时间点的体重差异。。使用统计软件进行分析（R；http://www.r-project.org/).
致谢
Gary A.Smith Jr.提供了出色的技术援助。
脚注
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金：本材料基于退伍军人事务部、退伍军人健康管理局、研究与开发办公室、生物医学实验室研究与开发（PLV；KLMS）支持（或部分支持）的工作。这项工作也得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所DK075059（PLV；KLMS；XW）和海湾松基金会的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
1Bucala R，Donnelly SC。巨噬细胞迁移抑制因子：炎症和癌症之间的可能联系。免疫。2007;26:281–285.[公共医学][谷歌学者] 2Flaster H，Bernhagen J，Calandra T，Bucala R。巨噬细胞迁移抑制因子-糖皮质激素二元体：炎症和免疫的调节。摩尔内分泌。2007;21:1267–1280.[公共医学][谷歌学者] 三。Javeed A，Zhao Y，ZhaoY。巨噬细胞迁移抑制因子：在炎症疾病和移植排斥中的作用。炎症研究。2008;57:45–50. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Meyer-Siegler KL，Oldrica RC，Vera PL。巨噬细胞迁移抑制因子在内毒素诱导的大鼠膀胱炎症模型中上调。干扰素细胞因子研究杂志。2004;24:55–63.[公共医学][谷歌学者] 5Vera PL，Meyer-Siegler KL。巨噬细胞移动抑制因子在大鼠泌尿生殖组织、外周神经节和腰骶脊髓中的解剖位置。BMC神经科学。2003;4:17. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Vera PL，Wang X，Meyer-Siegler KL。持续性环磷酰胺诱导炎症期间大鼠膀胱巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）和MIF受体CD74的上调。Exp Biol Med（梅伍德）2008;233:620–626.[公共医学][谷歌学者] 7Meyer-Siegler KL，Vera PL。巨噬细胞移动抑制因子的腔内抗体可减少P物质诱导的大鼠膀胱和前列腺炎症变化。乌洛尔杂志。2004;172:1504–1509.[公共医学][谷歌学者] 8Vera PL、Iczkowski KA、Leng L、Bucala R、Meyer-Siegler KL。在大鼠膀胱炎症期间，巨噬细胞迁移抑制因子在腔内液体中与α1-抑制剂-3复合物释放。乌洛尔杂志。2005;174:338–343.[公共医学][谷歌学者] 9Meyer-Siegler KL，Vera PL。P物质诱导大鼠膀胱上皮释放巨噬细胞迁移抑制因子。乌洛尔杂志。2004;171:1698–1703.[公共医学][谷歌学者] 10Meyer-Siegler KL，Iczkowski KA，Vera PL。尿路感染患者尿液中巨噬细胞迁移抑制因子增加：人类尿液中的巨噬细胞迁移抑制蛋白复合物。乌洛尔杂志。2006;175:1523–1528.[公共医学][谷歌学者] 11Ohkawara T、Nishihira J、Takeda H、Hige S、Kato M等。通过抗巨噬细胞迁移抑制因子抗体改善小鼠右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎。胃肠病学。2002;123:256–270.[公共医学][谷歌学者] 12Mikulowska A、Metz CN、Bucala R、Holmdahl R。巨噬细胞迁移抑制因子参与小鼠II型胶原诱导的关节炎的发病机制。免疫学杂志。1997;158:5514–5517.[公共医学][谷歌学者] 13.Lue H、Thiele M、Franz J、Dahl E、Speckgens S等。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）通过激活Akt通路和CSN5/JAB1在控制自分泌MIF活性中的作用促进细胞存活。致癌物。2007;26:5046–5059.[公共医学][谷歌学者] 14Leng L，Bucala R.通过克隆巨噬细胞表面受体揭示巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的生物学。细胞研究。2006;16:162–168.[公共医学][谷歌学者] 15.Leng L，Metz CN，Fang Y，Xu J，Donnelly S，等。结合CD74启动的MIF信号转导。《实验医学杂志》。2003;197:1467–1476. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Starlets D、Gore Y、Binsky I、Haran M、Harpaz N等。细胞表面CD74启动信号级联，导致细胞增殖和存活。鲜血。2006;107:4807–4816.[公共医学][谷歌学者] 17Meyer-Siegler KL，Vera PL。P物质诱导大鼠膀胱中CD74和CD44的变化。乌洛尔杂志。2005;173:615–620.[公共医学][谷歌学者] 18Bernhagen J、Krohn R、Lue H、Gregory JL、Zernecke A等。MIF是CXC趋化因子受体在炎症和致动脉粥样硬化细胞募集中的非配体。自然医学。2007;13:587–596.[公共医学][谷歌学者] 19Charo IF，Ransohoff RM。趋化因子和趋化因子受体在炎症中的多种作用。《英国医学杂志》。2006;354:610–621.[公共医学][谷歌学者] 20Eisenhardt A，Frey U，Tack M，Rosskopf D，Lümmen G等。CXCR4趋化因子受体在膀胱癌中的表达分析和潜在功能作用。欧洲乌拉尔。2005;47:111–117.[公共医学][谷歌学者] 21Murdoch C，Monk PN，Finn A.人类上皮细胞上趋化因子受体CXCR4的功能表达。免疫学。1999;98:36–41. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22.Yuridullah R，Corrow KA，Malley SE，Vizzard MA。环磷酰胺（CYP）诱导的膀胱炎后膀胱内fractalkine和fractalpine受体的表达。自主神经科学。2006;126–127:380–389. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Fedyk ER、Jones D、Critchley HO、Phipps RP、Blieden TM等。IL-1和TNF降低基质衍生因子-1的表达，并降低皮肤伤口愈合。免疫学杂志。2001;166:5749–5754.[公共医学][谷歌学者] 24科斯LG。单剂量环磷酰胺对大鼠不同器官影响的光镜和电镜研究。膀胱。实验室投资。1967;16:44–65.[公共医学][谷歌学者] 25Philips FS、Sternberg SS、Cronin AP、Vidal PM。环磷酰胺和膀胱毒性。癌症研究。1961;21:1577–1589.[公共医学][谷歌学者] 26Dwinell MB、Ogawa H、Barrett KE、Kagnoff MF。SDF-1/CXCL12通过CXCR4调节肠上皮细胞中cAMP的产生和离子转运。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2004;286：G844-50。[公共医学][谷歌学者] 27Kolodziej A、Schulz S、Guyon A、Wu D、Pfeiffer M等。未成熟颗粒细胞中CXC趋化因子受体4的强直激活支持成年齿状回的神经发生。神经科学杂志。2008;28:4488–4500. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28McClure CP、Tighe PJ、Robins RA、Bansal D、Bowman CA等。男性尿道和女性宫颈中HIV共受体和趋化因子配体基因的表达。艾滋病。2005;19:1257–1265.[公共医学][谷歌学者] 29Woo LL、Hijaz A、Kuang M、Penn MS、Damaser MS等。阴道扩张后泌尿生殖器官中干细胞归巢细胞因子的过度表达。乌洛尔杂志。2007;177:1568–1572.[公共医学][谷歌学者] 30Malley SE，Vizzard MA。环磷酰胺诱导的膀胱炎后膀胱细胞因子mRNA和蛋白的变化。生理基因组学。2002;9:5–13.[公共医学][谷歌学者] 31Moyer RA、Wendt MK、Johanesen PA、Turner JR、Dwinell MB。Rho激活调节CXCL12趋化因子刺激的模型肠上皮肌动蛋白重排和恢复。实验室投资。2007;87:807–817. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Smith JM、Johanesen PA、Wendt MK、Binion DG、Dwinell MB。CXCR4的CXCL12激活通过刺激上皮细胞迁移和促进肠屏障完整性来调节粘膜宿主防御。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2005;288：G316-26。[公共医学][谷歌学者] 33Zimmerman NP、Vongsa RA、Wendt MK、Dwinell MB。炎症性肠病肠上皮屏障粘膜稳态中的趋化因子和趋化因子受体。炎症性肠病。2008;14:1000–1011. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Oh SB、Tran PB、Gillard SE、Hurley RW、Hammond DL等。趋化因子和糖蛋白120通过直接刺激初级伤害性神经元产生疼痛超敏反应。神经科学杂志。2001;21:5027–5035. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Bhangoo S，Ren D，Miller RJ，Henry KJ，Lineswala J等。大鼠局灶性神经脱髓鞘后神经元趋化因子受体功能表达的延迟：外周伤害感受器慢性敏化的机制。Mol疼痛。2007;三:38. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Bhangoo SK、Ren D、Miller RJ、Chan DM、Ripsch MS等。CXCR4趋化因子受体信号传导介导与抗逆转录病毒毒性神经病变相关的疼痛超敏反应。大脑行为免疫。2007;21:581–591. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
