发育中耳蜗前庭结构域规范中的Sox2信号和随后的毛细胞分化

的强制表达式Sox2系统抑制毛细胞形成。

先前的研究结果表明，Sox2的表达对于Corti器官内所有细胞类型的发育都是必要的，包括机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞(三). 为了确定观察到的Sox2下调是否对毛细胞形成是必要的，用Sox2.nucEGFPE13导致维持Sox2的表达。该表达载体还包含一个内部核糖体进入位点（IRES）序列，该序列导致在同一启动子的控制下生成核定位增强型绿色荧光蛋白（nuclear EGFP）的独立转录物。耳蜗外植体维持6天在体外并使用肌球蛋白6（Myo6）的表达作为毛细胞发育的标记物，对感觉上皮中保持Sox2表达的细胞进行分析。虽然Myo6在体内的许多不同组织中表达，但在所有毛细胞中都表达，而在其他细胞类型中没有表达(6). 转染细胞的定量分析表明，在感觉上皮细胞中，99.4%转染Sox2的细胞被抑制发育为毛细胞(图1 E类和F类和表S1)表明维持高水平的Sox2表达会抑制毛细胞的形成。相比之下，50.1%转染了仅表达核EGFP的对照载体的原感细胞发育为毛细胞(表S1). 的过度表达Sox2系统对支持细胞命运没有影响（数据未显示），表明Sox2对毛细胞命运有特异性抑制。

Sox2和Atoh1之间的拮抗关系。

在与Atoh1共表达一段时间后，Sox2在发育为毛细胞的祖细胞中表达下调。Sox2下调的时间与相同细胞中Atoh1表达增加相关。这种表达模式，以及证明在中枢神经系统中SoxB1和bHLH转录因子之间存在拮抗关系(2)，促使我们调查Sox2和Atoh1之间是否存在类似的关系。作为第一步，P19胚胎癌细胞内源性表达Sox2(图2 A类和B类)，转染了Atoh1.EGFP公司包含IRES序列(图2C类)24h后检测Sox2的表达。转染细胞始终为Sox2阴性，表明Atoh1拮抗Sox2表达（97%的Atoh1-转染细胞Sox2呈阴性；n个=4，t=63）(图2 A-D公司).

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图2。

Sox2和Atoh1之间的拮抗关系。(A-D公司)P19细胞，标有DAPI（蓝色A类)，内源性表达Sox2（红色B类). 然而，用Atoh1.EGFP公司（星号在A-D公司)Sox2表达为阴性(B-D公司). Sox2对抗Atoh1在体外. (电子-G)KO或LER转染的细胞Atoh1.EGFP公司仅Myo6（红色）阳性，表明发育为毛细胞(E-F公司)同时Sox2系统-转染细胞不能发育成毛细胞(G公司). (H-J公司)LER内的细胞与Sox2.nucEGFP和Atoh1.EGFP公司一个细胞对Myo6（红色）呈阳性，而另一个则不然，这说明了Sox2和Atoh1之间的拮抗相互作用。早期毛细胞分化和额外毛细胞的形成Sox2系统低形态耳蜗。(K-O公司)耳蜗基底弯的横截面Sox2系统^+/+和Sox2系统^{EGFP/LP公司}E15.5小鼠。(K（K）)抗-Myo6标记显示在Sox2系统^+/+耳蜗（箭头）。(L（左）)相比之下Sox2系统^{EGFP/LP公司}耳蜗包含一个内部毛细胞（箭头）和两个外部毛细胞（如箭头所示）。(M（M）和N个)E18窝友耳蜗毛细胞（标记有抗Myo6）的分析。Sox2活性水平的逐渐降低导致额外的内毛细胞数量增加（恒星N个). (O（运行）)内毛细胞数量Sox2系统^+/+(n个=5），Sox2^EGFP公司/+(n个=5），以及Sox2系统^{EGFP/LP公司}(n个=3来自2只小鼠）同窝耳蜗表明Sox2系统^{EGFP/LP公司}耳蜗(P（P）<0.001). 误差条为S.E.M.IHC，内毛细胞；O1-O3，外部毛细胞。（比例尺，A-J公司，10微米；K-N公司，20微米）

为了检测Sox2是否拮抗Atoh1的作用，将KO或较小上皮嵴（位于感觉上皮侧面的LER）内的细胞转染至Atoh1号机组单独使用或组合使用Atoh1号机组和Sox2。转基因Atoh1.EGFP公司在97.2%的转染细胞中，毛细胞标记物Myo6表达(图2 E类和F类和表S1) (7,8)而细胞转染Sox2.nucEFGP不表达毛细胞标记(图2G公司和表S1). 为了确认转染Atoh1.EGFP公司结果在诱导毛细胞命运的过程中，转染细胞还检测了第二个毛细胞标记物肌球蛋白7a的表达(6)以及立体纤毛束的存在。几乎所有Atoh1.EGFP公司-转染细胞表达肌球蛋白7a，并有一个静纤毛束(图S2). 相比之下，只有50.1%的细胞与Atoh1.EGFP公司和Sox2.nucEGFP与单独转染Atoh1时的97.2%相比，发育为毛细胞(图2 H-J公司和表S1). 这些结果表明，尽管Sox2对前庭结构域的所有或大多数方面的表达是必要的，但Sox2也通过抑制Atoh1诱导毛细胞形成的能力发挥拮抗剂的作用。如果是这种情况，那么减少但不消除Sox2活性可能会导致毛细胞过早形成和过度生产，因为对Atoh1功能的拮抗作用减弱。为了验证这个假设，我们检查了耳蜗的形态Sox2系统^{EGFP/LP公司}表达Sox2的小鼠约为正常水平的30%(9). 在E15.5，野生型耳蜗只包含一排Myo6阳性的内毛细胞(图2K（K）). 这一排内毛细胞沿着耳蜗导管的底半部延伸。这种模式与已知的毛细胞分化的基底至顶端梯度相一致。相反，E15.5中的耳蜗Sox2系统^{EGFP/LP公司}耳蜗管底半部有一排内毛细胞和两排外毛细胞(图2L（左）). 此外，到E18时，沿耳蜗基底至顶轴的全长观察到内毛细胞数量显著增加Sox2系统^{EGFP/LP公司}老鼠(P（P）< 0.001) (图2 移动运营商). 内毛细胞数量的增加并不是以牺牲我的Prox1或Sox2标记的支持细胞为代价的（数据未显示）。感觉上皮长度或外毛细胞数量无明显变化。此外，上皮沿其全长是连续的。不同Sox2活性降低水平的动物耳蜗之间的比较表明，对额外的内毛细胞数量具有剂量依赖性影响(图2 O（运行）).

Sox2诱导耳蜗中Prox1的表达。

Sox2的初始开始和表达模式与Prox1一致，但比Prox1稍早，Prox1是一种同源结构域转录因子，在发育中的感觉上皮中表达，也被P0限制为支持细胞核(10,11) (图3 A类和A′). 由于Prox1的表达与Sox2在耳蜗管外侧区重叠(图3B类)，我们推测Prox1表达可能需要Sox2。为了验证这一假设，从以下方面测定了耳蜗中Prox1的表达Sox2系统^{液化天然气/液化天然气}（浅毛和盘旋）小鼠(三). 与此假设一致，Prox1在耳蜗中的表达在Sox2系统^{液化天然气/液化天然气}小鼠在两个E15.5，即Prox1表达正常开始后的一个时间点(图3 C类和D类)和P0(图S3). 为了确定Sox2是否诱导Prox1表达，Sox2系统在耳蜗外植体内的细胞中异位表达。强制表达Sox2.nucEGFPProx1在100%转染细胞中的诱导表达(n个=4，t=103）位于整个耳蜗，包括KO(图3 E-G公司)和LER(图3 H-J公司). 此外，转染了Sox2.nucEGFP在发育中的感觉上皮中，Prox1表达明显增加(图S4). 相反，转染了核子。EGFP公司单独不表达Prox1（数据未显示）。为了确定毛细胞形成是否需要下调Prox1，将耳蜗原感细胞转染Prox1.nucEGFP项目; 据Myo6检测，95.5%维持Prox1表达的细胞被抑制发育为毛细胞(图3 K（K）和L（左）和表S1)，表明Sox2的抑制作用可以由Prox1介导，至少部分可以。为了直接验证这一假设，将位于KO或LER的非感觉细胞与Atoh1.EGFP公司和Prox1.nucEGFP项目如前所述。只有4.5%的共转染细胞发展为毛细胞(图3M（M）和表S1)，强烈支持Prox1在Sox2的拮抗作用中起关键作用的假设。

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图3。

Sox2调节Prox1的表达。(A类和A′)在P0处WT耳蜗中段蜗横截面上标记Prox1（红色）和actin（绿色），显示Prox1在支持细胞核亚群中的表达；IP、OP和D1-D3。(B类)使用抗Prox1（红色）和抗Sox2（绿色）的双重免疫标记表明Prox1和Sox2在包括PC和DC核在内的外侧区域的表达重叠。(C类和D类)Prox1在耳蜗中缺失Sox2系统^{液化天然气/液化天然气}老鼠。(C类)抗-Prox1（红色）染色在E15.5标记前感觉细胞的细胞核（圆形）。(D类)与WT相比，Prox1染色在Sox2系统^{液化天然气/液化天然气}E15.5处的突变耳蜗。DAPI（蓝色）染色C类和D类显示细胞核。Sox2诱导异位表达前置器1. (E-J公司)Sox2.nucEGFPKO内细胞转染(E-G公司)或LER(H-J公司)Prox1为正（红色）。(K（K）和L（左）)强制表达探头1抑制毛细胞形成。耳蜗前庭细胞转染Prox1.nucEGFP项目. (K（K）)外植体培养共聚焦图像的低分辨率图解Prox1.nucEGFP项目KO和SE中的转染（绿色）（箭头）。(L（左）)SE的高度认可的观点表明Prox1.nucEGFP项目毛细胞标记Myo6（红色）的表达细胞（箭头）为阴性。(M（M）)与共转染Prox1.nucEGFP项目和Atoh1.EGFP公司导致Atoh1的抑制。尽管Atoh1表达，但细胞对Myo6呈阴性（红色）。内毛细胞；IP，内柱电池；OP，外柱电池；D1-D3，Deiters细胞；O1-O3，外毛细胞；内指骨细胞；HeC，亨森氏细胞；KO，科利克器官；LER，小上皮嵴；SE，感觉上皮。（比例尺，A类，20微米；A′-B类，10微米；C-K公司，20微米，L（左），10微米，M（M），20μm）

Notch信号调节Sox2的表达。

Jagged1介导的Notch通路激活已被证明是大多数内耳前庭结构域规范所必需的(12). 为了确定Sox2的表达是否依赖于Notch信号，在E13开始的耳蜗外植体培养中，通过暴露于γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制了Notch通路的激活(N个-[N-（3,5-二氟苯基）-L-丙氨酸基]-S-苯甘氨酸叔丁酯），阻断Notch信号传导。DAPT处理耳蜗移植物导致Sox2的表达降低(图4 A类和B类)因此Prox1(图4 C类和D类)这表明Notch信号是维持前庭细胞内Sox2和Prox1表达所必需的。然而，DAPT治疗也会导致毛细胞数量的显著增加，正如之前报道的那样(13) (图4 E类和F类)提示Sox2和Prox1的丢失可能是细胞命运改变的结果，而不是Notch通路对原感细胞中Sox2/Prox1表达的直接影响。因此，为了确定Notch的激活是否足以诱导Sox2和/或Prox1、Notch1胞内结构域的表达(新生儿重症监护室)在KO或LER内的细胞中表达。平均96.4%NICD公司。EGFP公司-转染细胞的Sox2表达阳性(图4G公司;n个=3，t=51）。用表达EGFP的对照载体转染的细胞中没有一个细胞对Sox2呈阳性(n个=3，t=47；数据未显示）。然而，没有NICD公司。EGFP公司-观察到转染细胞表达Prox1（数据未显示）。这些结果表明，Notch信号通路的激活可诱导Sox2的异位表达，但在同一细胞中随后激活Prox1还需要其他因素。这一结果也与Prox1仅在前庭细胞亚群中表达的观察结果一致。此外，感觉上皮中NICD的过度表达对毛细胞的形成具有抑制作用(n个=5，t=35；数据未显示）类似于Sox2过度表达的结果。为了证实Notch信号在Sox2上游起作用，我们检测了Sox2中Notch1的表达Sox2系统^{液化天然气/液化天然气}小鼠处于E15.5。正如所料，这些突变体中存在Notch1的表达(图4H（H）). 综上所述，我们的数据表明，虽然Notch信号通路独立于Sox2上游，但它在调节Sox2表达中发挥作用。然而，我们的结果并不排除Sox2下游Notch信号的额外作用。

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图4。

Sox2表达需要Notch信号。(A-F公司)在E13开始的耳蜗外植体培养物上使用γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号，导致Sox2系统(A类和B类)和探头1(C类和D类)表达式。(E类和F类)相反，Myo6标记表明DAPT处理的外植体培养物中内外毛细胞数量增加。(G公司)强制表达美国国家医疗服务体系。EGFP公司LER内的细胞诱导Sox2（黄红色细胞核）表达。(H（H）)E15.5中存在Notch1表达（棕色）Sox2系统^{液化天然气/液化天然气}变异耳蜗。（比例尺，20μm）

细胞培养。

根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）对P19细胞进行转染。细胞在4%PFA中固定20分钟，并使用指示的抗体进行免疫组织化学分析。用DAPI核染色（分子探针，1:5000）对细胞核进行复染。

免疫组织化学。

如前所述，对耳蜗和耳蜗外植体培养物进行免疫细胞化学(7,8)（请参见SI方法更多详细信息）。

表达式构造。

请参见SI方法了解详细信息。

电穿孔。

如前所述，使用方波电穿孔法转染耳蜗外植体中的单个细胞(8)（请参见SI方法更多详细信息）。

细胞命运变化的量化。

请参见SI方法了解详细信息。

我们感谢A.Kiernan博士、A.Pelling博士和T.Friedman博士阅读手稿，以及C.Woods，CW。Kramer、T.Dennison和EC博士。技术援助司机。K.S.E.C.得到了香港研究资助委员会HKU7385/02M，B.F.、国立卫生研究院拨款R01 DC005590，L.H.P.和国立卫生研究所拨款R01 EYO1861的支持。这项工作得到了国家耳聋和其他沟通障碍研究所内部项目的支持。