后生动物的着丝粒主要由重复的DNA组成，动粒在其上聚集以介导染色体分离。表观遗传因子有助于在特定位点建立和维持动粒，动粒由CENP-A染色质组成(1-4). 然而，确定CENP-A染色质位置以及动粒组装的主要信号尚不清楚。
在果蝇、人类和裂变酵母中，动粒嵌入异染色质中(5-7). 裂变酵母着丝粒有两个不同的结构域：外侧重复序列（otr），位于由最内侧重复序列（imr）和中央核心（cnt/cc）DNA组成的中央动粒结构域的侧面(三,8)().
测试Clr4在建立CENP-A中的作用Cnp1号机组着丝粒处的染色质。(A类)裂变酵母着丝粒DNA和使用的微染色体(20). CENP-A协会Cnp1号机组和H3K9me2，带pH-cc2(B类)，pHH-cc2(C类)，或pcc2(D类)显示了通过交叉（X）或转化（T）引入野生型（wt）或clr4细胞（另见图S1). 微型染色体上的聚合酶链反应（PCR）产物位置如图所示（A）。fbp1是控制非中心轨迹。在CENP-A中Cnp1号机组将pcc2产物的ChIP富集与相对于fbp1的输入DNA（T）进行比较。还评估了内源性cc1/3相对于fbp1的富集情况。在H3K9me2 ChIP中，将质粒外重复序列J2（B）或K〃K〃（C）产物的富集与输入DNA相对于fbp1产物的PCR进行比较。还评估了内源性otr序列的富集情况（B和C）。定量PCR证实了这些结果[下面板（B）和（C）以及右面板（D）和图S3] (20). 直方图显示质粒相对于内源性cc1/3的富集百分比。
异染色质包含Swi6（异染色素蛋白1或HP1），与赖氨酸9（H3K9me2）上二甲基化的组蛋白H3结合，在otr上形成，而CENP-ACnp1号机组取代中央结构域中的组蛋白H3(5,7,9-11). 着丝粒异染色质通过募集凝集素和调节姐妹着丝粒之间的凝聚力来促进着丝粒功能(12,13). 这里，我们测试异染色质标记CENP-A染色质组装位点的想法(14)
裂变酵母微染色体必须包含至少一部分otr和大部分中心结构域（imr-cc）DNA，以实现动粒组装、分离功能和微染色体保留(三,14-17). 来自非编码otr转录物的小干扰RNA（siRNAs）直接在这些重复序列上H3K9甲基化和异染色质形成(8,18). 各种成分的缺陷会导致H3K9甲基化、Swi6和着丝粒凝集素的丢失或减少(5,9,13). 内源性染色体在没有着丝粒异染色质的情况下分离，因为姐妹染色单体仍然被臂粘连蛋白所束缚。然而，小圆形微小染色体的有丝分裂稳定性被破坏了(19). 含有otr和cc DNA的小染色体具有着丝粒活性，与无着丝粒相比，丢失率较低(15,16). 这里，最初使用了两个微小染色体()[如所述(15,20)]：pH-cc2和pHH-cc2（H表示otr异色元素，cc表示中心域DNA）。pcc2缺乏otr重复序列。这些质粒携带尿酸4+和sup3-5（ade6-704的抑制器）选择系统。裸DNA转化为细胞时功能着丝粒的形成需要otr和cc序列(三,14). 因此，无着丝粒pcc2质粒在有丝分裂中不稳定，并迅速丢失，但在选择性培养基中保持不变，而pH-cc2和pHH-cc2在野生型细胞中有丝分裂稳定并分离(15). 异染色质对细胞活力不是必需的；确定是否需要建立CENP-ACnp1号机组cc DNA上的染色质，我们比较了CENP-A的相关性Cnp1号机组在野生型中建立和传播后，通过交叉进入clr4背景，将微小染色体DNA直接转化为clr4细胞(图S1).
将含有pH-cc2和pHH-cc2微染色体的野生型细胞与clr4（clr4:：LEU2）细胞杂交（X表示），并将野生型细胞（leu−)或clr4（leu+)选择含有小染色体的后代。此外，pcc2、pH-cc2和pHH-cc2质粒被转化为野生型和clr4菌株，以及原发性ura+ade公司+选择具有完整微染色体DNA的转化子（T表示）进行进一步分析(和图S2)(20). 染色质免疫沉淀（ChIP）显示来源于杂交或初级转化体的野生型细胞中pH-cc2和pHH-cc2的otr上存在H3K9me2(). 然而，这种异色修饰在clr4中丢失。欧洲标准化委员会-ACnp1号机组与与常染色fbp1相关的内源性cen1/cen3中心核心DNA（cc1/3）相关+所有菌株的基因座(、和图S3). 然而，没有CENP-ACnp1号机组在pcc2上检测到野生型或clr4(和图S3). 因此，CENP-ACnp1号机组当单独引入质粒时，不能与cc DNA结合，并且Clr4不能通过cc DNA作用来招募CENP-aCnp1号机组这与pcc2上正常核小体阶梯的形成相一致，而不是活动着丝粒上不寻常的cc染色质(16,17).
相反，CENP-ACnp1号机组在pH-cc2或pHH-cc2转化为野生型（wt-T）或杂交成野生型（wt-X）或clr4（clr4-X）的cc上富集。然而，没有CENP-ACnp1号机组当直接转化为clr4时，在pH-cc2或pHH-cc2上检测到，即使可以看到内源性cc1/3的富集(、和图S3). 因此，CENP-A的存在Cnp1号机组在基因完全相同的clr4细胞中，在相同的小染色体上，取决于小染色体是以预装配状态还是裸体状态进入这些细胞。这表明Clr4依赖的着丝粒异染色质影响CENP-A的建立Cnp1号机组在中心域内。
小的pH-cc2或pHH-cc2微染色体，带有部分着丝粒DNA元件，并且只有中央核心的一侧有otr异染色质，可能对这种CENP-a中异染色素的缺乏特别敏感Cnp1号机组建立分析。因此，我们使用了一个36-kb的小染色体，其中包含两个几乎完全的otr重复序列，位于整个cen3中央结构域[pH-icc3i-H()] (16,20). 与cen1结构相比，该微染色体包含一个几乎完整的着丝粒，具有32.5kb的相邻cen3 DNA。将pH-icc3i-H杂交成野生型或clr4，并选择保留pH-icc 3i-H的菌落。此外，使用含有pH-icc3i-H的野生型细胞的总DNA转化野生型和clr4选择直接接受pH-icc 3i-H细胞。使用特定引物对区分微染色体和内源性序列，我们观察到H3K9me2和CENP-A的相同模式Cnp1号机组微小染色体的关联（图。和). 因此，CENP-A与pH-icc3i-H在基因相同的clr4细胞中的关联取决于其引入途径。这表明建立CENP-A需要Clr4 H3K9甲基转移酶和完整的otr异染色质Cnp1号机组着丝粒cc-DNA上甚至pH-icc3i-H上的染色质类似于一个完整的cen1(16,19).
要求Clr4建立但不维持CENP-ACnp1号机组大cen3小染色体上的动粒蛋白。CENP-A协会Cnp1号机组和H3K9me2英寸(A类)和CENP-C立方厘米和Sim4英寸(B类)通过交叉（X）或转化（T）引入的含有pH-icc3i-H的野生型和clr4菌株中的ChIP测定。fbp1或act1是控制非中心位点。在CENP-A中Cnp1号机组，CENP-C立方厘米，并将质粒cc3产物的Sim4-ChIPs富集与相对于act1产物的输入DNA（T）进行比较。阳性对照：评估内源性着丝粒cc1/3的富集。H3K9me2 ChIP：将质粒-外重复序列J3产物的富集与相对于act1的输入DNA（T）的PCR进行比较。阳性对照：评估内源性otr着丝粒重复序列的富集。
在微小染色体上使用不同的引物表明CENP-ACnp1号机组和H3K9me2通常分别只在cc和otr序列中发现，没有混合的证据(图S4). CENP-A的相对减少Cnp1号机组clr4细胞内源性着丝粒水平可以检测到，但只能在选择性最低培养基中检测到(图S5). 这表明完整的异染色质可能影响CENP-ACnp1号机组正常情况下的着丝粒招募。异染色质可能对建立CENP-A至关重要Cnp1号机组染色质在特定条件下，例如，长时间处于休眠状态的孢子的萌发。异染色质导向的CENP-ACnp1号机组染色质组件可作为备用系统，与CENP-a的其他机制冗余Cnp1号机组沉积，只有通过建立分析才能发现。
CENP-ACnp1号机组在clr4-X细胞中不稳定的微染色体上检测到的可能是一个功能性动粒的残余，但其他动粒蛋白可能会从这种微染色体上丢失，无论其来源如何。CENP-C是一种保守的内动粒成分(21). Sim4是保守的多亚单位动粒复合体的组成部分(10,22). 欧洲标准化委员会立方厘米与控制位点（act1）相关的内源性cc1和cc3（cc1/cc3）检测到Sim4()在通过交叉或转化获得的pH-icc3i-H上也存在。欧洲标准化委员会立方厘米当与clr4杂交时，Sim4和Sim4保留在pH-icc3i-H的cc DNA上，但在转化为clr4时，二者均未被招募到pH-icc 3i-H。因此，这些遗传上相同的细胞（clr4-X，clr4-T）在两个额外的动粒蛋白与cc3的结合上存在差异，这取决于DNA分子在传播到缺乏clr4的细胞之前是否最初以野生型繁殖。
这些分析表明，一旦CENP-ACnp1号机组染色质和动粒蛋白聚集在着丝粒DNA上，它们在没有异染色质侧翼的情况下繁殖。然而，异染色质影响CENP-A的建立Cnp1号机组染色质，因此，裸露着丝粒DNA上的动粒。将功能性Clr4添加到含有DNA转化产生的微小染色体的Clr4细胞中，应能在otr序列上诱导异染色质组装，因此，CENP-aCnp1号机组组件。为了测试这一点，我们重新引入了clr4+通过交叉或DNA转化（clr4）获得的pH-icc3i-H基因进入clr4细胞+clr4–X，clr4+clr4–T；). H3K9me2出现在clr4后pH-icc3i-H的内源性外重复序列和质粒-otr连接（J3）上+重新引入。此外，CENP-ACnp1号机组现在在pH-icc3i-H的cc上检测到[将clr4–T与clr4进行比较+第4类-第T类()]. 为了确定Clr4再导入是否同时恢复了全部着丝粒-动粒功能，我们评估了微染色体的稳定性。在clr4-X和clr4-T细胞中，pH-icc3i-H不分离，并迅速丢失。第4类+再导入使小染色体获得着丝粒活性并正常分离。氯丁橡胶4+clr4–X和clr4+clr4–T细胞对噻菌灵（TBZ）不再敏感，这表明着丝粒功能已完全恢复(). 因此，缺乏或保留CENP-A的着丝粒外等位基因Cnp1号机组可以根据着丝粒DNA的历史来创建；无CENP-a的无功能着丝粒外等位基因Cnp1号机组可以切换到功能状态，其中包含CENP-ACnp1号机组提供Clr4甲基转移酶。
氯丁橡胶4+重新引入触发CENP-ACnp1号机组招募到小染色体和小染色体稳定性。(A类)H3K9me2和CENP-A协会Cnp1号机组clr4前后pH-icc3i-H+重新引入（clr4+第4条）。底漆和条件. (B类)野生型（wt）和clr4+含有pH-icc3i-H的clr4细胞无法区分。1/10腺嘌呤的连续稀释试验评估微小染色体稳定性[红细胞集落（丢失）；白细胞集落[保留）]或全腺嘌呤-±10 g/μl TBZ。
完整的otr异染色质需要功能性RNAi途径(8,23-25). 进一步剖析CENP-A的过程Cnp1号机组我们将pHH-cc2转化为缺乏Swi6或RNAi成分Chp1或Dcr1的细胞。与其他分析一致(26)，在chp1或dcr1细胞的pHH-cc2上未建立H3K9me2(). 此外，CENP-ACnp1号机组即使CENP-A与这些小染色体上的cc2 DNA无关Cnp1号机组与内源性着丝粒有关(和图S3). 因此，建立CENP-A需要活性RNAi途径Cnp1号机组裸着丝粒DNA上的染色质。在缺乏Swi6的情况下，RNAi途径仍然是活跃的；swi6细胞产生siRNAs并在着丝粒重复序列上保留H3K9me2(26,27). 然而，尽管pHH-cc2的otr染色质在引入swi6后变成H3K9-甲基化，但没有CENP-ACnp1号机组在其cc2区域检测到。因此，H3K9me2以及RITS对otr染色质的靶向性不足以诱导CENP-A的组装Cnp1号机组当作为裸DNA引入时，在微小染色体的中心结构域内。我们的结论是，需要一块完全完整的着丝粒异染色质补丁来建立CENP-a，而不是维持CENP-aCnp1号机组裂变酵母着丝粒附近的中央动粒域[见我们的模型(图S6)]. 与异染色质密切相关的着丝粒凝集素也可能在建立CENP-a染色质中发挥作用。
建立CENP-A需要Swi6和RNAi组件。欧洲标准化委员会-ACnp1号机组用质粒DNA直接转化并在dcr1、chp1、swi6和野生型（wt）菌株中进行选择后，在pHH-cc2上获得H3K9me2 ChIP。底漆和条件定量PCR证实了这些结果（下面板和图S3)(20).
这些分析表明，在裂变酵母中，异染色质的完整性对于建立作为动粒基础的CENP-A染色质至关重要。值得注意的是，HP1异染色质是从人类新着丝粒的CENP-A染色质形成的800 kb(28); 因此，可以想象异染色质可能在后生动物着丝粒上发挥类似的作用。
