介绍
进化上保守的SMC（染色体结构维持）家族由三个基本复合体组成，包括在有丝分裂期间维持姐妹染色单体凝聚力直至后期的内聚素（Smc1/3）和促进染色体致密化和去保持的凝聚素（SMC 2/4）。第三个成员Smc5/6在染色体分离中也具有基本但机械上未定义的功能，有趣的是，所有三个SMC复合物都有助于DNA修复(洛萨达和平野，2005年;Nasmysy和Haering，2005年;Murray和Carr，2008年).
酵母Smc5和Smc6相互作用稳定，并与六个核心亚基相互作用，称为n个上的-S公司国会议员e（电子）元素（Nse1-6）。任何Smc5/6亚单位的突变都会使细胞对DNA损伤剂过敏，并在没有外源性DNA损伤的情况下导致严重的DNA分离缺陷(福斯特和莱曼，2000年;麦当劳等, 2003;森川等, 2004;Pebernard公司等, 2004;托雷斯-罗塞尔等, 2005;Zhao和Blobel，2005年;佩伯纳德等，2006年). Smc5/6对于修复多种类型的DNA损伤至关重要，包括DNA双链断裂（DSB）和折叠的复制叉(莱曼等1995年;藤冈等, 2002;麦当劳等, 2003;哈维等, 2004;佩伯纳德等, 2004;Potts and Yu，2005年;托雷斯-罗塞尔等, 2005;Zhao和Blobel，2005年). Smc5/6通过刺激姐妹染色单体之间的同源重组（HR），与近端结合并促进两个损伤的修复(皮氏杆菌等，2006年;林德罗斯等，2006年;波茨等，2006年). 有趣的是，Smc5/6还可以在复制应激期间阻断病理性HR依赖性过程；在这种条件下，低形态Smc5/6突变体积累RAD51依赖的毒性重组中间产物，阻碍有丝分裂时的染色体分离(布兰泽等，2006年;宫城县等，2006年;佩伯纳德等，2006年).
Smc5/6非SMC亚基Nse2是一种从酵母到人类保守的SUMO E3连接酶(安德鲁斯等, 2005;Potts and Yu，2005年;Zhao和Blobel，2005年). 在裂变酵母中，SUMO连接酶死亡nse2-SA突变体支持细胞生存能力，但使细胞对基因毒剂敏感，表明DNA修复中存在关键的Nse2靶点(安德鲁斯等, 2005).
测定了芽殖酵母Smc5/6的基因组定位(林德罗斯等，2006年). 然而，芽殖酵母染色体的结构和调控与其他真核生物不同。特别是，裂变酵母和人类着丝粒是由许多保守蛋白质和机制（包括RNAi）维持的大型重复异色结构，这在芽殖酵母中没有发现(奥尔郡，2004年;Zofall和Grewal，2006年). 在裂变酵母中，异染色质的建立、传播和维持依赖于组蛋白去乙酰化和甲基化的一系列事件(格雷瓦尔和埃尔金，2007年). 异染色质建立早期的一个关键步骤是组蛋白H3通过Clr4–Rik1–Cul4复合物在赖氨酸9（H3K9Me2）上二甲基化。H3K9Me2作为染色域蛋白（例如Swi6）的结合平台，促进异染色质扩散和修饰位点的稳定沉默(格雷瓦尔和埃尔金，2007年). 着丝粒异染色质上的Swi6新招凝集素，这是维持着丝粒凝聚力和在结构上组织着丝粒以实现适当的动粒-纺锤体相互作用以及有丝分裂时忠实的染色体传递所必需的(伯纳德和奥尔郡，2002年).
我们确定了Smc5/6在三条分裂酵母染色体上的定位（通过稳定的Nse4亚基）和募集机制，这揭示了有关复合物调控和潜在功能的重要新信息。Smc5/6在S期早期（例如，在羟基脲（HU）处理后）暂时被征募到着丝粒，而暴露于甲基磺酸甲酯（MMS）可诱导Nse4在广泛的粒下域积聚。有趣的是，不同的信号机制促进了HU或MMS治疗后Smc5/6的不同基因组定位。Smc5/6向着丝粒的募集依赖于异染色质，而MMS诱导的Nse2依赖性sumoylation可增强亚染色粒募集。最后，我们发现Smc5/6定位于整个基因组的所有转录活性tRNA编码序列（tDNA）。总的来说，我们的研究结果为全基因组招募提供了新的见解，从而突出了Smc5/6复合物的潜在功能。
结果
Nse4定位于不同的亚核病灶，以应对HU和MMS治疗
为了确定Smc5/6亚核定位是否受基因毒性应激控制，我们监测了活细胞中内源性标记的Nse4-GFP。MMS治疗触发了多个Nse4病灶的形成(). 相比之下，HU处理的细胞只形成一个Nse4焦点(). MMS诱导的Nse4病灶常在核仁周围形成双重结构；类似于Chr3端粒的核周系留rDNA重复(近重等, 1997;). 我们假设单个HU诱导的焦点可能对应于纺锤体极体（SPB）/着丝粒簇(近重等, 1997;). 因此，我们测试了Nse4–GFP和RFP标记的Gar1（核仁）或Nuf2（着丝粒）标记之间的共定位(浅川等, 2005;Dovey和Russell，2007年). 在未经治疗的细胞中，罕见的自发病灶主要是核周(). MMS治疗后，约70%可见的Nse4病灶位于核周，10%位于着丝粒(). 其余MMS诱导的病灶通常是非核仁双核仁，可能与Chr1/2端粒簇相对应(，上部面板）。在HU阳性细胞中，Nse4几乎只与Nuf2共定位(). 因此，Nse4主要定位于HU的着丝粒/SPB簇和MMS处理后的端粒簇。
复制应激后，Nse4不同地定位于特定的核病灶。MMS和HU处理后内源性Nse4-GFP的活细胞显微镜观察。(A类)MMS诱导每个细胞形成多个Nse4焦点，而HU仅诱导每个细胞一个焦点。(B类)量化（A）。(C类)MMS处理后Nse4–GFP和核仁Gar1-mRFP的染色。(D类,E类)（C）的量化。(F类)Nse4-GFP和着丝粒Nuf2 mRFP在MMS处理的细胞中的共定位。(G公司,H（H）)量化（F）。(我–K（K）)与（F–H）相同，但细胞暴露于HU而非MMS。(我,M（M）)Nse4着丝粒定位依赖于Clr4。（五十） HU治疗中Nse4焦点形成被消除第4类Δ细胞，但MMS治疗后仍保持正常。野生型和氯丁橡胶4表达Nse4-GFP的Δ细胞用HU或MMS处理，并用活荧光显微镜进行分析。（M） （L）的量化。
HU诱导的Nse4着丝粒积累依赖异染色质的建立
着丝粒和端粒是裂变酵母中高度组织化的异色结构(Cam和Grewal，2004年). 因此，我们测试了无法建立Nse4–GFP病灶形成的细胞的异染色质依赖性从头开始异染色质，因为它们缺乏H3K9甲基转移酶Clr4(氯丁橡胶4Δ). 引人注目的是，英寸氯丁橡胶4Δ细胞，HU诱导的Nse4-GFP灶形成被阻断；然而，MMS诱导的Nse4-GFP病灶未受影响(). 这些数据表明，不同的Nse4亚核定位是由Clr4依赖性和非依赖性机制促进的。
暴露于HU和MMS后Smc5/6占据的特定基因组位点的鉴定
为了证实Nse4与着丝粒染色质和端粒染色质的关联，我们进行了内源性染色质免疫沉淀（ChIP）三野生型（wt）中的HA-taged Nse4和氯丁橡胶4Δ细胞，用HU或MMS处理。通过定量PCR（qPCR）评估Nse4在特定基因组位点的富集情况。裂变酵母着丝粒由一个独特的中心核心结构域组成(碳纳米管)两侧为倒置内侧(国际货币兑换)和外部(otr系统)重复，后者包含dg公司/dh公司重复(Cam和Grewal，2004年). 因此，为了绘制Nse4在着丝粒内的定位图，我们测量了其在碳纳米管,otr系统（dg）和国际货币兑换与复制的非着丝粒起源相比2004年和a非ars控制位于上游30kb。在HU标记的野生型细胞中，Nse4在otr系统，在较小程度上碳纳米管和国际货币兑换(). 与未处理的细胞相比，Nse4在otr系统增加了六倍。在匈牙利氯丁橡胶4Δ细胞，在otr系统(). 这些数据与我们的Nse4–GFP本地化数据一致，并表明otr系统是HU中Nse4占据的主要着丝粒结构域。
Nse4的全基因组定位三HU和MMS处理细胞中的HA。(A类)Nse4–三着丝粒位点的HA ChIP。Nse4–三使用所示探针，通过qPCR将富含HA ChIP的样品与输入样品中存在的DNA总量进行比较。(B类)Nse4–三端粒位点的HA ChIP。如（A）所示执行ChIP。(C类)指示菌株中Nse4结合位点的全基因组图谱（芯片上ChIP）。着丝粒（cen）和亚中心（telo）的位置用黄色方框标记，以突出HU和MMS处理后与这些区域结合的差异Nse4。Y（Y）轴：log2（MATscore）从0到4。(D类,E类)Nse4结合的着丝粒（D）和端粒（E）结构域的详细映射三哈。所示菌株的ChIP-on-ChIP图被放大，以显示每条染色体上的着丝粒或端粒结构域。（D）顶部的方框表示每个着丝粒域的位置(碳纳米管，核心域；国际货币兑换，内部重复；otr系统，外部重复）。Telo2R引物的位置和rDNA重复分别用灰色和黑色方框表示。tRNA编码序列（tDNA）的位置由黑色箭头指示。Y（Y）轴：log2（MAT分数）代表Nse4–三HA富集。X（X）轴：与染色体左端的距离，单位为千碱基（kb）。
为了确定MMS治疗后Nse4结合的端粒结构域，我们测量了其在Chr2亚端粒结构区和Chr3的富集度rDNA位点(). MMS诱导Nse4在两种情况下的Clr4非依赖性累积电信2R和rDNA基因座，在ars2004年和非ars(). 虽然HU治疗主要诱发otr系统Nse4的富集，MMS治疗在端粒诱导Nse4富集，在较小程度上在端粒otr系统，相对于异步单元(补充图2A). 作为附加控制，我们对三HA-标记的Rad21，一种凝集素亚单位，结合otr系统贯穿大多数细胞周期的结构域(富那加等, 2000). 在异步单元中，Rad21绑定到otr系统与任何其他量化基因座相关，HU或MMS处理的细胞没有变化(补充图2B). 总的来说，Nse4绑定在otr系统HU和MMS分别增强端粒。
要绘制全基因组Nse4结合位点，Nse4–三HA ChIP样品在葡萄裂殖酵母用于“ChIP-on-ChIP”分析的DNA拼接阵列。比较了四种细胞群：野生型异步、野生型HU和MMS处理以及HU处理氯丁橡胶4Δ. 全球Nse4-binding谱显示，它广泛分布在异步（主要是G2）野生型细胞的所有三条分裂酵母染色体上，但在亚群中很少(). 除了tDNA（见下文）外，在异步裂变酵母的染色体上没有出现Nse4负载的明确模式/偏好。HU处理后，Nse4在所有着丝粒富集，在某些基因组区域消失(). 在HU中，Nse4定位于亚砾岩rDNA在Chr3上重复，但不重复到Chr1和Chr2的亚砾岩区域(). Smc5/6至Chr3亚群的定位可能反映了rDNA在这些基因座上，重复性和潜在的毒性重组事件（参见库隆等, 2004;Murray和Carr，2008年). 鉴于裂变酵母和芽殖酵母的Smc5/6都能抑制“非法”重组（例如。托雷斯·罗塞尔等, 2005;宫城县等，2006年;佩伯纳德等，2006年)似乎裂变酵母Smc5/6很可能在rDNA抑制该基因座的毒性重组，类似于出芽酵母的Smc5/6(托雷斯-罗塞尔等, 2005). 在HU中，Nse4与染色体的结合普遍减少，这可能反映了Smc5/6在完全复制的染色体上的最大负荷，而在HU，复制是不完整的。事实上，在芽殖酵母和爪蟾（鸡蛋提取物）Smc5/6负载与复制耦合(林德罗斯等，2006年;筑山等，2006年). 在HU中，还有从头开始在Chr3的亚粒区Nse4的补充/富集，这可能会略微耗尽其他位点。
从全球来看，HU处理的野生型和氯丁橡胶4Δ电池(). 引人注目的是，经MMS处理后，Nse4优先与所有三条染色体上的亚染色体序列结合，但在其他位点上似乎有些缺失(). 这种全球消耗可能是由于从头开始Nse4在广泛的亚群中加载，减缓了复制，也许更多的损伤部位分布在染色体上，从而平均了MAT分数。该分析证实，HU处理诱导Nse4在着丝粒积累，而MMS处理主要将Nse4动员到所有三条染色体的粒下区域。
接下来，我们使用ChIP-on-ChIP数据分析了着丝粒处的详细Nse4-结合模式(). 在异步细胞中，Nse4在国际货币兑换,碳纳米管tDNA定位于每个着丝粒屏障，但在otr系统地区(). 值得注意的是，HU治疗促进Nse4在otr系统不影响其他着丝粒区域的结合(). 这个otr系统s是裂变酵母着丝粒的主要异色区(鹧鸪等, 2000). Nse4本地化otr系统遵循独特的模式，峰结合发生在dg公司/dh公司重复(). 与H3K9Me2在otr系统，Nse4结合峰位于H3K9Me2最小的位置（参见表观基因组主页http://pombe.nci.nih.gov/和凸轮等, 2005;诺玛等，2006年). 这种现象在岑3，其中包含最大数量的dg公司/dh公司重复(). 值得注意的是，在HU治疗中氯丁橡胶4Δ细胞，Nse4不定位于otr系统但通常与国际货币兑换,碳纳米管和tDNA(). 因此，在HU处理的细胞中，Nse4着丝粒定位的增加主要局限于otr系统并且需要H3K9Me2异色标记。由于Smc5/6相关的SMC复合体在着丝粒处以异染色质和Swi6依赖的方式富集凝集素(伯纳德和奥尔郡，2002年)，我们测试了Smc5/6加载是否也需要Swi6。对野生型和瑞士文6有无HU处理的Δ细胞(补充图3). Nse4在otr系统野生型和瑞士文6HU存在时的Δ电池，表明Smc5/6在otr系统在很大程度上独立于Swi6。要确定Smc5/6是否影响imr和otr着丝粒结构域，我们检测了尿酸4+标记插入任一位点（参见奥尔郡等1995年)并检测到野生型和Smc5/6突变体之间没有差异（数据未显示）。总的来说，这些数据表明Smc5/6在otr系统独立于Swi6和cohesin，对其他/内部消息转录沉默。
我们的ChIP-on-ChIP数据也揭示了MMS端粒处Nse4的特异性富集，但HU处理的细胞没有(和未显示）。在MMS中，Nse4在Chrs1/2上的大的亚颗粒区域富集，但在HU处理的细胞中不富集(). 有趣的是，携带rDNA重复显示Nse4占用率的分布较窄，靠近rDNAMMS和HU处理细胞中的重复序列和局部长末端重复序列(). 作为rDNA是一个已知的复制挑战，包含复制叉屏障（RFB）以维持转录和复制的共同方向，我们更准确地确定了MMS诱导的Nse4在rDNA。我们的ChIP-qPCR分析表明，Nse4定位于RFB的近端，但明显在17S编码序列内达到峰值(补充图5). 总之，MMS触发所有六个端粒的Nse4募集（以Clr4非依赖性方式），表明MMS诱导的Nse4-GFP病灶对应于核膜上的端粒簇。
Smc5/6被招募到未扰动S相的着丝粒中
为了区分细胞周期和复制应激诱导的着丝粒Nse4负荷，我们监测了Nse4的补充otr系统（dg2引物），或对照非AR位置，通过ChIP-qPCR在整个细胞周期中。我们首先使用温度敏感的cdc25-22等位基因，并在释放前添加HU，以阻止S期进展并确定Nse4着丝粒负载的动力学(). Nse4特别累积于otr系统释放后90分钟，由于细胞分裂，因此开始S期(). 为了确定Nse4是否在未扰动的S相结合着丝粒，我们在没有HU的情况下进行了相同的实验(). Nse4绑定于otr系统G2/M期非常低，但在S期开始时特别增加，在最大间隔时达到峰值结合，在随后的G2期再次减少(). Nse4蛋白水平在整个细胞周期或对复制应激的反应中不会波动(帕莱切克等，2006年和数据未显示）。因此，Nse4在着丝粒处瞬时加载otr系统在S期早期重复，表明Smc5/6在复制着丝粒的关键功能。
Smc5/6参与S期着丝粒结构的建立。(A类,B类)Nse4在otr系统处于S阶段。Nse4–三HA ChIP输入cdc25-22型细胞在36°C下同步，在25°C下释放HU（A）或（B），用qPCR测定。(C类,D类)Smc5/6复合体是后期着丝粒适当分离所必需的。（C） 野生型和标准色6Δ细胞含有Lac操纵子阵列（lacO）Cen1号机组（lys1）和表达LacI–GFP融合在HU中被阻断，并在latrunculin B中释放。Cen1号机组释放后2～4h监测分离情况。箭头指出异常的DNA结构如下。白色箭头
：异常相间，两个相间分离Cen1号机组; 白色箭头→：正常后期，每个着丝粒位于牵引纺锤的每个极；白箭头▹：染色体滞后的异常后期；黑色箭头▸：两个方向错误或连接错误的异常后期中心1; 白色箭头
：只有一个可见的异常后期Cen1号机组（D）实验过程和（C）的量化。下部面板中的图形表示所描述的每个细胞周期阶段的事件类型。暗圆，核；白斑，Cen1号机组.异常中期/后期重组多个异常Cen1号机组以及DNA分离事件，如染色体滞后、着丝粒错位等(E类)Smc5/6亚型突变体nse2-1和编号4-6对TBZ过敏。将指示菌株的一系列稀释液点在未经处理或用15 mg/ml噻苯咪唑（TBZ）处理的富培养基上，并在32°C下孵育。(F类)编号4-6当用DAPI染色时，突变体在半允许温度（32°C）下显示出较高数量的染色体滞后事件。右侧面板，左侧面板的量化。
为了测试Smc5/6突变细胞的着丝粒功能，我们首先分析了野生型和标准色6Δ细胞从HU释放到latrunculin B后，在这些条件下，细胞完成复制，进行有丝分裂，并在末期停止。这使我们能够更仔细地分析有丝分裂的进展和缺陷的积累，因为细胞不会继续进入新的细胞周期。我们监测着丝粒1的分离(Cen1号机组)通过一个Cen1号机组近端LacO重复序列和LacI–GFP(竖部等, 2001). 尽管野生型细胞在有丝分裂过程中迅速进展，并在末期停滞，标准色6Δ细胞表现出有丝分裂进展的极端延迟（2-3小时），并积累异常的有丝分裂图(). 一个显著的缺陷是两个Cen1号机组焦点在第6期Δ核。此外，在标准色6Δ细胞，如编号4-6突变细胞(; 见下文）。接下来我们治疗Smc5/6亚型突变体，nse2-1和编号4-6用微管固定剂噻菌灵（TBZ；). 这两个突变体都对TBZ过敏，表明这些突变体中的着丝粒功能障碍和纺锤体-动粒相互作用缺陷(). 当用DAPI染色时，编号4-6细胞表现出高频率的滞后染色体，这是着丝粒功能障碍的另一个症状(). 这些表型与低形态内聚蛋白突变体相似，它们在着丝粒结构和功能上也有缺陷(Bernard和Allshire，2002年).
Nse2-SUMO连接酶活性对MMS诱导的Nse4亚群募集至关重要
我们观察到MMS诱导TAP-tagged Nse4的～15kDa修饰，在HU治疗后没有出现(和). 这种改变早在MMS治疗后2小时就可见，并在～5–6小时达到峰值(). 由于Smc5/6亚基Nse2是一种SUMO E3连接酶，我们测试了Nse4是否是SUMO靶点。MMS诱导的Nse4修饰在Pmt3（SUMO）缺失细胞中不存在(;田中等, 1999). 因此，Nse4要么是为了响应MMS处理而直接修饰，要么是以依赖SUMO的方式间接修饰。为了区分这两种可能性，EGFP或EGFP–Pmt3在野生型或pmt3（pmt3）Δ背景(). EGFP–Pmt3在pmt3（pmt3）Δ应变使MMS诱导的Nse4位移恢复到预期的较高分子量(). 为了在Pmt3的生理水平上确认这些结果下午3点基因被6His标记取代pmt3（pmt3）在其内源性位点(Xhemalce公司等, 2004). 这导致MMS中修饰的Nse4的分子量发生轻微变化，反映了6His-Pmt3和未标记的Pmt3之间的差异(补充图4A). 因此，Nse4被直接合成以响应MMS治疗。S.pombe公司只有两个已知的E3 SUMO连接酶，Pli1和Nse2(Xhemalce公司等, 2004,2007;安德鲁斯等, 2005). Pli1是大多数可检测到的磺酰化事件（>95%）的原因，但对于抵抗基因毒性应激来说是不可或缺的(Xhemalce公司等, 2004,2007;普鲁登等2007年). 相反，Nse2介导与基因组稳定性有关的一小部分且基本上未定义的靶蛋白的sumoylation。非催化活性Nse2(nse2-SA)突变细胞可以存活，但对多种DNA损伤剂过敏，但对TBZ引起的纺锤体中毒不敏感(安德鲁斯等, 2005;瓦茨等2007年;Xhemalce公司等2007年). Nse4–TAP酰化水平在第1页Δ电池()，但在nse2南非突变背景(;补充图4B). 因此，Nse2负责Nse4的sumoylation，这似乎是MMS治疗特有的。例如，HU处理不会导致Nse4磺酰化()高剂量IR似乎不会诱导Nse4修饰；即使损伤在持续检查点激活监测的时间点未修复(). 然而，我们不能排除在这些条件下会发生短暂或低水平的Nse4酰化反应。
MMS暴露诱导Nse2依赖性Nse4酰化。(A类–E类)内源性TAP标记Nse4的免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB）。（A） 显示Nse4–TAP修改的时间进程(
)MMS添加到异步文化后的外观。（B） MMS诱导的Nse4–TAP偏移取决于Pmt3（SUMO）的存在。（C） MMS处理触发Nse4 sumoylation。EGFP标记的Pmt3在指定的遗传背景下从pREP41载体中体外表达。观察到的三重谱带是由于EGFP–Pmt3部分降解产物（数据未显示）。（D） Pli1不对Nse4 sumoylation负责。（E） Nse4-sumoylation依赖于Nse2-E3-SUMO连接酶活性。(F类)双品牌突破不会引发Nse4杀戮。(G公司)MMS处理细胞中Nse4病灶的形成取决于Nse2-SUMO连接酶的活性。(H（H）)（G）的量化。
复制分叉崩溃导致Nse4重新调整到子集团。(A类)当复制叉不稳定时，Nse4–GFP重新定位到核周区域。(B类)量化（A）。(C类)Nse4-sumoylation是由复制叉崩溃引起的。(D类)Nse4的ChIP分析三HA显示复制分叉在中崩溃cds1Δ细胞触发Nse4向亚群富集。
为了确定MMS诱导的Nse4亚群病灶是否依赖SUMO，我们监测了Nse4-GFP在第1页Δ和nse2-SA细胞。MMS诱导的Nse4–GFP病灶正常形成于第1页Δ细胞，但在nse2-SA单元格(). 值得注意的是，HU诱导的Nse4–GFP病灶在两组中均正常nse2-SA和第1页Δ电池(). 因此，Nse2的sumoylation促进了Nse4在MMS中的最大粒下定位/保留，但不促进其在HU中的着丝粒定位。
复制叉崩溃诱导Nse4的聚合和亚集团积累
HU耗尽细胞的核苷酸库并诱导复制停滞，在此期间，停滞的分叉以依赖复制检查点激酶（Cds1）的方式稳定下来(野口勇等, 2003;弗罗热等, 2008). 在缺乏Cds1的HU处理细胞中(cds1Δ），观察到高水平的不可逆叉崩塌(野口勇等, 2003;弗罗热等, 2008). 值得注意的是，HU治疗组中检测到多个Nse4-GFP亚群病灶cds1Δ细胞，与MMS处理的细胞中观察到的细胞相似(). 此外，Nse4在HU处理cds1Δ但非野生型细胞(). 确认HU中的Nse4病灶经过治疗cds1Δ细胞对应于球下区域，我们进行了ChIP-qPCR分析。正如预期的那样，我们检测到Nse4在电信2RHU处理cds1Δ细胞与野生型相比(). 这些结果表明，复制叉折叠刺激Smc5/6动员到团下DNA重复，并伴随着Nse4的Nse2依赖性sumoylation。
ChIP-on-ChIP揭示的Nse4的新装载位点
除了HU和MMS诱导的Nse4重定位外，我们的ChIP-on-ChIP分析还揭示了Nse4在所有基因组tDNA上的结合(和). 与短暂的Nse4着丝粒和端粒富集相比，Nse4 tDNA定位似乎在很大程度上与细胞周期和DNA损伤无关(和). 我们系统地分析了Nse4关联在每个已知的S.pombe公司tDNA，并发现其在异步细胞中最高，但在HU处理后的每个tDNA中仍保持较高水平(). MMS治疗导致tDNA MAT分数轻度下降，表明在这种情况下，tDNA中Nse4的存在减少(，左侧面板）。根据MAT评分，所有三条染色体的着丝粒tDNA都是Nse4优先结合位点(，右侧面板）。
Nse4与tDNAs构成相关。(A类)由Nse4结合的tDNA序列的两个示例–三Chr2左臂HA。ChIP-on-ChIP结果被放大以显示Nse4与tDNA位点的关联。下面的箭头表示每个tDNA的位置。与左侧染色体末端的距离以千碱基（kb）表示。(B类)所有基因组tDNA都与Nse4结合。对每个已知tDNA位点的Nse4 ChIP-on-ChIP MAT得分进行量化，并表示为每个MAT得分类别中与Nse4结合的tDNAs的百分比。较暗的区域表示MAT分数较高，因此Nse4富集的信心较高。(C类)着丝粒tDNA优先招募Nse4。定位于每条染色体着丝粒和着丝粒周围区域的所有tDNA的数量如（B）所示。
向tDNA招募Nse4的机制。(A类)Nse4与tDNA构成绑定。使用指定的引物对，通过qPCR检测富含Nse4的ChIP样品。使用的引物集的位置相对于中心2顶部面板上有示意图。左侧面板，Nse4绑定到外部tDNAotr系统不受HU治疗的调节。右面板，细胞周期-ChIP实验，如所述.细胞释放自cdc25-22型逮捕表明Nse4结合稳定三HA到tDNA提尔（染色体2）和tDNA精氨酸（染色体3）贯穿整个细胞周期。(B类)着丝粒屏障的Nse4招募与tDNAs的存在有关。顶部面板，异步细胞中Chr2左着丝粒屏障处Nse4结合的ChIP-on-ChIP信号。底部面板中使用的qPCR引物的位置由黑色双箭头表示。白色箭头：该位点上所有tDNA的位置；黑色箭头：tDNA的位置Tyr公司，在底部面板中进行分析。与左端粒的距离以千碱基（kb）表示。底部面板，ChIP-qPCR测量Nse4–三围绕tDNA的HA招募提尔.黑条：野生型；灰色条：tDNA提尔删除并替换为尿酸4+盒式磁带；白色条：tDNA提尔在野生型背景中删除（否尿酸4+盒式磁带）。(C类)在tDNAs招募Nse4需要完整的RNA pol III启动子序列。上部面板，异位tDNA的示意图描述提尔使用了构造。包含和围绕tDNA的约600 bp基因组片段提尔已插入列1+轨迹。tDNA提尔在其RNA pol III启动子B盒中发生突变，或在该位点中完全缺失。下面板，Nse4–三HA与异位tDNA的结合提尔带有野生型（黑色条）、B盒突变体（浅灰色条）或tDNA的基因座提尔通过ChIP-qPCR在指定位置测量缺失突变（深灰色条）背景。
tDNAs处的转录依赖性Nse4负载
为了确认Nse4与tDNA的结合是结构性的，我们测量了Nse4–三在Chr2的三个tDNA上通过qPCR检测HA ChIP样品(). 在未经处理的细胞中，与非着丝粒控制基因座相比，Nse4与这些tDNA相关(). HU处理通常增加了Nse4与所有位点的结合，预期在otr系统(). 然而，位于中心2边界（在otr系统)tDNA只有轻微富集阿拉在中国际货币兑换(). 为了确定tDNA处的Nse4负载是序列依赖性还是位置依赖性，我们替换了单个tDNA编码序列（tDNA提尔)在Chr2的着丝粒周围区域尿酸4+磁带，测量Nse4–三通过ChIP-qPCR在相邻序列上结合HA(). 在野生型细胞中，Nse4与富含tDNA的区域紧密结合(，上部面板）。Nse4是围绕tDNA招募的提尔尤其是在位点上游100 bp和下游1 kb处(，下部面板）。更换tDNATyr公司由尿酸4+与野生型相比，盒减少了接近tDNA的Nse4结合约2倍，但对缺失上游或下游1kb几乎没有影响(). 删除近着丝粒tDNA时也获得了类似的结果精氨酸Chr3基因（数据未显示）。确保tDNA的缺失Tyr公司而不是大公司的存在尿酸4+盒减少了Nse4的结合，我们通过基因替换和5-FOA上的选择移除盒。tDNA中Nse4结合100 bp提尔在缺乏尿酸4+而在距离缺失1kb处检测不到Nse4水平的变化(). 因此，含有tDNA的基因组位点上的Nse4负载是由于tDNA编码序列的存在。
基因组tDNA由RNA聚合酶III（RNAPolIII）转录，可导致转录依赖性复制叉暂停(Deshpande和Newlon，1996年). tDNA转录需要TFIIIC、TFIIIB和RNAPolIII与构成RNAPolIII依赖启动子的保守基因内A盒和B盒的顺序结合(Paule和White，2000年). B盒中的单点突变消除TFIIIC结合、tDNA转录和复制叉暂停活性(Kurjan和Hall，1982年;艾利森等, 1983;Deshpande和Newlon，1996年). 为了确定Nse4是否只与转录活性tDNA结合，我们测量了Nse4与tDNA的结合提尔异位位点整合的基因组基因座(列1+）将其从其他活性tDNA附近移除。异位tDNA提尔基因组位点为野生型、B盒突变或tDNA完全缺失提尔-编码序列。异位野生型tDNA上游52 bp处的Nse4结合提尔与内源性tDNA结合相似提尔基因座，两个对照基因座未检测到特异性结合（比较). 引人注目的是，tDNA中的一个单点突变提尔B盒消除了该位点Nse4的富集，与tDNA的完全缺失相当Tyr公司-编码序列(). 因此，tDNA处Nse4的富集要求它们具有转录活性，这与它们的复制叉暂停活性密切相关。
讨论
芽殖酵母和裂变酵母全基因组Smc5/6负载量的比较
描述了芽殖酵母Smc5/6的全球染色体定位(林德罗斯等，2006年)我们对裂变酵母Smc5/6复合体的研究发现，复合体的染色体负载量存在一些有趣的相似性和差异。比较这些高度分化酵母结构上不同的染色体上Smc5/6的负载位点，表明其功能可能对高等真核生物保守。
在裂变酵母中，Smc5/6在复制时暂时定位于着丝粒，而在芽殖酵母中，在G2/M时Smc5/6的着丝粒占有率最高。尽管存在这些差异，在两种酵母的复制过程中都需要Smc5/6功能，以促进中后期着丝粒的准确及时分离（本研究和林德罗斯等，2006年). 这表明Smc5/6在高等真核生物的区域异色着丝粒上也具有关键功能，类似于裂变酵母。
这两种酵母中的Smc5/6在rDNA位点；然而，在芽殖酵母中，HU固定细胞中的负载量明显减少，而在分裂酵母中，负载量显著增加。尽管存在这种差异，Smc5/6很可能在这两种酵母的这些位点上具有相似的复制耦合功能，即抑制复制敏感重复染色体区域的重组。芽殖酵母复制检查点缺陷雷达53Δcells，HU处理导致Smc5/6在基因组范围内富集，大概位于叉塌陷的部位(林德罗斯等，2006年). 我们没有对复制检查点缺陷细胞中的Smc5/6进行ChIP-on-ChIP分析；然而，使用免疫荧光和ChIP-qPCR，我们发现Smc5/6在HU处理的细胞团下区域富集cds1型Δ（ScRad53）细胞。因此，当分叉崩溃时，这两种酵母中的Smc5/6被补充到染色质中，这可能反映了复合体重新启动崩溃复制分叉的需要(安帕齐杜等，2006年). 有趣的是，裂变酵母的MMS处理引发了Smc5/6向亚群的类似再分配，如HU处理的cds1Δ细胞，表明Smc5/6对在受损DNA模板上复制也很重要。MMS处理的芽殖酵母的类似全基因组效应尚未确定。
一个有趣的发现是，裂变酵母Smc5/6以TFIIIC和转录依赖的方式在基因组中的所有tDNA上加载（见上文）。芽殖酵母中Smc5/6复合物的tDNA载量未见报道(林德罗斯等，2006年). 然而，最近的一项研究表明，在芽殖酵母和裂变酵母中，Smc5/6相关的SMC复合物condensin在tDNA处负载(达安布罗西奥等, 2008). 此外，凝集素在tDNAs的负载需要Scc2/4凝集素装载复合体，该复合体也定位于基因组中的tDNA(达安布罗西奥等, 2008). 正如Scc2/4之前显示的那样，在未受损的染色体上装载芽孢酵母Smc5/6(林德罗斯等，2006年)，Smc5/6也可能在出芽酵母中加载tDNA，但这一点仍有待证实。在这方面，有趣的是要注意到Smc5/6突变芽殖酵母会经历总染色体重排，在许多情况下，重排起始于tDNAs附近(黄星京等, 2008). 现在很清楚，Scc2/4在所有三种SMC复合物的某些方面的负载中都起作用，因此混淆了Scc2/4突变表型的直接分配，需要确认观察到的缺陷也与特定SMC复合突变体有关。
Nse2的氨酰化促进Nse4向受损端粒募集
Nse2依赖性sumoylation对MMS治疗后的细胞存活至关重要(安德鲁斯等, 2005;Zhao和Blobel，2005年)我们现在表明，Nse2促进了sumoylation，并增强了Nse4的亚集团招募，以应对MMS。因此，Smc5/6向受损端粒的募集可能是Nse2依赖性sumoylation对MMS反应的关键功能；然而，这一现象所需的Nse2依赖性sumoylation的关键目标目前尚不明确。sumoylation和ubiquitination都可以通过产生新的蛋白质-蛋白质相互作用来修改蛋白质功能，这些相互作用分别由SUMO和ubiquetin结合基序介导(科舍尔等，2006年). 例如，PML亚核小体的形成需要PML的自酰化和PML中SUMO相互作用基序介导的非共价PML–SUMO交互作用(沈等，2006年). 在酵母中，Nse2-mediated sumoylation抑制受损复制叉处病理重组结构的形成，Smc5/6全复合物的其他低形态突变体也观察到类似的结果(安帕齐杜等，2006年;布兰泽等，2006年;宫城县等，2006年;Pebernard公司等，2006年). 因此，SUMO介导的Smc5/6在受损/塌陷的分叉处的募集/积累可能是Nse2依赖性sumoylation的关键功能。
结论
与凝集素类似，Smc5/6的定位为otr系统s依赖异染色质。此外，Smc5/6突变细胞表现出染色体分离缺陷，类似于凝集素和异染色质建立因子的低形态细胞。在一个不同的途径中，Nse2介导的sumoyalization促进Smc5/6在折叠的复制叉和受损的亚端粒DNA处的积累，但对于Smc5/6在着丝粒上的定位是可有可无的。因此，分裂酵母Smc5/6全复合物对不同信号作出反应，以促进正常或扰动细胞周期中的染色体分离。
材料和方法
显微镜
之前描述过显微镜技术(佩伯纳德等, 2004). 用0.03%MMS（v/v）或15–25 mM HU（Sigma-Aldrich）处理细胞，并在30℃下生长6 h或在25℃下生长7 h。对于DAPI染色实验，细胞在70%乙醇中固定1分钟，在1×PBS中洗涤，并在分析之前与500μg/ml DAPI混合。监测着丝粒分离、野生型和标准色6Δ细胞在Cen1号机组通过在32°C下用12 mM HU进行4.5小时的治疗，在S期早期同步化。观察到完全阻滞后，将细胞释放到含有10μM latrunculin B（AG Scientific）的新鲜培养基中。这种治疗可以使野生型细胞经历有丝分裂并在末期停滞。在释放后2-4小时收集时间点，并对细胞核和Cen1号机组内容。在2到3个独立实验中，总共统计了200到300个细胞，并显示了一个具有代表性的实验。
ChIP分析
按照所述进行ChIP实验(小川等, 1999). 清除的裂解物与预先结合到抗HA（12CA5；Babco）或抗myc（9E10；Babco）抗体的蛋白G动态珠（Invitrogen，CA）孵育。使用PureLink PCR纯化试剂盒（Invitrogen）纯化DNA样本。使用Chromo-4四色检测系统（Bio-Rad），使用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）和指示引物对输入和富含ChIP的样品进行qPCR。引物序列详见补充数据数据表示为ChIP样品中相对于输入DNA初始量的DNA回收率%，或标准化为背景信号的倍数增加非ars现场。所有误差条代表实验重复之间的标准误差，在重复或三次qPCR测量之间取平均值。
ChIP-on-ChIP公司
输入和ChIP样本在Affymetrix上扩增并杂交S.pombe公司平铺阵列FR1.0。请参见补充数据.
sumoylated Nse4的检测
Nse4–TAP标记菌株在32℃的YES中生长，并在32℃下用0.03%MMS（v/v）或12 mM HU处理5小时。对于伽马射线照射，用200 Gy处理细胞，并在32°C下回收2小时。将细胞在SpLysis缓冲液（50 mM Tris–HCl pH 8.0，300 mM NaCl，0.2%NP-40，0.5 mM EDTA，20 mMN个-乙基马来酰亚胺，50 mM NaF，0.05 mM Na三沃4，与IgG-Sepharose珠（GE Healthcare）结合的不含EDTA-的完整蛋白酶抑制剂（罗氏，IN），4 mM PMSF，在样品缓冲液中洗涤并直接煮沸。将洗脱液装入3-8%三乙酸盐midi凝胶（Invitrogen）。用过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）抗体（Sigma-Aldrich）免疫印迹法检测Nse4-TAP，并使用Super signal west dura底物（Pierce，IL）进行培养。
