X染色体失活(1)平衡XX和XY个体之间的X染色体剂量。XCI由发起西斯特(2,三)并遭到反对Tsix公司(4). 怎么西斯特在Xi上诱导XCI以及如何Tsix公司稳定静音西斯特关于Xa，还有两个尚未回答的问题。长期以来，人们一直推测RNA干扰（RNAi）的作用。RNAi是指双链RNA（dsRNA）对基因转录和转录稳定性的抑制性影响(5,6). XCI和组成异染色质的RNAi沉默之间存在许多相似之处，包括非编码RNA的参与。然而，Dicer（Dcr）效率对维持T细胞中的Xi没有明显影响(7)虽然Xist和Tsix RNA是完全互补的，但dsRNA从未被观察到体内.
在这里，我们正式探讨了RNAi在XCI中的作用。在西斯特/尖峰，我们对小鼠胚胎干细胞（ES）进行了Northern分析，这是一个在细胞分化过程中重现XCI的模型离体以及在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，XCI后细胞忠实地维持一个Xi。在重复A处西斯特需要消音(8)，我们在Tsix方向的～30 nt和～37 nt以及在Xist方向的～25 nt和～35 nt观察到小RNA(). 在西斯特外显子7，小RNA发生在Tsix链的24-42 nt和Xist链的～25和～35 nt之间(). 在启动子处，观察到大量的六链小RNA(). 在Xist链上也可以看到小RNA，这意味着启动子必须发生低水平的感觉转录。miRNA292-as和tRNA对照证实了所有Northern印迹的完整性(,S1（第一阶段）). 有趣的是，小RNA是发育调控的，在XCI前（第0天，d0）和XCI后（MEF）状态下无法测量，只有在XCI（第4天，d10）期间才能检测到。此外，小RNA在XX和XY细胞中都发生。为了便于讨论，我们暂时将其称为“xiRNA”X（X）-我活化中心起源，不同于较小的siRNAs和miRNAs。
小RNA来源于Tsix/Xist公司（A） xiRNAs来自西斯特重复Northern分析检测到的A（XA）区域（地图）。正（s）和反（as）核糖探针分别检测Tsix和Xist。miR292-as控件显示在相同的斑点上。M、 男性。F、 女性。
（B） 来自的xiRNAs的Northern分析西斯特外显子7。
（C） Northern分析西斯特启动子区。
（D） Northern突变细胞分析。WT车道与面板A中的车道相同（并发分析）。
为了确定xiRNA的产生是否依赖于反义表达，我们研究了因Tsix公司(Tsix公司ΔCpG) (4)和Tsix公司调节器，锡特(锡特ΔL) (9). 正在删除Tsix公司导致反义xiRNA显著减少(). 仍然可以检测到xiRNAs的残留水平，这与Tsix公司ΔCpG(4). 正在删除锡特同样降低了反义xiRNA水平，符合锡特在交易中Tsix公司(9). 在感觉定向中，这两种缺失也影响了xiRNA的产生。因此，小RNA确实是由西斯特/尖峰并依赖于Tsix公司和锡特表达式。
xiRNAs的存在意味着Tsix和Xist必须作为长双链前体存在。然而，xiRNA出现的发育时间是矛盾的：虽然Tsix和Xist在d0上是双等位表达的，但在XCI期间它们在相反的X上是单等位表达(4). 在d0上，每个染色体上存在3-5个Xist RNA拷贝，而Tsix出现在>10倍摩尔过量时(10-12). 在XCI上，Tsix在Xi上被下调，因为Xist上调了>30倍。在Xa，由于Xist受到下调，Tsix仍在坚持。当Tsix和Xist同时存在时，dsRNA是如何形成的顺式-有限–在XCI期间位于对染色体上？
为了确定Tsix和Xist是否形成dsRNA，我们设计了一个体内基于ssRNA和dsRNA对RNase A/T1敏感性差异的RNase保护试验。我们将d0 ES细胞的复制制剂渗透到含有DNAse I和RNAse的非变性缓冲液中，用RNAse处理，并对受保护的RNA进行链特异性RT-PCR。为了确认分析灵敏度，阳性对照品——其中1个拷贝/细胞在体外-转录和退火的Tsix：Xist dsRNA被“加标”——使用该协议可以很容易地检测到(). 大量的单链Rrm2和Gapdh转录物未被扩增，表明我们的检测对dsRNA具有特异性。我们一直在XX和XY ES细胞中观察到RNase保护的Xist和Tsix RNA链，表明存在dsRNA(). 实时RT-PCR定量显示，约16%的Xist和约13%的Tsix受到保护(). 正如对双工体的预期，在RNase保护的部分中，两股的化学计量比大致相等。动力学分析显示在XX和XY细胞分化过程中dsRNA的数量减少(). 因此，dsRNA和xiRNA的稳态数量在发育过程中受到调节，但方式相反。
Tsix和Xist RNA形成长双工体体内（A） 的地图Tsix/Xist公司和引物对（*）。
（B）体内RNA酶保护试验。S、 理智。AS，反义。
（C） 在位置2测量的双工器中Xist和Tsix的相对数量（bp 1206-1337西斯特)通过受保护RNA（RNAse+）的链特异性实时RT-PCR与总水平（RNAse-）进行比较。在Xist-Tix双链中，数量标准化为Xist（Xist，RNAse+=1）。误差线=三次反应中的一个标准偏差（SD）。
（D） 受保护的Tsix或Xist RNA（RNase+）相对于总Tsix和Xist（RNase-）的数量体内RNA酶保护分析。误差棒=1SD，三次反应。
（E）体内使用基于SNP的X基因引物，使用链特异性、等位基因特异性实时RT-PCR进行RNA酶保护试验，以测试dsRNA的等位基因起源中国科学院或X亩等位基因（表）。对照基因组DNA的PCR显示出较高的特异性（mus为98%，cas为>99.99%）。误差棒=1SD，三次反应。对于测试样品，分别扩增mus和cas组分，归一化为基因组DNA（X中国科学院：X亩=1:1），并绘制为时间函数。%cas=[X中国科学院RNA/（X）中国科学院RNA+X亩RNA）]×100。由于条形图显示相对等位基因分数，因此数量只能在单个时间点内进行比较。
随着时间的推移，反向相关性增加了dsRNA被加工成xiRNA的可能性。为了解决潜在的等位基因差异，我们使用两个带有遗传标记的雌性ES细胞系——野生型16.7，携带来自栗木（X）中国科学院)和小M（X）亩)并经历随机XCI（具有30:70的天然特异性偏压(13)); 和Tsix公司ΔCpG/+突变体，携带Tsix公司在X上删除肌肉(4)因此总是使X失活亩在16.7的背景中。Tsix RNA总量（无RNase处理）随着时间的推移减少了10倍以上，但在第4天和第10天仍能检测到预期的低残留水平（数据未显示）(4,9,14). 从这个剩余库中，使用位于3位的基于SNP的等位基因特异性引物，我们意外地发现Tsix（RNase-protected）在Tsix公司ΔCpG/+细胞主要来源于Xi（X亩) ()–专业所在的XTsix公司启动程序被删除。同样，以双重形式发现的Xist链起源于Xi。因此，Tsix:Xist双工主要从Xi中检测到。
双重体可能只在Xi上形成，也可能在两个X上形成，但仅在Xi中稳定。后者特别有趣，考虑到长dsRNA与xiRNA的出现之间的反向动力学关系。dsRNA能在Xa上被加工成xiRNA吗？几项观察结果支持这一观点。首先，dsRNA从Xa中选择性丢失。第二，xiRNA的产生依赖于Tsix公司，一个在d4-d10从Xa表达的基因。最后，尽管缺乏Xi，XY细胞还是产生了xiRNA。
因为dsRNAs是Dcr的底物，我们通过删除Dcr公司女性ES细胞中的RNAseIII结构域(15) (图S2). 因为已知Dcr-/-细胞生长不良(15)，我们引入了Dcr公司转基因表达量为野生型的5%()以及改善Dcr-缺陷克隆的生长（以下简称为Dcr-/-）。Northern分析显示xiRNA水平降低()表明xiRNA的产生依赖于Dcr。所有测试Dcr公司-有缺陷的克隆表现相似。明显地，西斯特在XCI前期细胞中表达提前增加5至10倍()，表示增加西斯特转录或更高的RNA稳定性。雄性Dcr-/-克隆同样对d4表现出显著的Xist去抑制作用(图S3). 因此，Dcr调节xiRNA水平并拮抗西斯特ES细胞上调。
Dcr公司缺乏会损害xiRNA的产生和XCI（A） 所示转录物归一化为β-肌动蛋白的定量实时RT-PCR。
（B） Xist定量绘制在对数刻度上。
（C，D）突变细胞中miRNA292-as对照（C）和xiRNAs（D）的Northern分析。注意miRNA292-as前体（*）在数字版权所有-/-单元格。
（E） 免疫-RNA FISH检测第10天的Xist和H3-3meK27。DAPI，蓝色。
（F） d10 EB的相位对比图。
RNA免疫FISH分析表明，Dcr具有额外的XCI效应。尽管Xist水平升高，但Xist不能“覆盖”X，也不能诱导异色变化(). 在第10天，Xist RNA仅在0.4%的细胞（n=278）中积累，H3-K27三甲基化（H3-3meK27）在0.7%的细胞中积累（n=276）。相比之下Dcr公司2lox/-对照组，Xist累积56.8%，H3-K27三甲基化83.1%（n=148）。此外，X-linked机械2基因未能得到剂量补偿Dcr公司-/-细胞，而对照组则适当减少1.5至2倍(). 因此，除了局部影响西斯特，Dcr也影响了全球Xi，因为Xist和H3-3meK27结构域的形成在没有Dcr的情况下受到影响。
因为XCI和细胞分化是联系在一起的(16,17)XCI缺陷可以用Dcr对分化的多效性效应来解释(15,18)而不是对XCI的具体影响。的确，Dcr公司-/-克隆分化差，在d10上继续表达Oct4和Nanog多能性因子(,图S3). 为了确定Dcr是否特别影响XCI，我们通过在数字版权所有-/-单元格(图S4)，认为禁用Tsix公司–负调节西斯特-可能会克服Xist RNA积累失败的问题，Dcr公司-/-Tsix公司-/+双突变体（Dcr-TST）和Tsix公司-/+对照组（TST）显示Tsix从X亩和高度扭曲的XCI模式(). 尽管Dcr-TST细胞继续分化不良(图S5)，在分化过程中，总Xist水平恢复到接近WT水平(). 此外，禁用Tsix部分恢复了Xist对Xi的本地化(). 因此，Dcr对XCI的影响可以从基因上与其对细胞分化的影响分开。
Tsix公司与基因相互作用Dcr公司（A） 等位基因特异性RT-PCR分析。所有RT反应均为阴性（未显示）。Xist d0样本（星号）过载10倍以可视化低表达。
（B） 指示转录物的实时RT-PCR，每个转录物均归一化为β-肌动蛋白。
（C） 免疫-RNA FISH检测第10天的Xist和H3-3meK27域（箭头）。
（D） 西斯特地区H3-3meK27异常富集的频率+所示细胞系的亚群。n=100-150。
（E） 模型：RNAi和XCI的交集。
（F） 甲基化敏感限制性分析西斯特发起人。用EcoRV或EcoRV+HpaII消化基因组DNA。%绘制HpaII的未切割（甲基化）DNA。
此外，在Dcr-TST细胞中恢复了Xist水平和定位的程度上，H3-K27三甲基化在Xist中仅部分被挽救+单元格(). 在WT和TST对照中，Xist积累几乎总是伴随着强劲的H3-K27三甲基化。相比之下，30-40%的西斯特+Dcr-TST细胞显示弱或无H3-3meK27病灶，这意味着H3-K27三甲基化也依赖于Dcr。这些数据表明，Xist积累和H3-K27甲基化是遗传可分的。我们得出结论，Dcr以几种方式与XCI相交。局部而言，Dcr控制xiRNA和Xist的表达。在全球范围内，它调节Xist在Xi上的积累和H3-K27三甲基化。
总的来说，我们的数据表明RNAi对XCI的特定影响().数字版权所有和Tsix/Xist公司基因相互作用，作为Tsix公司部分抑制Dcr公司-/-对…的影响西斯特我们建议Tsix:Xist双工最初在两个X上形成。在XCI期间，Xa上Tsix的持续表达将导致dsRNA加工成xiRNAs，这将局部抑制顺式中的Xist–一个让人想起转录基因沉默（TGS）的想法(6,19-21). 与“等位基因特异性TGS”一致西斯特，RNA定向DNA甲基化Tsix公司已被提议(10). 事实上，在这里我们发现废除Dcr和/或Tsix会导致甲基化水平下降西斯特(). 根据我们的模型，极低的Tsix和Xist表达可能足以维持XCI后细胞Xa上的TGS(19). 在Xi上，Xist RNA和H3-K27me3的染色体宽度积累依赖于Dcr。这些想法支持了哺乳动物核RNAi过程的新概念(20,21). 由于已知Dcr能将RNA切割成25-42 nt，因此观察到的对XCI的影响可能是部分间接的。或者，Dcr可能具有尚未在哺乳动物中发现的新特性。XCI现在提供了一个新的系统来研究RNAi过程。
