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分子细胞。作者手稿；PMC 2009年8月8日发布。
以最终编辑形式发布为：
摩尔细胞。2008年8月8日；31(3): 347–359.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2008.05.023
预防性维修识别码：PMC2583939型
美国国立卫生研究院：尼姆斯65230
PMID：18691967

介体将神经元基因表达的表观遗传沉默与X连锁精神发育迟滞联系起来

宁鼎,1 周海英（Haiying Zhou）,1 皮埃尔·奥利维尔·埃斯特夫,2 Hang Gyeong Chin公司,2 Seokjoong Kim先生,1 徐宣,1 苏米·约瑟夫,三 迈克尔·弗里兹,三 查尔斯·施瓦茨,三 斯里哈尔萨·普拉丹,2和托马斯·博伊尔1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

介体在RNA聚合酶II转录中起着核心作用，是汇聚在蛋白编码基因启动子上的调节信号的传感器、集成器和处理器。与介体在基因激活中的作用相比，关于介体作为抑制信号的传递者的分子机制和生物学意义，人们知之甚少。在此，我们描述了神经外基因沉默所需的蛋白质相互作用网络，包括介体、G9a组蛋白甲基转移酶和RE1沉默转录因子（REST；也称为神经元限制性沉默因子，NRSF）。我们发现，介体中的MED12接口将REST与G9a-依赖组蛋白H3K9二甲基化连接起来，以抑制非神经元细胞中的神经元基因。值得注意的是，MED12中的错义突变导致X连锁精神发育迟滞（XLMR）障碍FG综合征和Lujan综合征破坏了其REST辅升压功能。这些发现暗示了神经系统神经元基因表达的表观遗传限制中的介体，并提示MED12相关的XLMR涉及REST依赖性神经元基因调节受损的病理基础。

简介

多细胞生物中细胞命运的确定和维持关键取决于对RNA聚合酶II转录的精确时空控制，以响应一组确定的细胞内和外信号。因此，扰乱生理转录控制的遗传或环境因素可以改变细胞命运决定，导致各种病理状况，包括发育缺陷和癌症。由于后生动物在生物体中的核心重要性，因此后生动物进化出了一种精细的蛋白质机制，以确保适当的转录控制。过去十年的工作表明，调解人是这一监管机构的关键组成部分。介体是基因特异性转录因子和RNA聚合酶II之间的一个保守的多蛋白界面(Kornberg，2005年). 在这个功能中，Mediator用于引导来自激活蛋白和阻遏蛋白的调节信号，以影响控制不同生理过程的基因表达程序的变化，包括细胞生长和内环境稳定、发育和分化(Conaway等人，2005年;Malik和Roeder，2005年).

近年来，介体在转录激活中的作用已被广泛描述。在激活剂依赖性转录的启动和再启动阶段，介质已被证明可以促进核心启动子上转录复合物的组装、激活和再生(Kornberg，2005年;Malik和Roeder，2005年). 相对而言，对于介体在转录抑制中的作用知之甚少，尽管其抑制特性与一个由MED12/MED13/CDK8/CycC组成的可分离模块有关[以下简称MED12模块，因为我们和其他人已经证明MED12是CDK8/CycC稳定并入介体所必需的(Kim等人，2006年;Myer and Young，1998年)]. 一些证据支持MED12模块成分在转录抑制中的作用。首先，酿酒酵母和波姆裂殖酵母介体中的同源模块都与抑制酵母转录有关(比约克隆德和古斯塔夫松，2005年). 其次，富含MED12模块的哺乳动物介体制剂在体外抑制重组转录反应(Boyer等人，1999年;顾等人，1999年;Sun等人，1998年;Taatjes等人，2002年). 最后，哺乳动物转录因子C/EBPβ和维甲酸受体的转录抑制或信号激活形式已被证明分别招募含有或不含CDK8的介体作为靶基因启动子(Mo等人，2004年;Pavri等人，2005年). 总之，这些研究表明，介体的抑制功能主要来自其MED12模块内的成分。

在MED12模块中，CDK8/CycC被认为通过抑制激活物和一般转录因子的磷酸化而具有直接抑制活性(Akoulichev等人，2000年;傅兰雅等人，2004年). MED12和MED13的功能似乎更复杂，以前的研究支持这两个亚基在信号依赖性发育基因调控中的负（和正）作用重叠。因此，在秀丽隐杆线虫中，MED12和MED13抑制参与外阴细胞命运规范和不对称细胞分裂的Wnt和Ras靶基因，而在果蝇中，MED2和MED12分别抑制Wnt和Hedgehog靶基因，这些基因对眼睛和触角盘的分化至关重要(Janody等人，2003年;Moghal和Sternberg，2003年;特雷斯曼，2001;Yoda等人，2005年;张和埃蒙斯，2000). 最近，人类MED12被证明是Gli3依赖性声波刺猬信号的直接抑制物(Zhou等人，2006年). 因此，大量证据表明MED12可以作为信号和上下文相关的转录负调控因子发挥作用。尽管MED12抑制转录的机制基础尚不清楚，但最近对黑腹滨鹬MED12作为HOX基因抑制所需的新Polycomb群（PcG）基因的遗传鉴定表明，MED12与染色质之间存在潜在的有趣联系(Gaytan de Ayala Alonso等人，2007年). PcG蛋白在整个发育过程中以依赖翻译后组蛋白修饰（包括甲基化）的方式介导沉默染色质状态的表观遗传(Schuettengruber等人，2007年). 尽管如此，除了上述遗传关联外，迄今尚未确定MED12/介体是否以及如何在物理和功能上与组蛋白修饰活性相互作用以抑制转录，也未确定这种协同作用如何影响决定基本细胞过程的特定基因表达程序。

最近对脊椎动物的遗传学研究已经开始阐明高等后生动物中MED12/Mediator调节的发育和生物过程。这些研究揭示了MED12在神经系统细胞命运和功能规范中的重要作用。在斑马鱼斑马鱼中，MED12被证明是大脑和神经嵴以及其他器官正常发育所必需的，它通过选择性调节神经元基因表达，在单胺能神经元和颅感觉神经节的产生中起着重要作用(Hong等人，2005a; Hong等人，2005b；Rau等人，2006年;Wang等人，2006年). 在人类中，MED12多态性与神经精神疾病有关，包括精神分裂症和脓毒症，最近发现MED12突变可导致两种X连锁精神发育迟缓（XLMR）疾病，FG（也称为Opitz-Kaveggia）综合征和Lujan（或Lujan-Fryns）综合征(Philibert和Madan，2007年;Risheg等人，2007年;Schwartz等人，2007年). 尽管如此，MED12控制神经元基因表达的分子基础以及MED12基因变异引起行为和认知功能障碍的方式仍有待完全确定。

在此，我们确定了一个表观遗传学基础，将MED12/介体在转录抑制中的功能与其在神经元基因控制和XLMR中的作用联系起来。首先，我们确定并表征了一个功能相互作用网络，涉及MED12/介导子、G9a组蛋白甲基转移酶（HMTase）和神经元外基因沉默所需的RE1沉默转录因子（REST；也称为神经元限制性沉默因子，NRSF）。我们表明，介体中的MED12接口通过施加转录抑制组蛋白H3K9二甲基化，将REST与酶活性G9a连接起来，以沉默非神经元细胞中的REST靶基因。其次，我们发现MED12中的错义突变导致XLMR疾病FG综合征和Lujan综合征破坏其REST特异性辅升压功能。总之，这些发现在MED12/Mediator和表观遗传基因沉默之间建立了直接联系，揭示了MED12/Mediator在神经基因表达的谱系特异性限制中的基本生物学功能，并提示MED12-associated XLMR涉及REST依赖性神经元基因调节受损的病理基础。

结果

MED12和G9a在体内外相互作用

为了阐明MED12在转录控制中的功能，我们使用人胎脑cDNA文库通过酵母双杂交筛选处理MED12羧基末端（MED12C；aa 1715至2177）(Zhou等人，2006年)，并恢复了编码G9a HMTase的部分cDNA。G9a与GLP（G9a-like protein；also Eu-HMTase1）一起形成一种化学计量异聚物，负责常染色质中转录抑制H3K9的单甲基化和二甲基化(Peters等人，2003年;赖斯等人，2003年;Tachibana等人，2005年).

为了验证MED12和G9a之间的物理相互作用并绘制其相互结合域，我们测试了GST-MED12C或GST-全长G9a（aa 1–1001）分别与体外转录和翻译产生的放射性标记G9a或MED12截断衍生物结合的能力。该分析确定了每个蛋白质上的主要交互作用表面，包括MED12上的PQL结构域（aa 1616–2050）和G9上的Ankyrin重复结构域（aa 486–689），尽管G9a上的富含Cys的结构域（AA250–332）也与MED12弱结合(图1A;图S1和图S2). 我们使用纯化杆状病毒表达蛋白和联合免疫反应分析在体外证实了MED12和G9a之间的直接相互作用(图S3). 为了确定G9a和MED12在体内是否相互作用，我们检测了这两种蛋白在HeLa人宫颈癌细胞中异位表达后相互免疫沉淀的能力。该分析表明，只有在存在FLAG-MED12的情况下，FLAG-特异性抗体才能特异而有效地沉淀HA-G9a，但在不存在FLAG-MED12时，不会。相反，HA-特异性抗体仅在HA-G9a存在时沉淀FLAG-MED12，而在HA-G9不存在时沉淀(图1B). 这些结果证实了MED12和G9a在哺乳动物细胞中的相关性。

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MED12和G9a在体内外相互作用

（A） MED12和G9a上相互结合域的示意性总结。MED12（aa 1616–2050）上富含脯氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸（PQL）的结构域与G9a上富含半胱氨酸的结构域（aa 250–332）相比，与Ankyrin重复结构域（aa 486–689）的相互作用更强。

（B） 如图所示，在使用针对FLAG或HA表位的特异性抗体进行全细胞裂解物免疫沉淀（IP）之前，FLAG-MED12和HA-G9a在HeLa细胞中相互表达或不表达。免疫沉淀物通过SDS-PAGE溶解，并使用所示的FLAG或HA特异性抗体通过western blot（WB）分析处理。输入10%的核裂解物用于IP反应。

MED12是G9a HMTase可能的中介接口

为了确定G9a是否与介体相互作用，我们使用三种不同介体亚单位（MED4、MED30或CDK8）的特异性抗体从HeLa核提取物中免疫沉淀介体，并通过western blot分析检测免疫沉淀中是否存在G9a。我们很容易在用300 mM盐和0.2%NP-40洗涤的介体免疫沉淀物中检测到G9a，从而揭示G9a与介体在体内的特异性和相对严格的相关性(图2A;图S4和图S5). 进一步的分析表明，G9a与介体免疫沉淀物在各种严格的洗涤条件下（包括500 mM KCl、1%NP-40和0.5%DOC）的特异性（尽管减少）关联(图S5). 值得注意的是，G9a和Mediator之间的关联可能在广泛的人类细胞类型中保持不变，因为在另外两个人类细胞系中证实了这种相互作用，包括HEK293人类胚胎肾细胞系和BG-1人类卵巢腺癌细胞系(图S6).

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MED12可能是G9a HMTase的介体界面

（A） 如图所示，使用针对MED30的IgG或抗体对HeLa核裂解物进行IP处理。免疫沉淀物用300 mM KCl和0.2%NP-40清洗，然后用SDS-PAGE进行分离，并用指定抗体进行WB分析处理。输入10%的核裂解物用于IP反应。

（B） 在COS-7细胞中短暂表达DsRed-G9a和FLAG-Mediator亚单位后，监测它们的共定位。用Hoechst染色法观察DNA。

（C和D）HeLa核裂解物经IgG或G9a、MED4或MED30特异性抗体IP处理。免疫沉淀物在与S公司-腺苷-L-[甲基-三H] 蛋氨酸和核心组蛋白（C）或一组重组GST-H3 N末端（aa 1–84）携带指示的赖氨酸到精氨酸替代突变（D）。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术、WB或考马斯蓝染色进行可视化，如图所示。H3me，甲基化H3。

（E和F）转染对照（CNTL）、G9a-、MED12-、MED23-或CDK8-特异性siRNAs的HeLa细胞的核裂解物使用IgG或MED30或MED4特异性抗体进行IP，如图所示。在通过SDS-PAGE进行分离之前，按照（A）中的方法清洗免疫沉淀物，并使用指定抗体通过WB分析进行处理，或与S公司-腺苷-L-[甲基-三H] 甲硫氨酸和核心组蛋白（HMTase测定）。输入10%用于IP反应的核裂解物。H3me，甲基化H3。

为了进一步验证G9a和Mediator之间的体内相关性，我们监测了DsRed-G9a和FLAG标记的Mediator亚单位MED12、CDK8、MED30和MED8在COS-7猴肾成纤维细胞中异位表达后的亚核定位。G9a和每一个介体亚单位都发现于细胞核的常染色区（不包括核仁和异色区），它们在多个病灶中广泛共定位(图2B). 总之，这些结果为G9a和Mediator之间的体内关联提供了有力支持。

G9a属于SET域HMTase的SUV39家族，其成员特别是甲基化H3K9(Patnaik等人，2004年;Tachibana等人，2005年). 与G9a一样，HeLa核提取物免疫沉淀的介体在体外特异性甲基化核心组蛋白中的H3(图2C)，并表现出对非甲基化和单甲基化H3K9作为底物的偏好(图2D和图S7). 我们确认G9a是介体相关HMTase，这是因为在免疫沉淀分析之前，RNAi介导HeLa细胞中的G9a耗竭，同时降低了介体免疫沉淀中G9a的数量和H3 HMTase的活性水平(图2E). 值得注意的是，RNAi-mediated MED12敲除也降低了G9a的数量和与Mediator相关的H3 HMTase活性水平，从而揭示MED12可能是Mediator中的G9a接口(图2E). 因为MED12是CDK8/Cyc与Mediator关联的重要决定因素(图2E) (Kim等人，2006年)，我们还研究了CDK8敲除对G9a与Mediator关联的影响。RNAi介导的CDK8耗竭破坏了Mediator中CycC的稳定性，但没有破坏MED12的稳定性，并且对Mediator相关G9a的水平没有影响(图2F). 因此，伴随MED12敲除的G9a与介体的解离并不是来自CDK8/CyC的间接损失。此外，RNAi介导的MED23（介体中的一种不同亚单位）的敲除对介体相关G9a的水平没有影响(图2F). 综上所述，这些结果确定MED12可能是Mediator中与G9a进行物理和功能交互的接口。

RE1沉默转录因子（REST）引起的G9a-依赖性神经元基因沉默需要MED12/介体

为了探索介体/G9a相互作用的生物学后果，我们首先检测了其对二甲基化H3K9（H3K9me2）全局水平的需求，这是哺乳动物细胞中G9a主要调控的表观遗传学标记(Tachibana等人，2005年). MED12基因敲除对介体/G9a相互作用的破坏并没有改变H3K9me2的全球水平(图S8)这表明介体/G9a相互作用在限制性遗传位点上可能具有重要的功能。在这方面，G9a-directed H3K9me2先前已通过转录阻遏物（包括REST）的靶向募集参与基因特异性沉默，REST是一种关键的非神经元谱系阻遏剂，可抑制终末分化非神经元细胞中神经元基因的非特异性表达(Chong等人，1995年;Gyory等人，2004年;Roopra等人，2004年;Schoenherr和Anderson，1995年). 因此，我们研究了Mediator和G9a合作支持REST指导的转录抑制的可能性。

首先，我们研究了REST是否与哺乳动物细胞中的介体和G9a存在物理联系。已证明介体和G9a在体内形成免疫沉淀复合物(图2A和图S4–图S6)，我们测试了REST是否也可以与Mediator共免疫沉淀。HEK293细胞中外源性表达的Myc-tagged REST被MED30特异性抗体特异而有效地沉淀，证实了REST与体内介体之间的相互作用(图3A). 更重要的是，对含有内源性G9a的介体免疫沉淀物的分析也揭示了内源性REST的存在，这表明介体、G9a和REST在三种非神经元来源的不同细胞系HeLa、HEK293和BG-1中存在三种相互作用(图3B). 我们通过MED31/HeLa细胞核提取物中稳定表达FLAG-tagged MED31介体亚单位的相互顺序共免疫沉淀，验证了介体、G9a和REST之间的三聚体复合物的形成。因此，MED31/HeLa核提取物与FLAG-的系列免疫沉淀以及G9a-特异性抗体产生了包含介体、G9a和REST的末端免疫沉淀，从而揭示了所有三种物种都参与哺乳动物细胞中三聚体复合物的形成(图3C)

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MED12是REST和G9a依赖性神经元基因抑制所必需的

（A） 未转染（−）或转染（+）Myc-tagged REST的HEK293细胞核裂解物中MED30特异性介体免疫沉淀物通过SDS-PAGE进行解析，并使用指定抗体通过WB分析进行处理。输入5%用于IP反应的核裂解物。

（B） 携带G9a的MED30特异性介体免疫沉淀物（来自图2A和补充图S6)用REST特异性抗体重新绘制。

（C） 用SDS-PAGE溶解MED31/HeLa核裂解液中连续几轮IP产生的末端免疫沉淀物，随后产生G9a特异性抗体，并用指定抗体进行WB分析。输入，第一轮IP反应中使用的核裂解液的5%。

（D） 使用双荧光素酶分析系统，对连续转染对照、REST-、G9a-、MED12-、CDK8-或MED23-特异性siRNA的BG1细胞的全细胞裂解物以及随后转染TATA-Luc或RE1-TATA-Loc报告质粒的细胞裂解物进行标准化荧光素酶活性分析。荧光素酶活性的表达与转染TATA-Luc报告质粒的细胞中获得的荧光素酶活性有关，该报告质粒的值被任意指定为1。数据表示至少三个重复进行的独立实验的平均+/-SEM。星号表示相对于对照siRNA的统计显著值（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

（E） 来自用对照、REST-、MED12-、G9a-、MED23-或CDK8特异性siRNA转染的HeLa细胞的RNA用于RT-qPCR。mRNA水平相对于对照siRNA转染细胞中的mRNA水平进行表达，该值被任意指定为1。数据表示至少三个重复进行的独立实验的平均+/-SEM。星号表示相对于对照siRNA的统计显著值（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

（F） 在(D类)通过SDS-PAGE进行解析，并使用所示抗体进行WB分析，以验证击倒效率。

此后，我们检查了在REST定向抑制外体靶基因中对MED12/介体的需求。在BG-1细胞中，内源性REST抑制了含有RE1沉默元件的荧光素酶报告基因的表达，而另一个相同的报告基因缺乏RE1元件(图3D). 通过敲除REST，证实了本试验中REST定向报告基因的阻遏作用，这减轻了RE1元件的阻抑作用(图3D). 值得注意的是，G9a缺失也减轻了RE1元件的REST定向抑制，证实了G9a作为REST辅阻遏物的作用(Roopra等人，2004年) (图3D). 重要的是，Mediator中MED12的敲除，而不是CDK8或MED23的敲除也消除了报告基因的抑制，因此MED12/Mediator在RE1沉默元件的REST-directed，G9a-dependent的抑制中暗示了MED12/Mediator(图3D). MED12在REST定向阻遏中的需求是特定的，因为MED12敲除不会影响通过Gal4 DNA结合域连接到启动子DNA的CoREST的抑制活性(图S9). 因此，并非所有的抑制域都需要MED12。

接下来，我们检查了MED12/介体对REST指导的神经元基因在其天然染色体基因座中的神经元外沉默的要求。以前基于生物信息学的研究已经确定了近1000个人类基因，其中超过40%是神经表达的，在其转录区域的10kb内含有RE1沉默元件(Bruce等人，2004年). 在该列表中的七个神经表达基因中，RT-qPCR分析显示，在HeLa细胞中REST敲除后，有三个基因（M4、SNAP25和Synapsin1）被至少四倍地去表达，而四个基因（SCN2A2、nMDAR1、BDNF和TUBB3）的去表达低于两倍(图3E). 一些含有RE1的基因对REST敲除的难治性可能反映了它们各自对REST亲和力的内在差异(Bruce等人，2004年;Otto等人，2007年;Sun等人，2005年)和/或其他REST依赖性抑制机制的参与(Otto等人，2007年). 尽管如此，该分析确定M4、SNAP25和Synapsin1基因是REST定向神经元外沉默的可测量靶点。G9a的缺失也会引起这三个基因的去抑郁(图3E)，为支持G9a在REST定向神经元特异性基因的神经元外沉默中的重要作用提供了额外证据(Roopra等人，2004年). 值得注意的是，MED12的敲除，而不是CDK8或MED23的敲除也导致这三个REST靶基因的显著去表达，因此MED12/Mediator在REST定向、G9a依赖的神经元外基因沉默中的作用(图3E). 我们还证实了抑制BG-1细胞中REST靶基因的MED12需求，这表明MED12/介体在REST导向的神经元外基因沉默中具有广泛作用(图S10). CDK8敲除对REST靶基因表达没有影响(图3E)是重要的，因为MED12敲除破坏CDK8/CycC的稳定性，而CDK8敲除破坏CycC，但不破坏MED12(图3F). 因此，MED12敲低对REST靶基因表达的影响并不反映CDK8/CycC从介体的间接损失。此外，MED12敲除对REST的表达水平和任何已检测的共表达载体（包括CoREST、G9a、HDAC1、HDAC2、mSin3A、MeCP2、LSD1、HP1α、HP1β或HP1γ）均无明显影响(图3F和数据未显示）。总之，这些发现支持MED12/介体在REST定向G9a依赖性神经元特异性基因表达的神经元外沉默中的直接作用。

REST指导的G9a招募到RE1沉默元件需要MED12/介体

通过靶向募集G9a，REST导向的神经元基因沉默已被证明涉及在受抑制基因的RE1位点周围产生高度定位的H3K9me2结构域(Roopra等人，2004年). 这些G9a依赖的表观遗传标记具有促进转录抑制高阶染色质结构的功能。我们使用染色质免疫沉淀（ChIP）监测HeLa细胞中RE1沉默元件的转录因子结合和组蛋白甲基化情况，以及REST靶向M4、SNAP25和Synapsin1基因的上游基因序列。这些分析揭示了RE1元素在REST、酶活性G9a（通过G9a和H3K9me2的存在揭示）和介体（尤其是介体）中的特定占有率，而re-ChIP实验证实了共占有性(图4A和B).

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RE1沉默元素的REST定向G9a招募需要MED12

（A–D）从未转染的HeLa细胞（A和B）或转染对照、REST-、MED12-、G9a-、MED23-或CDK8-特异性siRNAs（如所示（C和D）的HeLa细胞制备的可溶性染色质，使用所示抗体[IgG:山羊（g）和兔（r）IgG]进行一轮（A、C和D。免疫沉淀染色质通过半定量（A和B）或定量（C和D）PCR分析，使用侧翼RE1元件的引物或M4、SNAP25和Synapsin1基因内的上游基因序列。在（C和D）中，每种蛋白质的RE1位点占有水平相对于其在对照siRNA转染的细胞中的占有水平来表达，其被任意赋予100%的值。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均+/-SEM。星号表示相对于对照siRNA的统计显著值（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

由于介体和G9a共占RE1沉默元件位于REST靶基因内，并且在物理上与REST导向的神经元基因阻遏相关并在功能上参与，我们试图研究介体是否以及如何对REST基因内RE1位点周围的G9a依赖性H3K9me2起作用。为此，我们使用RNAi和定量ChIP检测了作为MED12功能的M4、SNAP25和Synapsin1 RE1沉默元件的转录因子结合和组蛋白甲基化谱。首先，我们通过将REST和G9a的独立敲除与定量ChIP分析相结合，证实了REST和G9a在围绕RE1元素建立抑制染色质环境中的重要性。正如预期的那样，REST的消耗减少了REST本身以及G9a和H3K9me2对RE1元素的占用(图4C)证实了之前的发现，REST将酶活性G9a招募到非神经元细胞中其被抑制的靶基因中(Roopra等人，2004年). 值得注意的是，REST敲除还减少了介体对RE1元素的占用，从而揭示了REST在介体招募到其被抑制的靶基因中的作用(图4C). 有趣的是，REST基因敲除并没有通过其辅抑制剂CoREST影响RE1位点的占有率(图4C)可能是因为在没有REST的情况下，CoREST能够与核小体DNA结合(Lee等人，2005年;Yang等人，2006年). 正如预期的那样，G9a的消耗降低了H3K9me2的水平，而不影响REST或Mediator与RE1元素的关联(图4C). 引人注目的是，MED12的消耗显著降低了G9a对RE1元素的占有率，并降低了H3K9me2的水平，而不影响REST对RE1站点的占有率(图4C). 这些观察结果表明MED12/介体参与REST定向招募酶活性G9a。在对照实验中，MED23和CDK8耗竭均未减少G9a与RE1元素的关联，这证实了伴随MED12敲除的G9a的REST依赖性招募减少是特异性的，并不是源于介体CDK8/CycC的间接损失(图4D). 总之，这些结果表明MED12/Mediator在神经元基因表达的表观遗传沉默中将REST与G9a-HMTase联系起来。

REST、中介和G9a参与直接成对交互

为了阐明REST、Mediator和G9a之间的物理相互作用动力学，我们将纯化的蛋白质(图5A和B)体外配对结合试验。三个物种之间都有直接的相互作用；因此，REST直接绑定到Mediator和G9a(图5C和D)，而Mediator和G9a也直接相互作用(图5E). 所有三种成分之间的直接相互作用可能有助于RE1元件上多聚抑制复合物的组装，因为我们观察到体内REST定向G9a募集需要MED12/介体(图4C). 在REST上对介体和G9a结合域的描述确定了一个常见的内部REST片段（氨基酸141–600），其中包括DNA结合域和富含赖氨酸的域(图5C和D).

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REST、Mediator和G9a之间的直接成对交互

（A） 表达为GST融合蛋白的REST片段图。数字是指氨基酸坐标。NTRD、CTRD、8 X锌指、K和Pro分别指N-和C-末端阻遏结构域、锌指DNA-结合结构域和赖氨酸或脯氨酸富集结构域。

（B） 用于体外结合分析的纯化大肠杆菌表达的GST-REST、HeLa细胞介体（MED）和杆状病毒表达的G9a蛋白制剂。从稳定表达HA表位标记的MED6亚基的HeLa细胞中纯化介体(Kim等人，2006年).

（C和D）在使用指定抗体进行WB分析之前，将所示固定化GST或GST-REST衍生物与纯化介体（C）或G9a（D）以及通过SDS-PAGE解析的特定结合蛋白孵育。输入，10%的介体或G9a用于结合反应。

（E） 纯化介体和G9a在IP之前与MED6上G9a或HA表位的特异性抗体一起或不一起培养。免疫沉淀物通过SDS-PAGE溶解，并使用指定抗体通过WB分析进行处理。

MED12/介体和G9a-依赖性REST抑制域的识别

以前，REST被描述为一种包含不同N端和C端阻遏结构域的二分转录阻遏物，其功能分别是招募哺乳动物的Sin3A/HDAC和CoREST/LSD1共表达复合物(Andres等人，1999年;Grimes等人，2000年;Huang等人，1999年;Lee等人，2005年;Naruse等人，1999年;Roopra等人，2000年;Shi等人，2005年). 我们使用GST下拉法验证了离散REST域与HeLa核提取物中存在的不同共抑制物的独立关联。因此，对应于氨基酸1–140（包括N末端抑制结构域）、141–600和601–1098（包括C末端阻遏结构域）的GST-REST片段分别独立结合Sin3A/HDAC、Mediator/G9a和CoREST/LSD1核心抑制复合物的组分(图6A). 由于REST氨基酸141–600独立地与介体和G9a结合，我们询问该结构域是否具有自主抑制活性。当连接到异源Gal4 DNA结合域时，REST氨基酸141–600与已建立的N端和C端REST阻遏域类似地抑制转录(图6B和C). 此外，与N端和C端REST阻遏结构域相比，我们确认了REST 141–600所指示的阻遏的不同共抑制物要求，并与它们的差异共抑制物结合谱相一致。因此，REST 141–600的抑制活性需要MED12/Mediator和G9a(图6D和图S11)但不是HDAC(图6E)，而REST N端和C端抑制域的情况正好相反(图6D和E;图S11). 综上所述，这些发现确定了REST中MED12/介体和G9a依赖的内部抑制结构域，并建立了分子基础来解释REST定向神经元基因沉默中对介体和G9a的需求。

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REST中MED12/介体和G9a依赖的内部抑制域的描述

（A） 在使用指定抗体进行WB分析之前，将所示固定化GST或GST-REST衍生物与HeLa核裂解物和通过SDS-PAGE解析的特异结合蛋白孵育。输入10%的核裂解物用于结合反应。

（B） 通过SDS-PAGE解析（C）中代表性瞬时阻遏试验的全细胞裂解物，并使用Gal4 DNA-结合域或TFIIH p89亚单位特异性抗体作为内部负荷对照，通过WB分析进行处理。箭头表示Gal4-REST导数的相对位置，这些导数以大致相等的水平表示。

（C） HeLa细胞与G基因共转染5TK-Luc报告子在TK启动子上游携带五个Gal4-DNA-结合位点以及Gal4-DNA结合域（Gal4）或指示的Gal4-REST片段。使用双荧光素酶分析系统对转基因全细胞裂解物进行标准化荧光素酶活性分析。荧光素酶活性（RLU）的表达与转染Gal4的细胞中获得的荧光素酶活性有关，该细胞的荧光酶活性被任意指定为1。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/-SEM。星号表示相对于Gal4的统计学显著差异（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

（D） HeLa细胞在与pG共转染48小时前转染对照、MED12-或G9a-特异性siRNA5TK-Luc和Gal4或指示的Gal4-REST片段，以及随后对转染的全细胞裂解物进行标准化荧光素酶活性的分析。荧光素酶活性的表达与转染对照siRNA和Gal4的细胞中获得的荧光素酶活性有关。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/-SEM。星号表示具有统计学意义的差异（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

（E） pG共转染HeLa细胞5在检测转染的全细胞裂解物的标准化荧光素酶活性之前，用DMSO或HDAC抑制剂TSA（330 nM）处理TK-Luc和Gal4或指示的Gal4-REST片段。荧光素酶活性的表达与转染Gal4的DMSO处理细胞中获得的荧光素酶活性有关。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/-SEM。星号表示具有统计学意义的差异（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

MED12中XLMR相关错义突变破坏REST对神经元基因表达的表观遗传限制

最近，发现两种人类XLMR疾病FG综合征和Lujan综合征为等位基因，分别由两种不同的MED12错义突变R961W和N1007S引起(Risheg等人，2007年;Schwartz等人，2007年). 我们检测了MED12中这些突变破坏其REST特异性辅升压功能的可能性。将错义突变R961W（FG）和N1007S（Lujan）分别导入抗siRNA MED12衍生物（MED12r）中，并与野生型MED12r（MED12 r-WT）进行比较，以了解它们各自拯救因siRNA介导的内源性MED12抑制而受损细胞中REST依赖性抑制的能力。引人注目的是，FG/R961W和Lujan/N1007S突变都严重损害了MED12r拯救REST 141–600依赖性报告基因阻遏的能力，表明与XLMR相关的MED12的病理性突变破坏了其REST特异性辅升压功能(图7A和C). 相比之下，这两种突变都不影响MED12支持β-catenin反式激活的能力(Kim等人，2006年)从而揭示了与FG/R961W和Lujan/N1007S突变引起的MED12辅激活子功能相反的辅抑制因子的选择性缺陷(图7B). 作为这些实验的对照，MED12中PQL结构域的缺失对其与G9a和β-catenin的相互作用至关重要，这将破坏MED12在内源性MED12耗尽的细胞中拯救REST依赖性抑制和β-catanin依赖性激活的能力(图7A和B). 这些结果证实了该表面对MED12共调节器功能的重要性(Kim等人，2006年;Zhou等人，2006年;Zhou等人，2002年)，并进一步揭示MED12的REST特异性共表达子功能依赖于其与G9a的直接相互作用。

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MED12中与XLMR相关的错义突变破坏其REST特异性协同表达功能

（A和B）HeLa细胞转染对照（CNTL）或MED12特异性siRNA，随后转染内部对照SV40-β-半乳糖苷酶表达质粒和pG5TK-Luc和Gal4、Gal4-REST 141–600（A）或Gal4-β-catenin（B）。如有指示（MED12r），DNA转染还包括siRNA-resistant WT、FG、Lujan或ΔPQL突变MED12衍生物。正常化的荧光素酶活性相对于转染对照siRNA和Gal4的细胞中获得的荧光素酶活性进行表达，该值被任意指定为1。在（B）中，将对照siRNA转染的细胞中β-连环蛋白的相对萤光素酶活性设置为100%，产生相对反式激活水平（RTL）；MED12 siRNA-转染细胞中相应的反式激活水平与该值相关。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/−SEM。星号表示与MED12r WT（学生的t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

（C） 使用SDS-PAGE解析（A）中代表性瞬时击倒/拯救试验的全细胞裂解物，并使用MED12、MED12r衍生物上的FLAG表位或TFIIH的p89亚单位特异性抗体进行WB分析。

用对照（siCNTL）或MED12-特异（siMED12）siRNA转染（D–F）HeLa细胞。如有指示（MED12r），用siRNA-resistant WT、FG或Lujan突变型MED12表达质粒转染MED12敲除细胞。（D） 用Synapsin1-和M4特异性引物对转染细胞的RNA进行RT-qPCR。mRNA水平相对于对照siRNA转染细胞中的mRNA水平进行表达，该值被任意指定为1。（E和F）使用所示抗体对转染细胞的可溶性染色质进行IP处理。使用突触蛋白1和M4基因内RE1元件侧翼的引物，通过qPCR分析免疫沉淀染色质。每个蛋白质的RE1位点占用水平相对于其在对照siRNA-转染细胞中的占用水平进行表达，该值被任意指定为100%。数据表示至少三个重复进行的独立实验的平均+/-SEM。星号表示与MED12r WT（学生的t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).

为了研究MED12中FG和Lujan突变对体内REST靶基因表观遗传谱和表达水平的影响，我们比较了抗siRNA的WT MED12（MED12r）以及其相应的FG/R961W和Lujan/N1007S突变衍生物，以在MED12击倒细胞中恢复Synapsin1和M4基因中RE1元件上转录抑制G9a-依赖性H3K9me2的WT水平。这两种突变都损害了MED12介导REST定向G9a募集和转录抑制H3K9me2的能力(图7D–F)为MED12/Mediator与REST依赖性神经元基因沉默和XLMR之间的联系提供了额外证据。令人惊讶的是，MED12的两个突变也损害了RE1元件的介体招募(图7E和F). 由于两种突变均未显著影响MED12与G9a的相互作用(图S12)RE1元件的介体招募受损可能解释了这些突变如何破坏REST对神经元基因表达的表观遗传限制，因为MED12/Mediator对于将RE1-bound REST与G9a-dependent H3K9me2联系起来至关重要。

讨论

真核生物中的转录抑制是通过序列特异性DNA-结合转录阻遏物与共抑制因子的相互作用实现的，共抑制因子是直接或间接抑制核心启动子上转录起始复合物（PIC）组装的功能中介体。辅酶抑制剂被广泛分为与RNA聚合酶II及其一般转录因子直接接触以抑制PIC组装的辅酶抑制剂和修饰染色质从而促进核小体介导的启动子封闭的辅酶制剂。介体通常被认为是前一类共抑制因子的代表，先前的研究将其染色质非依赖性抑制功能归因于其固有的CDK8/CycC部分。因此，CDK8/CycC已被证明通过对基础转录机制的多种影响来抑制转录，包括磷酸化和随后对TFIIH激酶活性的抑制，以及通过直接阻断RNA聚合酶II结合(Akoulitchev等人，2000年;Elmlund等人，2006年). 尽管如此，介体是否以及如何在物理和功能上与染色质修饰活性协作以抑制转录，这一点以前还没有确定。我们的发现是，介体中的MED12接口将REST与G9a-依赖性H3K9me2连接起来，在介体和染色质修饰之间建立了直接联系，从而导致转录抑制。因此，这些研究表明，介体直接参与表观遗传基因沉默，并进一步揭示了介体在促进实施阻遏物驱动的转录限制性高阶染色质结构方面迄今未知的作用。

我们的研究进一步有助于阐明MED12在转录抑制中迄今为止仍然是一个模糊而复杂的功能。因此，虽然先前对后生动物模型的遗传学研究表明MED12参与基因表达的负调控(Janody等人，2003年;Moghal和Sternberg，2003年;张和埃蒙斯，2000)之前还不清楚MED12在这一过程中是否发挥直接或间接作用。我们发现MED12在神经元基因沉默中将REST与G9a联系起来，这为解释MED12对基因控制的直接抑制作用提供了明确的机制基础，也为MED12模块成分在基因表达负调控中的作用和要求提供了新的见解。迄今为止，MED12模块的抑制作用被归因于其CDK8/CycC部分，而MED12/MED13被归因于对确保锚定激酶活性至关重要的调节或结构作用。我们对不依赖CDK8/CycC的介体的MED12依赖性抑制功能的描述与最近对黑腹果蝇的遗传分析一致，该分析揭示了MED12模块成分的功能多样性以及MED12在发育基因调控中独立于CycC调节的CDK8活性的独特作用(Loncle等人，2007年).

本文将MED12鉴定为REST的辅抑制因子，对介体的生物学功能和REST依赖性神经元基因沉默的机制具有重要意义。REST由于能够沉默终末分化非神经元细胞中神经元特异性基因的表达，在非神经元谱系限制中起着核心作用(Ooi和Wood，2007年). 我们发现MED12/Mediator与REST和G9a在神经元外基因沉默中合作，这表明Mediator在将神经元基因表达靶向神经系统方面具有重要且迄今尚未被认识的功能。

从机制上讲，REST导向的神经元基因沉默归因于其通过不同的N端和C端结构域进行靶向募集，多种酶促多样的辅阻遏物，协同作用以微调组蛋白乙酰化和甲基化动力学以及整体表观遗传特征相关的REST表达基因(Ooi和Wood，2007年). 我们对包含氨基酸141–600的REST中MED12/介体和G9a依赖性内部抑制域的描述表明，REST本身比最初认为的更复杂，并且大大扩展了REST抑制神经元基因表达的功能相互作用网络。值得注意的是，REST中的这个区域以前被认为具有转录抑制功能，尽管这种活动的机制基础尚未建立(Roopra等人，2000年). 我们发现Mediator和G9a与REST 141–600在物理和功能上相互作用，这不仅为该域的抑制活性奠定了分子基础，而且扩展了REST作为招募和定向部署功能多样的染色质修饰物的综合中枢的概念。需要进一步研究以建立基本的相互作用动力学，包括MED12/Mediator在内的更广泛的REST共表达网络的各个组成部分通过该相互作用动力学来协调功能和可能的串扰，从而对REST靶基因表达施加表观遗传限制。

除了在调节染色质结构方面的作用外，据报道REST还通过直接作用于RNA聚合酶II及其辅助转录因子来抑制神经元基因表达。例如，REST直接与TATA盒结合蛋白结合以抑制转录前起始复合物（PIC）的形成(Murai等人，2004年)和RNA聚合酶II小CTD磷酸酶抑制聚合酶活性(Yeo等人，2005年). 由于介体能够直接与REST和RNA聚合酶II相互作用，可以想象，介体可以帮助REST抑制PIC，甚至可能将这种活性与REST导向的染色质重塑相协调。需要进一步研究来区分这些可能性。

在包含人类介体的30个亚单位中，MED12是唯一一个遗传变异与神经精神疾病和认知功能障碍相关的亚单位。我们发现MED12中的FG/R961W和Lujan/N1007S错义突变破坏了其REST特异性共表达子功能，这是首次描述与这些突变相关的功能缺陷。值得注意的是，我们发现这两种突变都损害了介体向RE1元件的募集，对MED12/G9a相互作用几乎没有影响，这为解释这些突变如何破坏REST对神经元基因表达的表观遗传学限制提供了一个合理的机制基础。因此，介体招募受损（本文确定为RE1-bound REST和G9a之间的重要联系）导致G9a招募减少，G9a依赖性H3K9me2水平降低，REST靶基因表达降低。MED12中的FG和Lujan突变损害RE1元件的介体招募的潜在基础尚待阐明，但可能涉及MED12/Mediator中的构象变化以及MED12以外的介体中REST靶亚单位的掩蔽，到目前为止，我们还无法将其确定为REST的直接接口。还需要进一步的研究来验证这一预测，并建立MED12中FG和Lujan突变损害RE1元件介体招募的决定性基础。

我们发现MED12中的FG/R961W和Lujan/N1007S错义突变破坏了REST对神经元基因表达的复合限制，这为解释MED12在XLMR中的作用提供了一个可能的表观遗传学观点。因为REST和MED12都与神经元发育有关(Ballas等人，2005年; Hong等人，2005b；Kuwabara等人，2004年;Rau等人，2006年;Wang等人，2006年)，由于MED12的病理突变而引起的REST靶基因的失调可能会影响神经元分化，并可能导致XLMR。在这方面，我们注意到REST交互组的其他成员与精神发育迟滞（MR）有关(Kleefstra等人，2006年;Tahiliani等人，2007年). 编码H3K9 HMTase GLP/Eu-HMTase1（G9a的化学计量结合伙伴）的基因突变/缺失导致的单倍体不足已被证明是以严重MR为特征的9q34亚群缺失综合征的病因，而H3K4组蛋白去甲基酶SMCX/JARID1C的突变与XLMR有关(Kleefstra等人，2006年;Tahiliani等人，2007年). 然而，这两种蛋白的病理性突变对REST依赖性抑制活性的影响尚不清楚。我们的发现将改变的REST阻遏物功能与MED12中XLMR相关突变联系起来，可以为更广泛的REST共表达网络中的病理缺陷如何导致MR提供范例。

总之，我们的工作揭示了与XLMR相关的MED12的病理突变破坏了其作为REST导向的G9a依赖性神经元外基因沉默介体的新确定作用。这些发现为介体在神经系统神经元基因表达的表观遗传限制中建立了新的功能，并为介体转录抑制机制以及MED12相关XLMR综合征的病因提供了新的线索。

实验程序

酵母双杂交筛选

前面已经描述了使用人类胎脑cDNA文库通过酵母双杂交筛选处理MED12羧基末端（MED12C；aa 1715至2177）(Zhou等人，2006年). 从~2×106筛选出的独立克隆，我们鉴定出60个点击，代表21个不同的cDNA，其中3个对应G9a HMTase。

质粒

pRC/CMV-hMED12、p3XFLAG-CMV-hMED12和pcDNA3.1-HA-hG9a哺乳动物表达质粒(Gyory等人，2004年;Kim等人，2006年)、TATA-Luc和RE1-TATA-Lac报告质粒(Kuwabara等人，2004年)和用于GST下拉分析的MED12截断衍生物(Kim等人，2006年)都已经描述过了。通过使用QuickChange II定点突变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA）对p3XFLAG-hMED12进行定点突变，产生了siRNA抗性的MED12 WT、FG、Lujan和ΔPQL突变体。使用基于PCR的策略将G9a截断衍生物亚锥化为pCS2+、G9a（aa 1–1001）和MED12C，并将REST截断衍生物亚圆锥化为pGEX4T-2、pM3或pBind载体，如图所示。

瞬时报告和基因表达分析

细胞培养、转染、RNA干扰和RT-qPCR分析的条件和程序见补充实验程序.

蛋白质相互作用和活性分析

co-IP、GST下拉、免疫荧光和HMTase分析的条件和程序如补充实验程序.

染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀基于Upstate Biotechsolgoy开发的标准方案(网址：www.millipore.com)经重大修改后，抗体和引物序列如补充实验程序.

补充材料

01

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致谢

我们感谢Y.Shinkai、D.Anderson、J.Conaway、R.Conawy、M.Garabedian、M.Horwitz、T.Kuwabara、G.Mandel、A.Roopra和K.Wright提供试剂，感谢N.Buckley讨论RE1位点的基因组位置，感谢M.Carey、Y.Shingai、P.R.Yew和Boyer实验室成员提供建议和意见。这项工作得到了美国国家癌症研究所（TGB）公共卫生服务拨款CA-0908301的支持，并得到了美国陆军国防部BCRP拨款DAMD17-03-1-0272和DAMD17-01-0584的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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