脂质研究杂志。2008年12月；49(12): 2545–2556.
小鼠脑肿瘤线粒体中的心磷脂和电子传递链异常：支持Warburg癌症理论的脂质学证据*
,* ,† ,† ,*和1,*
迈克尔·基比什
*马萨诸塞州Chestnut Hill波士顿学院生物系
杰弗里·庄
*马萨诸塞州Chestnut Hill波士顿学院生物系
托马斯·塞弗里德
*马萨诸塞州Chestnut Hill波士顿学院生物系
*马萨诸塞州Chestnut Hill波士顿学院生物系
†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科
收到日期：2008年6月18日；2008年8月5日修订；2008年8月13日修订
摘要
奥托·沃伯格（Otto Warburg）首先提出癌症起源于线粒体呼吸的不可逆损伤，但这种损伤的结构基础尚不清楚。心磷脂（CL）是一种复杂的磷脂，几乎只存在于线粒体内膜中，与维持线粒体功能和膜完整性密切相关。CL异常可损害线粒体功能和生物能量学。我们使用鸟枪脂质组学分析了来自C57BL/6J（B6）和VM/Dk（VM）近交系的高纯度脑线粒体中的CL含量和组成，以及来自这些菌株的皮下生长的脑肿瘤，包括星形细胞瘤和室管膜母细胞瘤（B6肿瘤）、干细胞瘤和两个微胶质瘤（VM肿瘤）。在所有肿瘤中发现CL含量或成分的主要异常。成分异常涉及大量未成熟分子物种和成熟分子物种的不足，表明CL合成和重塑存在重大缺陷。肿瘤CL异常也与个体和相关电子传递链活性的显著降低有关。为了便于数据解释，开发了一个数学模型。讨论了我们的发现对Warburg癌症理论的影响。
关键词：代谢、肿瘤发生、致癌、生物能量学
奥托·沃伯格首先提出癌症的主要原因是能量代谢受损(1,2). 这种损伤涉及细胞呼吸的不可逆损伤，随后逐渐依赖发酵（糖酵解）能量来补偿呼吸损失的能量。细胞活力需要ATP水解的恒定δG′约为−57 kJ/mol(三,4). 大多数正常哺乳动物细胞通过呼吸达到这一水平的可用能量，而肿瘤细胞通过呼吸和糖酵解的结合达到这一水平(2,5). 事实上，糖酵解升高是几乎所有肿瘤（包括脑肿瘤）的代谢特征，也是使用标记葡萄糖类似物进行肿瘤成像的基础(5–8). 然而，围绕Warburg理论有很多争议，主要是关于牧场效应和有氧糖酵解的问题(9–14). 肿瘤细胞线粒体发生大量结构和生化异常，可能损害功能，从而迫使细胞依赖糖酵解生存(5,6,9,15–17). 虽然一些先前的研究已经评估了肿瘤线粒体的脂质组成(18–25)之前的研究没有评估从脑肿瘤及其原位宿主组织分离的高纯度线粒体中心磷脂（CL）的含量和组成。
CL（1,3-二磷脂酰-锡-甘油）是一种复杂的线粒体特异性磷脂，可调节多种酶的活性，尤其是与氧化磷酸化和耦合呼吸有关的酶(26–31). CL结合络合物I、III、IV和V并稳定超络合物（I/III/IV和II/III/IV），证明CL对这些酶络合物的催化活性具有绝对需求(27,29,32,33). CL将泵送的质子限制在其头部基团结构域内，从而为线粒体膜电位提供结构基础，并为ATP合成酶提供质子(26,30). 呼吸酶复合物I和III的活性及其相关活性与CL含量直接相关(29,34,35). 呼吸酶复合物的活性也取决于CL分子种类组成(30). 事实上，CL不饱和度与呼吸状态1-3有关(31,36). CL包含两个磷酸头部基团、三个甘油部分和四个脂肪酰基链(). 最近在哺乳动物脑线粒体中检测到近100种CL分子(37,38). 此外，当根据FA链长和不饱和度排列时，这些分子物种形成了由七个主要基团组成的独特模式(38). 有趣的是，B6脑线粒体的CL模式在哺乳动物物种中是保守的(37). 与B6小鼠相比，VM小鼠的大脑CL分子种类分布异常，这可能与该菌株自发性胶质瘤的高发病率有关(39).
心磷脂（CL）（1,1′，2,2′-四油基心磷脂）的结构。这是小鼠脑线粒体中存在的100多种CL分子之一。
CL分子物种的复杂性是通过合成和重塑来调节的。磷脂酰甘油和CDP-二酰基甘油的缩合产生未成熟的CL，其主要包含短链饱和和单不饱和脂肪酰基链（棕榈酸和油酸）。然后，未成熟的CL通过特定脂肪酶和酰基转移酶/转氨酶的协同活性被重塑成成熟的CL，这两种酶分别从锡-供体胆碱和乙醇胺甘油磷脂的2位(39–41). 我们最近发现，大脑CL分子物种的复杂模式来自一个简单的重塑过程，其中涉及随机的FA掺入(38).
神经肿瘤中磷脂和FA组成的改变已有报道(42–44). 这些改变可能影响可用于CL重塑的FA。在本研究中，我们使用鸟枪脂质组学分析了来自C57BL/6J（B6）和VM/Dk（VM）近交系以及来自这些菌株的皮下生长脑肿瘤的高纯度脑线粒体中的CL含量和组成。同基因B6脑肿瘤由化学诱导，包括星形细胞瘤（CT-2A）和室管膜母细胞瘤（EPEN）(45). 同基因VM脑肿瘤自发发生，包括两个微胶质瘤（VM-M2和VM-M3）和一个干细胞肿瘤（VM-NM1）(46). 我们的结果表明，这些小鼠脑肿瘤含有每种肿瘤类型所特有的CL异常，这些异常与电子传递链（ETC）活性缺陷有关。我们的结果表明，异常CL可能是肿瘤中不可逆呼吸损伤的基础，并且它们将线粒体脂质缺陷与Warburg癌症理论联系起来。
材料和方法
材料
合成的1,1′，2,2′-四肉豆蔻酰心磷脂（T14:0 CL）购自Avanti Polar Lipids，Inc.（Alabaster，AL）。用于样品制备和质谱分析的溶剂来自Burdick和Jackson（Honeywell International，Inc.，Muskegon，MI）。所有其他化学试剂至少具有分析等级或可用的最佳等级，并从Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）或Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）处获得。
老鼠
VM小鼠来自爱丁堡大学H.Fraser教授。B6小鼠来自杰克逊实验室（缅因州巴尔港）。两种菌株的小鼠年龄（4个月）和性别（雄性）匹配，并在波士顿学院动物设施的类似条件下繁殖。老鼠被关在装有Sani-Chip床上用品的塑料笼中（P.J.Murphy Forest Products Corp.，Montville，NJ）。房间在12小时的光/暗循环中保持在22°C。随意提供食物（Prolab RMH 3000；印第安纳州里士满PMI LabDiet）和水。这项研究是根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行的，并得到了机构动物护理委员会的批准。
肿瘤
如前所述，CT-2A和EPEN脑肿瘤最初是通过在B6小鼠的大脑中植入20-甲基胆蒽而产生的(45,47). CT-2A肿瘤最初于1985年从大脑皮层分离出来，其特征是恶性间变性星形细胞瘤，而EPEN肿瘤于1949年从脑室分离出来，特征是室管膜母细胞瘤(45,48). 如前所述，1993年至2000年，三只不同的成年VM小鼠的大脑中自发出现了VM-NM1、VM-M2和VM-M3肿瘤(46). VM-NM1是一种具有神经干细胞特征的快速生长的非转移性肿瘤。VM-M2和VM-M3肿瘤是起源于小胶质细胞/巨噬细胞的高侵袭性/转移性肿瘤，具有多形性胶质母细胞瘤的特征(46).
雄性小鼠（8-12周龄）被用作肿瘤受体。将供体小鼠的肿瘤切片切块，并在pH 7.4的冷PBS中重新悬浮。用异氟醚（Halocarbon，River Edge，NJ）麻醉小鼠，用1 cc结核菌素注射器和18号针头注射，将0.1 ml悬浮在0.2 ml PBS中的切块肿瘤组织植入右侧皮下。
线粒体分离
如前所述，使用间断Ficoll和蔗糖梯度分离非突触小鼠脑或肿瘤线粒体(38,39). 获得了高度富集的线粒体部分，并用于脂质组学分析以及ETC酶活性。
质谱分析样品制备
将一等分纯化线粒体转移到一次性培养硼硅酸盐玻璃管（16 mm×100 mm）中。根据蛋白质浓度将内部标准物T14:0 CL（3 nmol/mg蛋白质）添加到每个纯化的线粒体匀浆中，从而使最终量化的脂质含量标准化为蛋白质含量，以消除样品之间的差异。如前所述，通过改良的Bligh和Dyer程序提取每个线粒体匀浆中的脂质(37,49). 用500μl/mg蛋白质在CHCl中重新配制每种脂质提取物三-甲醇（1:1；v/v）。用氮气冲洗脂质提取物，加盖，并在−20°C下储存，以进行电喷雾电离/质谱（ESI/MS）分析。在输液和脂质分析之前，将每种脂质溶液稀释约50倍。
仪表和MS
CL的高分辨率霰弹枪脂质组学分析是在三级四极杆（QqQ）质谱仪（Thermo Scientific，San Jose，CA）上进行的，该质谱仪配备了离子喷射离子源，如前所述(50). 所有ESI/MS光谱分析均通过直接输注进行，采用哈佛注射泵，流速为4μl/min。通常，每个质谱或串联质谱分别采用1分钟或2分钟的信号平均值。对于QqQ质谱仪的产物离子分析，前驱体离子由第一个四极杆选择，质量窗口为0.7 Th。所有质谱和串联质谱均由Xcalibur软件下操作的自定义子例程序列自动获取(51).
电子传递链酶活性
提纯的线粒体样品在用于酶分析之前冻融三次，以使底物进入线粒体内膜。所有分析均在温度控制的SpectraMax M5平板阅读器（分子设备）上进行，一式三份。使用ETC复合抑制剂计算特定酶活性，以减去背景活性。
如前所述，通过测量340 nm处NADH浓度的降低来测定复合物I（NADH-泛醌氧化还原酶）的活性(52,53). 在含有50 mM磷酸钾（pH 7.4）、2 mM KCN、5 mM MgCl的缓冲液中进行分析2、2.5 mg/ml BSA、2μM抗霉素、100μM癸基辅醌和0.3 mM K2NADH公司。通过加入纯化的线粒体（20μg）引发反应。测定酶活性5分钟，并在反应开始30秒后记录数值。在存在或不存在1μM鱼藤酮（复合I抑制剂）的情况下，通过计算线性范围内的反应斜率来确定比活性。
复合物I/III（NADH细胞色素c还原酶）活性通过在550 nm处测量氧化细胞色素c的还原来测定。在缓冲液[50 mM磷酸钾（pH 7.4）、1 mM EDTA、2 mM KCN、32μM氧化细胞色素c和105μM K2NADH]，并通过添加纯化线粒体（10μg）启动。在存在或不存在1μM鱼藤酮和2μM抗霉素（复合I和III抑制剂）的情况下，以线性斜率测量反应30 s(52–54).
复合物II/III（琥珀酸细胞色素c还原酶）活性在550 nm处氧化细胞色素c还原后测定。使用纯化线粒体（10μg）在缓冲液[25 mM磷酸钾（pH 7.4）、20 mM琥珀酸盐、2 mM KCN、2μg/ml鱼藤酮]中进行复合物II/III分析。在存在或不存在2μM抗霉素（复合物III抑制剂）的情况下，通过添加40μM氧化的细胞色素c引发反应(52,53).
线粒体ETC活性与CL含量和组成的关系
由于线粒体ETC活性取决于CL的含量和组成，我们将ETC活性建模为小鼠脑肿瘤中CL含量和组成的函数。两个主要变量包括1)总CL含量和2)CL分子种类在线粒体中的分布。有关分子种类分布的信息被简化为一个数字，它描述了肿瘤线粒体的CL组成与来自宿主小鼠株的脑线粒体CL组成的关系程度。这一数字是作为皮尔逊生产-时刻相关性生成的。我们没有使用相关系数作为显著性的统计度量，而是仅使用相关系数来评估从宿主小鼠脑线粒体到肿瘤线粒体的CL的“成分相似性”程度。低系数表明宿主脑线粒体和肿瘤线粒体的CL分子种类组成不同。高相关性表明宿主脑和肿瘤线粒体之间的CL基因种类组成相似。
使用以下公式将每个ETC活性（复合物I、复合物I/III和复合物II/III）与CL含量和组成关联。
我们将给定ETC酶复合物的活性建模为三项之和。第一学期(一1内容）是基于以下假设，即ETC活动将随着CL含量的减少而减少。第二任期(一2含量×相关性）是基于ETC活性与CL含量和分子物种分布相关的假设。第三任期(c)是一个常数，表明与CL无关的酶活性的基础水平一1,一2、和c在R统计编程环境中计算(55)对于使用B6数据的每个复合体。然后我们考虑了B6和VM ETC活性是否与CL含量和分子分布有类似的生化依赖性。我们通过在B6-fit二次曲面上绘制VM数据来测试这一点。为了同时绘制数据，我们将VM数据垂直移动，以最佳拟合B6曲面。换句话说，最佳虚拟机c对每个复合物的值进行拟合，以最小化与B6表面的平方偏差。这种转变是必要的，因为VM大脑的CL模式与B6大脑的不同(39). 亲戚c复合物I在B6和VM菌株中的值分别为−30.277和−343.775。亲戚c复合物I/III的值分别为+1.306和-115.125。亲戚c复合物II/III的值分别为+21.634和−51.15。我们发现VM数据显示出与B6-fit表面一致的定性行为。
结果
我们使用多个不连续梯度从正常大脑和脑肿瘤组织中获得高纯度线粒体。长度以及使用的不连续梯度的选择是为了线粒体脂质分析以及通过标准生化程序评估ETC酶活性而设计的(38). 我们最近表明，当使用鸟枪脂质组学进行分析时，这些分离程序可以提供线粒体总脂质含量和组成的精确信息(38,39). 为了避免肿瘤周围正常脑组织的污染，从皮下生长的脑肿瘤中分离出线粒体。因为所分析的肿瘤来源于神经干/祖细胞或胶质细胞(45,46,56)比较同基因小鼠脑肿瘤线粒体和非突触体线粒体的CL。我们对纯化线粒体的分析也消除了肿瘤组织和正常组织线粒体含量差异的问题(57). 因为B6和VM小鼠品系的CL组成不同(39)，我们的对比分析是在宿主菌株和该菌株中产生的同基因肿瘤之间进行的。
CT-2A和EPEN肿瘤的CL异常
CT-2A和EPEN肿瘤线粒体中的CL含量显著低于对照B6小鼠脑中的非突触线粒体(). 在B6小鼠的非突触体线粒体中有近100种CL分子(38). 当按照质量电荷比排列时，这些分子物种形成了一个独特的模式，由七个主要基团组成(和). 组I主要包含短链饱和或单不饱和脂肪酸，而组V-VII主要包含长链PUFA(38). 短链饱和或单不饱和FA表示CL不成熟，而长链PUFA表示成熟CL。CL分子物种在CT-2A和EPEN线粒体中的分布与B6非突触线粒体中的差异显著(). 以B6非突触体线粒体与CT-2A和EPEN肿瘤线粒体之间的相关系数表示的CL分子种类分布的相关程度分别为0.098和0.419。CT-2A在第IV、V和VII组中缺失了大多数分子物种，同时在第I组及其周围也表达了丰富的物种。CL分子物种在第II、III和VI组中的分布也异常，EPEN线粒体中的CL分布还包括I组及其周围物种的丰富性和III–VII组物种的缺乏性。CT-2A和EPEN肿瘤的分子种类总体分布也不同。
小鼠脑和脑肿瘤线粒体中的CL含量。按照材料和方法中的描述分离线粒体。数值表示为来自大脑或肿瘤组织的三种独立线粒体制剂的平均值±SD。星号表示肿瘤值与B6或VM脑值在*P（P）<0.01或**P（P）<0.001水平，由双尾确定t吨-测试。
CL分子物种在小鼠脑和脑肿瘤线粒体中的分布。A：分布在B6小鼠脑、CT-2A和EPEN肿瘤中。B： VM-NM1、VM-M2和VM-M3肿瘤在VM小鼠脑内的分布。CL分子物种是根据基于百分比分布的质量电荷比排列的，并如我们前面所述细分为七个主要类群(38). 正常大脑和肿瘤线粒体中相应分子种类的质量含量可以在所有数值均表示为三种独立线粒体制剂的平均值，其中每种制剂共有六个皮质或肿瘤。
表1。
| [M-2H]- | 分子物种 | B6大脑 | CT-2A型 | 欧洲电力公司 | VM大脑 | 虚拟机NM1 | 虚拟机M2 | 虚拟机M3 |
|---|
| 684.95 | 18:1-16:1-16:1-16:1 | | | 0.04±0.01 | 0.94±0.31 | | | |
| 685.96 | 18:1-16:1-16:1-16:0 | | 1.31±0.03 | | 1.24±0.48 | | | |
| 686.97 | 18:1-16:1-16:0-16:0 | | 1.06±0.26 | | 0.88±0.19 | 1.05±0.30 | | |
| 698.97 | 18:2-18:1-16:1-16:1 | | 1.14±0.12 | 0.17±0.01 | 0.77±0.29 | 0.88±0.02 | 0.92±0.11 | 0.59±0.14 |
| 699.98 | 18:1-18:1-16:1-16:1 | 0.30±0.03 | 1.33±0.34 | 0.26±0.05 | 0.95±0.14 | 0.63±0.05 | 1.29±0.08 | 0.58±0.12 |
| 700.99 | 18:1-18:1-16:0-16:1 | 0.31±0.05 | 1.08±0.23 | 0.32±0.07 | 0.97±0.35 | 0.51±0.09 | 0.97±0.17 | 0.59±0.21 |
| 18:2-18:1-16:0-16:0 | | | | | | | |
| 18:2-18:0-16:1-16:0 | | | | | | | |
| 701.99 | 18:1-18:1-16:0-16:0 | 0.24±0.04 | 0.87±0.17 | 0.44±0.11 | 0.65±0.29 | 0.47±0.03 | 1.14±0.17 | 0.67±0.25 |
| 18:2-18:0-16:0-16:0 | | | | | | | |
| 18:1-18:0-16:0-16:1 | | | | | | | |
| 709.96 | 20:4-18:2-16:1-16:1 | 0.09±0.01 | | 0.17±0.07 | | | | 1.03±0.39 |
| 710.97 | 20:4-18:1-16:1-16:1 | 0.41±0.06 | 1.25±0.17 | 0.24±0.01 | | | | 2.02±0.12 |
| 20:4-18:2-16:1-16:0 | | | | | | | |
| 711.98 | 20:4-18:1-16:1-16:0 | 0.45±0.06 | 1.62±0.11 | 0.46±0.09 | 0.95±0.28 | 1.91±0.02 | 2.35±0.16 | 1.51±0.23 |
| 18:2-18:2-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 712.99 | 18:2-18:1-18:1-16:1 | 0.71±0.02 | 1.91±0.07 | 0.73±0.17 | 1.62±0.05 | 1.92±0.11 | 1.04±0.15 | 1.00±0.19 |
| 18:1-18:1-18:1-16:2 | | | | | | | |
| 18:2-18:1-18:0-16:2 | | | | | | | |
| 18:2-18:2-18:0-16:1 | | | | | | | |
| 713.99 | 18:1-18:1-18:1-16:1 | 1.47±0.23 | 2.00±0.63 | 0.75±0.15 | 3.34±0.73 | 1.35±0.08 | 1.99±0.31 | 1.33±0.20 |
| 18:2-18:1-18:1-16:0 | | | | | | | |
| 715 | 18:1-18:1-18:1-16:0 | 0.68±0.04 | 1.57±0.30 | 0.39±0.08 | 1.30±0.09 | 0.59±0.08 | 1.34±0.08 | 0.76±0.15 |
| 18:0-18:1-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 716.01 | 18:0-18:1-18:1-16:0 | 0.09±0.02 | | 0.17±0.05 | | 0.76±0.43 | | |
| 18:0-18:0-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 721.96 | 20:4-20:4-16:1-16:1 | 0.23±0.03 | | 0.27±0.08 | | | | |
| 722.97 | 20:4-20:4-16:1-16:0 | 0.36±0.03 | | 0.18±0.05 | | 0.60±0.10 | | |
| 20:4-18:2-18:2-16:1 | | | | | | | |
| 723.98 | 20:4-18:2-18:1-16:1 | 0.95±0.08 | 1.36±0.21 | 0.65±0.14 | 2.01±0.13 | 2.24±0.19 | 1.42±0.32 | 7.42±1.09 |
| 724.99 | 20:4-18:2-18:1-16:0 | 2.22±0.17 | 1.61±0.31 | 1.07±0.19 | 3.08±0.34 | 3.38±0.14 | 1.35±0.11 | 6.07±0.44 |
| 20:4-18:1-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 725.99 | 20:4-18:1-18:1-16:0 | 1.74±0.13 | 2.09±0.04 | 1.42±0.31 | 2.46±0.26 | 3.93±0.29 | 1.58±0.05 | 3.83±0.65 |
| 20:3-18:1-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 727 | 18:2-18:1-18:1-18:1 | 2.48±0.33 | | 0.77±0.15 | 3.73±0.18 | 1.52±0.13 | 1.35±0.40 | 1.90±0.22 |
| 728.01 | 18:1-18:1-18:1-18:1 | 3.72±0.72 | | 0.32±0.05 | 5.13±0.95 | 0.65±0.09 | 1.33±0.33 | 0.97±0.17 |
| 729.02 | 18:1-18:1-18:1-18:0 | 0.30±0.03 | | 0.11±0.03 | 0.75±0.26 | 0.33±0.06 | | |
| 733.96 | 22:6-20:4-16:1-16:1 | 0.14±0.02 | | 0.04±0.01 | | | | |
| 734.97 | 20:4-20:4-18:2-16:1 | 0.56±0.06 | | 0.07±0.02 | | | | |
| 735.98 | 20:4-20:4-18:1-16:1 | 1.41±0.16 | | 0.20±0.05 | 2.29±0.67 | 0.63±0.11 | | |
| 736.99 | 20:4-20:4-18:1-16:0 | 2.11±0.07 | 1.00±0.07 | 0.41±0.14 | 2.78±0.42 | 1.18±0.10 | 2.38±0.62 | 1.23±0.26 |
| 22:6-18:1-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 22:6-18:2-18:1-16:0 | | | | | | | |
| 737.99 | 20:4-18:2-18:1-18:1 | 2.68±0.37 | 1.20±0.28 | 0.46±0.10 | 3.52±0.65 | 1.21±0.25 | 2.32±0.54 | 1.67±0.26 |
| 22:6-18:1-18:1-16:0 | | | | | | | |
| 739 | 20:4-18:1-18:1-18:1 | 3.30±0.45 | | 0.39±0.11 | 3.71±0.45 | 0.81±0.08 | 1.27±0.15 | 1.61±0.25 |
| 740.01 | 20:4-18:1-18:1-18:0 | 1.07±0.14 | | 0.19±0.04 | 1.62±0.30 | 0.94±0.38 | 2.08±0.85 | 3.35±0.62 |
| 20:3-18:1-18:1-18:1 | | | | | | | |
| 741.02 | 20:4-18:1-18:0-18:0 | 0.25±0.08 | | 0.10±0.02 | | | | 2.34±0.30 |
| 20:3-18:1-18:1-18:0 | | | | | | | |
| 746.97 | 22:6-18:3-18:2-18:2 | 0.40±0.04 | | | | | | |
| 747.98 | 20:4-20:4-18:2-18:2 | 1.38±0.09 | | 0.25±0.04 | | | | 2.81±0.47 |
| 20:4-20:4-20:4-16:0 | | | | | | | |
| 22:6-20:4-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 22:6-22:6-16:0-16:0 | | | | | | | |
| 22:6-18:2-18:2-18:2 | | | | | | | |
| 748.99 | 20:4-20:4-18:2-18:1 | 1.99±0.19 | | 0.19±0.03 | | | | |
| 749.99 | 20:4-20:4-18:1-18:1 | 3.24±0.24 | | 0.26±0.04 | | | | |
| 751 | 22:6-18:1-18:1-18:1 | 2.74±0.10 | | 0.17±0.02 | | | | |
| 20:4-20:3-18:1-18:1 | | | | | | | |
| 752.01 | 22:6-18:1-18:1-18:0 | 0.54±0.17 | | 0.12±0.04 | | | | |
| 753.02 | 20:4-20:2-18:1-18:0 | 0.15±0.04 | | 0.07±0.01 | | | | |
| 20:4-20:1-18:1-18:1 | | | | | | | |
| 754.03 | 20:4-20:1-18:1-18:0 | 0.09±0.02 | | 0.05±0.02 | | | | |
| 755.03 | 20:4-20:1-18:0-18:0 | | | 0.04±0.01 | | | | |
| 758.97 | 22:6-20:4-20:4-16:1 | 0.32±0.04 | | 0.05±0.02 | | | | 0.89±0.19 |
| 22:6-22:6-18:2-16:1 | | | | | | | |
| 759.98 | 22:6-20:4-18:2-18:2 | 0.76±0.05 | | 0.07±0.03 | | | | |
| 22:6-20:4-20:4-16:0 | | | | | | | |
| 22:6-22:6-18:1-16:1 | | | | | | | |
| 760.99 | 22:6-20:4-18:2-18:1 | 1.72±0.08 | | 0.18±0.08 | | | 1.31±0.32 | |
| 761.99 | 22:6-20:4-18:1-18:1 | 2.94±0.23 | | 0.11±0.02 | | | 1.35±0.15 | 0.97±0.16 |
| 763 | 22:6-20:4-18:1-18:0 | 1.03±0.05 | | 0.07±0.02 | | | 1.16±0.26 | 1.45±0.22 |
| 22:6-20:3-18:1-18:1 | | | | | | | |
| 764.01 | 22:4-20:4-18:1-18:1 | 0.24±0.02 | | 0.11±0.03 | | | 1.48±0.33 | 1.47±0.24 |
| 22:6-20:3-18:1-18:0 | | | | | | | |
| 765.02 | 22:4-20:4-18:1-18:0 | | | 0.08±0.01 | | | | |
| 770.97 | 22:6-20:4-20:4-18:3 | 0.18±0.05 | | 0.09±0.02 | | | | |
| 771.98 | 22:6-22:6-20:4-16:0 | 0.42±0.05 | | 0.10±0.04 | | | | 2.04±0.23 |
| 20:4-20:4-20:4-20:4 | | | | | | | |
| 22:6-20:4-20:4-18:2 | | | | | | | |
| 22:6-22:6-18:2-18:2 | | | | | | | |
| 772.99 | 22:6-20:4-20:4-18:1 | 1.42±0.12 | 2.03±0.11 | 0.14±0.04 | 2.65±0.12 | | 2.25±0.45 | 2.32±0.31 |
| 773.99 | 22:6-22:6-18:1-18:1 | 1.81±0.09 | 1.64±0.18 | 0.11±0.02 | 2.68±0.10 | | 2.30±0.99 | 2.22±0.42 |
| 22:6-20:4-20:3-18:1 | | | | | | | |
| 775 | 16:0-20:3-22:5-22:5 | 0.28±0.10 | | | | | | |
| 18:2-20:3-20:3-22:5 | | | | | | | |
| 18:0-18:1-22:6-22:6 | | | | | | | |
| 18:0-20:3-20:4-22:6 | | | | | | | |
| 776.01 | 18:0-18:0-22:6-22:6 | 0.16±0.05 | | | | | | |
| 783.98 | 22:6-22:6-20:4-18:2 | 0.33±0.05 | | | | | | |
| 785.99 | 22:6-22:6-20:4-18:1 | 1.34±0.08 | | | | | | |
| 22:6-20:4-20:4-20:3 | | | | | | | |
| 795.98 | 20:4-20:4-22:6-22:6 | 0.25±0.09 | | 0.14±0.06 | | | | |
| 796.99 | 22:6-22:6-22:6-18:1 | 0.50±0.04 | | 0.12±0.05 | | | | |
| 22:6-22:6-20:4-20:3 | | | | | | | |
| 797.99 | 20:4-20:3-22:6-22:5 | 0.16±0.07 | | 0.06±0.02 | | | | |
| 22:6-22:6-22:6-18:0 | | | | | | | |
| 22:6-22:6-22:5-18:1 | | | | | | | |
| 807.98 | 20:4-22:6-22:6-22:6 | | | 0.07±0.03 | | | | |
| 813.02 | 22:6-22:6-22:6-22:5 | | | 0.06±0.02 | | | | |
VM-M2、VM-M3和VM-NM1肿瘤的CL异常
与B6小鼠大脑相反，B6小鼠脑中含有大约100种对称分布在七个主要类群上的CL分子()VM小鼠的大脑是独一无二的，只有大约45种主要的CL分子物种，而IV、V和VII组中缺少分子物种(和). VM-NM1和VM-M2肿瘤线粒体中的CL含量显著低于对照VM小鼠脑中的非突触线粒体(). VM-M3肿瘤和VM脑中CL含量无显著差异。每个VM肿瘤在CL分子种类的分布方面与VM脑不同(). 以VM非突触体线粒体与VM-NM1、VM-M2和VM-M3肿瘤组织之间的相关系数表示的CL分子种类分布的相关程度分别为0.601、0.699和0.475。在VM肿瘤中，CL分子种类也存在显著差异。
小鼠脑肿瘤的电子传递异常
CT-2A和EPEN肿瘤线粒体中复合物I、I/III和II/III的活性显著低于同基因B6脑线粒体。同样，VM-NM1、VM-M2和VM-M3脑肿瘤线粒体的ETC活性显著低于同基因VM脑线粒体(). 正如我们最近描述的那样，与B6小鼠相比，VM小鼠脑线粒体中CL分子种类的异常分布可能是VM小鼠ETC活性较低的原因(39).
小鼠脑和脑肿瘤线粒体中复合物I、I/III和II/III的电子传递链（ETC）酶活性。酶活性表示为nmol/min/mg蛋白质，如材料和方法所述。所有数值均表示为三到四种独立线粒体制剂的平均值，其中每种制剂共有六个皮质或肿瘤。星号表示肿瘤值与B6或VM脑值在*P（P）<0.025或**P（P）<0.001水平，由双尾确定t吨-测试。
B6和VM脑肿瘤中CL异常与ETC活性的关系
为了说明ETC酶活性与CL含量和组成的关系，我们利用二维线性回归将测量的活性值拟合为形式的函数：活性=一1内容+一2含量×相关性+c（见材料和方法）。每个复合物的最佳拟合关系表示为二次曲面。我们的目的是比较CT-2A和EPEN肿瘤与其B6宿主株的数据，并将VM-NM1、VM-M2和VM-M3肿瘤与其VM宿主株进行比较。该分析证明了ETC活性、CL含量和分子物种分布之间的直接关系(). 在比较B6肿瘤与其宿主菌株的复合物I时，二次曲面计算为：活性=15.614含量+3.443含量×相关性−30.277。对于配合物I/III，二次曲面计算为：活性=1.599含量+3.480含量×相关性+1.306。对于配合物II/III，二次曲面计算为：活性=2.768含量+2.685含量×相关性+21.634。对于每种复合物，ETC活性随着CL含量相对于B6脑中CL含量的降低而降低。然而一1络合物I（15.614）的组分大于络合物I/III（1.599）或络合物II/III（2.768），表明络合物I的活性更依赖于CL含量，而不是其他两种络合物的活性。在VM脑肿瘤中，ETC活性和CL异常之间的关系也有类似的趋势。
B6和VM小鼠脑肿瘤中CL异常与ETC活性的关系。如材料和方法中所述，数据在每个电子传输链复合体的最佳拟合三维二次曲面上表示。为了说明同一图表上所有肿瘤相对于宿主菌株的位置，VM菌株和肿瘤的数据拟合到材料和方法中描述的B6-ft二次曲面。
各种肿瘤包括各种CL含量和分子物种组成，这表明我们所模拟的酶活性表面将有助于使用CL含量与分布预测其他肿瘤的复杂活性。例如，EPEN肿瘤距离其对照B6宿主菌株最远，而VM-M3肿瘤距离其VM宿主菌株最近。这些数据表明，肿瘤与其各自宿主菌株之间ETC活性的差异与肿瘤与宿主之间CL含量和组成的差异直接相关。
讨论
Warburg理论将癌症描述为细胞呼吸的代谢性疾病，并在癌症领域引起了相当大的争论和争议。许多争议围绕着有氧糖酵解的分子机制，这涉及到牧场效应的缺陷(13,14,58,59). 事实上，肿瘤细胞中有氧糖酵解的表达通常被称为“Warburg效应”(10,11,60). 有趣的是，Warburg认为有氧糖酵解现象太不稳定或太依赖于环境条件，是肿瘤代谢的可靠指标(1,2). 相反，他强调了呼吸结构缺陷作为癌症更强大机制的重要性。在不可逆呼吸损伤后，为了维持足够的ATP水解δG′以维持细胞生存，自然会产生对糖酵解的更大依赖性。对有氧糖酵解障碍的强调转移了人们对Warburg理论关键方面的注意力，该理论认为肿瘤细胞呼吸损伤的潜在结构异常(9,12,60). 由于CL是线粒体内膜的主要结构脂质，影响线粒体功能和生物能量学，我们首次研究了不同组小鼠脑肿瘤高纯度线粒体中CL的含量和组成。
我们发现小鼠脑肿瘤线粒体中的CL成分和/或含量与来自正常同系宿主脑组织的线粒体中的显著不同。此外，我们发现这些CL异常与ETC活性的显著降低有关，这与CL在维持线粒体内膜结构完整性方面的关键作用一致(31). 我们对从体内生长的脑肿瘤中分离出的线粒体进行了研究，而不是对从培养的脑肿瘤细胞中分离出来的线粒体进行研究，因为我们的初步研究表明，体外培养条件产生的CL异常会混淆数据解释(61). 我们对五种不同小鼠脑肿瘤类型的CL异常的发现与早期对大鼠肝癌的研究一致，这些肝癌显示了幼年CL的短链饱和脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸）特征(22,62). 根据这些和其他观察结果，我们认为大多数肿瘤，无论其来源于何处，都含有CL成分和/或含量的异常。
因为ETC复合物I、I/III和II/III对于维持线粒体质子梯度和呼吸能量产生是必要的(26,63)，我们发现的CL异常将损害这些脑瘤的呼吸能量代谢。此外，我们认为，在各种小鼠脑肿瘤或任何肿瘤中表达的CL异常不太可能是可逆的。要纠正肿瘤中的CL异常，需要切除肿瘤生长，同时伴有CL合成和重塑的多种变化。由于CL重塑的复杂性以及涉及的多个组件(41)CL分子的物种形成似乎不太可能在任何癌细胞中恢复。因此，我们在小鼠脑肿瘤中的发现提供了将异常CL与不可逆呼吸损伤联系起来的证据。
尽管Warburg强调不可逆呼吸损伤是癌症的主要原因，但尚不清楚我们在这些小鼠脑肿瘤中发现的CL异常是作为肿瘤发生或肿瘤进展的原因还是影响。最初，CT-2A星形细胞瘤和EPEN室管膜母细胞瘤是在20甲基胆蒽植入B6小鼠大脑数月后发生的，而VM肿瘤是在成年VM小鼠的大脑中自发发生的(45,46). 我们研究的脑肿瘤是从每个肿瘤建立的克隆细胞系中生长出来的。独立样本中CL异常的高重复性表明，CL异常是每种脑肿瘤类型的稳定表型。这些小鼠脑肿瘤中的ETC异常不是由线粒体基因组内的突变引起的，因为在每个脑肿瘤的测序基因组中没有发现致病性突变(64). 然而，有趣的是，近交VM小鼠的大脑中存在CL分子种类的异常(39). 这些CL异常可能导致该菌株自发性胶质瘤的发病率相对较高。根据这些发现，我们认为核基因组内的遗传突变可能直接或间接导致CL合成或重塑异常。
除了遗传突变外，抑癌基因/癌基因的体细胞突变或非整倍体也可能产生线粒体缺陷，从而导致CL异常(65–67). CL异常也可能由多种表观遗传原因引起，包括细胞增殖、代谢流量和钙稳态异常(68–70). 各种环境损伤，包括坏死、缺氧/缺血、饮食失衡和活性氧物种，也可能改变CL含量和/或成分，从而促进肿瘤的发生或发展(71–75). 因此，肿瘤细胞的呼吸损伤可以通过许多遗传、表观遗传和环境因素与CL异常联系起来().
遗传、表观遗传和环境因素与CL含量和组成异常相关的呼吸功能障碍的关系。活性氧。
我们在这里描述的CL异常可能是这些肿瘤和其他肿瘤对饮食能量限制和代谢靶向治疗反应的部分基础(4,76–82). 通过损害ETC效率，CL异常会降低肿瘤细胞从代谢燃料而非葡萄糖中获取能量的能力(三). 尽管我们的发现提供了将Warburg癌症理论与异常CL联系起来的证据，但重要的是要认识到并非所有CL异常都与癌症相关。事实上，CL异常已在多种非肿瘤性疾病中发现，包括糖尿病、Barth综合征和几种神经退行性疾病(40,73,74). 然而，我们的发现提供了新的证据，证明异常CL可能是肿瘤中不可逆呼吸损伤的基础，从而将Warburg的癌症理论与异常CL联系起来。
致谢
作者感谢玛丽·罗伯茨、丹尼尔·基什纳、雷娜·贝克、普娜·穆克吉和约翰·曼蒂斯的有益讨论。
脚注
*这项工作得到了国家卫生研究院NS-055195拨款、国家癌症研究所CA-102135拨款和国家老龄化研究所AG-23168拨款的支持。
工具书类
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