为了确保在细胞分裂期间将遗传物质和细胞器适当分离到子细胞，胞质分裂的开始必须与有丝分裂的完成相协调。胞质分裂的调控在葡萄裂殖酵母因为它既适用于基因研究，也适用于生化研究。此外，Sz.pombe公司通过使用内侧肌动球蛋白收缩环进行分裂，这一过程类似于动物细胞的细胞分裂(1–三).
通过基因和生物化学研究Sz.pombe公司，GTPase信号通路中参与调节和启动胞质分裂的关键成分已被确定（参考文献综述）。4–6). 许多这些成分的突变导致了sid（间隔起始缺陷）表型。在锡德突变体，内侧肌动球蛋白环形成，但不能收缩，也不会形成隔膜。然而，核分裂和生长仍在继续，产生细长的多核细胞。这个锡德突变体显示遗传相互作用(7,8)其与在相同的生物化学途径中起作用的Sid蛋白一致。其中几个锡德通路成分现在已经在分子水平上进行了分析，允许在信号级联中定位成分。这个spg1型+该基因编码一个小的Ras超家族GTPase，其激活被认为触发锡德通路(8–10). 这个sid1+,sid2+、和cdc7型+基因编码蛋白激酶，作用于Spg1p激活下游以启动间隔（参考文献。8,10、和11; D.Guertin和D.McCollum，个人沟通）。Spg1p的双组分GTPase激活蛋白（GAP），由Cdc16p和Byr4p组成(12)，起到对抗作用以防止分隔。
几种蛋白质调节锡德已经证明，在细胞周期的至少部分时间内，该通路定位于纺锤极体（SPB）(10,11,13). Spg1p在整个细胞周期中存在于SPB。在间期，它在两个SPB上都以非活性GDP-结合形式存在，在有丝分裂早期，在两个SP上都以活性GTP-结合方式存在，在B后期，在一个SP上以活性GTP结合形式存在(11). 相间期间，SPB上同时存在Cdc16p和Byr4p(13)，可能使Spg1p失活。在早期有丝分裂过程中，SPBs处的Cdc16p水平降低，这允许两个SPBs处的Spg1p活化(11,13). 在后期，Cdc16p和Byr4p水平在一个SPB处增加，导致一个SPB处Spg1p的不对称失活(11,13). Cdc7p激酶活性不是细胞周期调节的，显然是由Spg1p在空间上调节的，因此其SPB定位与激活的GTP结合形式的Spg1p一致(11). 与Cdc7p不同，Sid2p在整个细胞周期中都存在于SPB，但其激酶活性受细胞周期调节，在中环收缩和分隔期间达到峰值(10). Sid2p活动取决于锡德路径，包括cdc7+和spg1型+(10). 与Cdc7p不同，Sid2p在后期定位于肌动球蛋白环(10). 因此,似乎Spg1p将Cdc7p招募到SPB，从而启动导致细胞分裂的事件。
Spg1p信号通路与细胞周期蛋白破坏和有丝分裂退出所需的通路有关酿酒酵母.Spg1p、Cdc7p和Sid2p与酿酒酵母特米1p(9,14,15)，Cdc15p(16)和Dbf2p(8)分别是。如果没有这些蛋白质功能，酿酒酵母细胞在末期停滞，表现为染色体分离、纺锤体拉长、Cdc28/Clb2蛋白激酶活性高的大乳房细胞（参考文献综述）。17). 此外，Sz.pombe公司Cdc16p和Byr4p是酿酒酵母分别为Bub2p和Byr4p/Bfa1p(18–21). 存在类似的途径Sz.pombe公司和酿酒酵母表明这种信号转导途径是保守的，尽管其靶点可能因物种而异。
在之前的胞质分裂缺陷突变筛查中，我们发现了一个影响pombe sid先生通路，sid4-SA1号机组(8). 这种对温度敏感的（ts）突变对spg1型和sid2突变和Spg1p诱导的隔膜形成需要Sid4p功能(8). 这里，我们进一步描述了sid4号机组+基因及其产物，并证明Sid4p定位于SPB。Sid4p定位独立于隔膜形成所需的其他成分，但Spg1p-GTPase信号通路的所有其他特征成分需要Sid4p定位到SPB。
材料和方法
菌株、培养基、遗传方法和质粒操作。
菌株在酵母抽提物（YE）或带有适当补充物的最小培养基中生长(22). 在谷氨酸培养基上进行杂交，通过四分体分析构建双突变菌株(22). 除非另有说明，否则酵母转化是通过电穿孔进行的(23). 质粒操作和细菌转化使用标准程序(24). 本研究中使用的菌株和质粒列于表1和表2中（补充材料见网址：www.pnas.org).
的克隆和测序sid4号机组+.
sid4-SA1号机组突变细胞（KGY1234）用pUR19-based转化Sz.pombe公司基因组文库(25),和一个质粒pKG986，在KGY1234中分离和重传后，允许在限制温度下生长。为了进行整合映射，将4.0-kb基因组片段亚克隆到Sz.pombe ura4公司-基于积分向量pJK210(26)生成pKG1068。pKG1068在Nde公司我的站点位于sid4号机组+并转化为KGY1234。Sid4公司+乌拉+选择转化体并将其杂交到sid4号机组+或sid4号机组-SA1公司验证共偏析的应变sid4号机组+表型与尿酸4+标记。对约2.7 kb的4.0-kb插入物进行了测序；它对应于Sz.pombe公司粘粒c244上的基因组。这个sid4号机组+ORF（GenBank登录号。{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AF153475“，”term_id“：”7767390“，”term_text“：”AF151475“}}AF153475型)对应于桑格中心的g3184072（SPBC244.01c）。排序sid4-SA1号机组等位基因sid4号机组从KGY1234制备的基因组DNA中通过PCR扩增该位点。PCR产物直接测序，在2116位（T至a）检测到单核苷酸变化。
删除sid4号机组+.
pSK公司sid4号机组+（pKG1098）用Nde公司我/斯图I释放包含1256个核苷酸的片段sid4号机组; 这个碎片被替换为ura4型+基因，产生pKG1269。这个过程留下了编码Sid4p的前153个和最后48个氨基酸的序列。包含以下内容的碎片尿酸4+以及5′的670 bp和3′的1 kbsid4号机组+从pKG1269中分离并转化为二倍体菌株（KGY137）。在缺乏尿嘧啶的培养基上选择转化子，并鉴定出稳定的整合子。替换一份sid4号机组+与尿酸4+在菌株KGY1358中通过Southern杂交分析证实了该盒。四分体以2:2分离以获得生存能力，所有活菌落均为Ura−，表示删除sid4号机组是致命的。
过度表达分析。
研究sid4号机组+构建，菌株在2μM硫胺素存在下生长到中对数期，然后在缺乏硫胺素的培养基中生长，以诱导硫胺素再表达nmt1（纳米1）促进剂在指定的温度和时间下。
的表位标记sid4号机组+.
这个sid4号机组+如前所述，用编码血凝素表位（3xHA）的三个拷贝或myc表位（9xmyc）的九个拷贝的序列标记染色体位点的3′端(27).
免疫沉淀和免疫印迹。
变性和天然蛋白裂解物由Sz.pombe公司如前所述(28,29). 用抗HA或抗myc抗体进行免疫沉淀，如下所述(30). 蛋白质在6–20%梯度凝胶上通过SDS/PAGE进行解析，并按所述通过免疫印迹分析(30).
甘油梯度分析。
将天然细胞裂解物分层到10-30%甘油梯度上，并在SW-50 Ti转子（Beckman）中以40000 rpm离心18 h。从底部收集梯度组分并与5×样品缓冲液混合，通过SDS/PAGE和免疫印迹分析组分。尺寸标准以平行梯度沉淀，并通过考马斯蓝染色进行分析。
酵母双杂交分析。
YPB2细胞与含有或不含有诱饵（pBI770）和猎物（pBI77）质粒的质粒共转化侧面4+LiOAc/单链DNA/PEG程序的片段(31)并镀在缺乏亮氨酸和色氨酸的合成葡萄糖培养基上(32). 卢+Trp公司+在25°C下，通过在缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸且含有5 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（3AT；Sigma）的合成葡萄糖培养基上电镀，对转化子的正相互作用进行评分。
体外试验转录和翻译。
pBluescript SK+（地层基因）包含sid4-myc公司（pKG1935）或sid4ΔN-HA（pKG1936）用作模板在体外TNT偶联网织红细胞裂解物系统（Promega）中的转录/翻译反应。
显微镜。
所有荧光显微镜均在蔡司Axioskop上进行，图像由冷却的电荷耦合器件相机（Optronics ZVS47DEC）拍摄。为了染色细胞壁或进行免疫荧光，细胞分别固定在甲醛或甲醇中，并按照前面所述进行处理(14). 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）用于DNA可视化，钙荧光用于细胞壁材料可视化，TAT-1抗体用于微管可视化(33)，用多克隆兔抗Sad1p抗体观察SPB(34)，并且通过使用亲和纯化的多克隆抗Byr4p抗体来确定Byr4p定位(13,18). 为了观察Sid4p-HA、Cdc7p-HA或Spg1p-HA，以6μg/ml的速度使用12CA5单克隆抗体（抗-HA）。与一级抗体孵育后，用PBAL清洗细胞，如前所述(14). 二级抗体，Alexa488山羊抗兔IgG或Alexa594山羊抗鼠IgG（分子探针），使用5μg/ml。
结果
sid4号机组+编码≈76.4 kDa的基本蛋白质。
隐性ts突变体，sid4-SA1号机组在胞质分裂缺陷突变体的筛选中分离出(8). 在限制温度下，sid4-SA1号机组细胞没有形成隔膜，而是继续生长并经历核分裂，因此细胞被拉长并含有多个细胞核（参考文献。8; 图。). 我们克隆了sid4号机组+通过互补sid4-SA1号机组并通过整合映射证实了拯救质粒编码sid4号机组+而不是高拷贝抑制器。这个sid4号机组+基因组克隆包含一个由一个内含子中断的单个ORF，并编码一个预测分子量为76.4kDa的蛋白质。使用基本局部对齐序列工具进行数据库搜索(爆炸; 裁判。35)表明Sid4p与数据库中当前的其他蛋白质没有明显的相似性。的序列分析sid4-SA1型突变等位基因显示核苷酸2116（T到a）发生单一突变，导致单一氨基酸改变（L629P）。通过替换的一个副本sid4号机组+具有尿酸4+在二倍体背景下进行四分体分析，我们发现sid4号机组+编码一种基本蛋白质（数据未显示）。
Spg1p、Cdc7p和Byr4p SPB本地化需要Sid4p功能。(A类和B类)spg1-HA sid4-SA1（725千克；A类)或cdc7-HA sid4-SA1（KGY1600；B类)细胞在25°C下生长到中对数期，然后转移到36.5°C下4小时(A类)或2小时(B类). 细胞固定并用DAPI、抗HA和抗Sad1p染色。(C类)sid4-SA1号机组（KGY1234）细胞在25°C下生长到中对数期，然后转移到36.5°C下4 h。细胞固定并用DAPI、anti-Byr4p和TAT-1染色。（巴=10μm）
Sid4p定位于独立于微管和其他Sid蛋白质的SPB。
为了检测Sid4p，我们构建了sid4-HA公司和sid4-myc公司应变（参见材料和方法). 这两个菌株在所有温度下都无法从形态学上与野生型区分，表明表位标签没有改变Sid4p的功能。抗-HA抗体检测到sid4-HA公司应变（图。和数据未显示），抗myc抗体在sid4-myc公司应变（图。和未显示的数据）。
Sid4p与自身交互。(A类)细胞裂解物是在自然条件下从sid4-HA公司/sid4-myc公司杂合二倍体菌株（KGY2732），用抗HA或抗myc免疫沉淀，并用抗HA或抗myc免疫印迹进行分析。显示了Sid4p-HA和Sid4p-myc的位置。非特异性HA交叉反应蛋白的位置如图所示（●）(B类)Sid4p-myc沉积物，表观质量≈200 kDa。细胞裂解物是在自然条件下从sid4-myc公司菌株（KGY1340），并通过甘油梯度沉降进行分析。显示分数。显示了以平行梯度沉淀的分子质量标记的峰值分数（溶菌酶，14kDa；卵清蛋白，45kDa，BSA，66kDa、肌球蛋白，220kDa和β-半乳糖苷酶（β-Gal），464kDa）。(C类)Sid4p二聚结构域。将pBI770（诱饵）中的Sid4ΔNp和pBI771（猎物）中的Sid4p片段共转化为菌株YPB2（KGY1400），并按文中所述分析相互作用，强大的交互作用；+，适度相互作用；−，没有交互作用。指出了每个片段编码的氨基酸残基。(D类)Sid4p-myc直接与Sid4ΔNp-HA结合。翻译了Sid4p-myc和Sid4ΔNp-HA在体外分别或联合用抗HA或抗myc免疫沉淀，用抗HA和抗myc进行免疫印迹分析。免疫沉淀反应中10%的输入也通过SDS/PAGE和免疫印迹进行解析。指出了Sid4p-myc和Sid4ΔNp-HA（及其内部引发产物）的位置。
利用HA和myc表位抗体的免疫荧光检测Sid4p-HA的细胞内定位。在野生型细胞中，未观察到离散染色（数据未显示）；然而，在sid4-HA公司和sid4-myc公司在整个细胞周期中，在细胞核的外围检测到点（图。A类; 数据未显示）。这些点与Sad1p染色显示的点一致（图。A类)，SPB的已知组成部分(34). 我们得出结论，Sid4p与Spg1p一样，定位于SPB，与细胞周期阶段无关。
(A类)Sid4p-HA在整个细胞周期中定位于SPB。sid4 HA型细胞（KGY1576）固定并用DAPI、抗HA和抗Sad1p染色。(B类)Sid4p-HA SPB定位不需要完整的微管。之前(一和b条)或之后(c–f)冷休克后，将KGY1576细胞固定并用DAPI和TAT-1或抗HA染色。(C类)Sid4p SPB定位与胞质分裂所需的已知蛋白质无关。内源性sid4-HA公司在中可视化spg1–106（KGY1593），cdc7–24（KGY1594），sid1–239（KGY1591），sid2–250（千克1592），cdc11–123（KGY1595），cdc14-118（KGY1596），cdc15-140（KGY1597），或cdc16-116（KGY1598）。细胞在25°C下生长至中对数期，在36°C下培养4h，固定并用DAPI和抗-HA染色。（巴=10μm）
为了确定Sid4p定位是否依赖于微管，sid4-HA公司将细胞置于冰上25分钟以破坏微管阵列(34). 冷休克后，SPB仍检测到Sid4p-HA（图。B类). 同样，当携带β-微管蛋白突变的菌株，Sid4p-HA定位于SPB，nda3-KM311(36,37)，在其限制温度下培养以破坏微管阵列（数据未显示）。
Cdc7p和Sid2p蛋白激酶在SPB中的定位依赖于Spg1p(10,11). 为了确定Sid4p定位是否也依赖于Spg1p或其他已知的隔膜形成所需的蛋白质，在各种ts隔膜突变体中检测了Sid4p-HA定位。在所有测试的ts突变体中，Sid4p HA定位于SPBs（图。C类)，以及在按r4+关闭应变(18)（未显示数据）。
Spg1p、Cdc7p和Byr4p SPB本地化依赖于Sid4p。
接下来，我们询问Cdc7p、Spg1p或Byr4p的本地化是否依赖于Sid4p。由于Cdc7p仅在有丝分裂过程中定位于SPBs，因此用抗Sad1p对细胞进行染色，以识别后期早期和晚期的细胞。在允许温度下，Spg1p-HA、Cdc7p-HA和Byr4p局限于sid4-SA1号机组突变体（图。)，但在限制温度下，在SPB中未检测到这些蛋白质（图。)，表明Sid4p对其定位到SPB至关重要。
Sid4p过度生产的影响。
如Byr4p所示，与胞质分裂有关的蛋白质的过度生产可导致隔膜形成的抑制(18)或Spg1p所见的不受控制的间隔(8,9)或Plo1p(38). 为了确定Sid4p的过度生产是否影响胞质分裂，我们检测了来自nmt1（纳米1）促进剂（参见材料和方法). Sid4p生产过剩挽救了sid4-SA1号机组突变（数据未显示），在野生型细胞中未产生可检测的表型。免疫印迹分析证实了这些菌株中Sid4p的过度生产（数据未显示）。
在试图绘制Sid4p的功能域时，我们发现一个表达N端153个氨基酸（pKG1386）或与HA表位的三个拷贝（pKG1534）融合的N端151个氨基酸的构建物并没有拯救sid4号机组ts或缺失突变体。相反，一个表达中等水平的Sid4p的构建体缺乏N-末端153个氨基酸（Sid4ΔNp，pKG1225），拯救了sid4号机组ts突变体尽管不是sid4号机组缺失突变体。野生型背景中pKG1386或pKG1534的过度生产不会影响细胞生长或形态（数据未显示）。免疫印迹分析证实N153Sid4p-HA过度生成（数据未显示）。有趣的是，Sid4ΔNp的过度生成抑制了隔膜的形成，并产生了包含多个细胞核的细长细胞。当nmt1-sid4ΔN该结构集成在单个副本中（KGY1347）（图。A类). Sid4ΔNp的显性-阴性表型表明它可能滴定出形成隔膜所需的因子。
(A类)Sid4ΔNp的过度产生抑制胞质分裂。携带单个集成副本的野生型单元格sid4ΔN在硫胺素可抑制物质的控制下nmt1（纳米1）启动子（KGY1347）在含有硫胺素的培养基中在32°C下生长到中对数期(一和b条). 诱导过度表达sid4ΔN，然后细胞在32°C的缺乏硫胺素的培养基中生长22小时(c（c）和天). 细胞固定并用DAPI或钙荧光染色。(B类)Sid4ΔNp生产过剩可防止Sid4p SPB本地化。sid4-HA公司携带单个集成副本的单元格nmt1-sid4ΔN（KGY1742）在32°C的抑制条件下生长到中对数阶段(一和b条)或在32°C下切换至诱导条件20小时(c–e类). 细胞用DAPI、抗HA和抗Sad1p染色。(C类)全长Sid4p挽救了Sid4ΔNp的过度生产表型。用质粒pUR19转化KGY1347sid4号机组+携带全长Sid4p（扇区1）或控制质粒pUR19（扇区2），并在含有或不含硫胺素的最小培养基上生长，以抑制或诱导Sid4ΔNp的产生。(D类)Sid4ΔNp生产过剩可防止Spg1p SPB本地化。spg1-HA携带单个集成副本的单元格nmt1-sid4ΔN（KGY1741）在32°C的抑制下生长到中对数阶段(一和b条)或诱发条件(c–h). 细胞用DAPI、抗HA和抗Sad1p染色以检测SPB。（巴=10μm）
为了测试这种可能性，在细胞中检测内源性Sid4p-HA的定位nmt1（纳米1）启动子（KGY1742）。当Sid4ΔNp以中等水平产生时，Sid4p-HA SPB染色较强（图。B类). 然而，当Sid4ΔNp过度产生时，Sid4p-HA SPB染色减少，并且通常无法检测到（图。B类). 相比之下，Byr4p的生产过剩(18)也抑制了间隔，但并没有减少SPB检测到的Sid4p数量（数据未显示）。如果Sid4ΔNp滴定SPB中的Sid4p-HA，那么Sid4p的代偿性过度生产可能挽救Sid4△Np过度生产的显性负表型。事实上，当sid4号机组+与Sid4ΔNp一起从多拷贝质粒中表达，细胞生长恢复（图。C类).
尽管图。A类表明SPB的Spg1p定位依赖于Sid4p，尚不清楚这是否依赖于Sid 4p定位到SPB。为了解决这个问题，我们通过过量生产Sid4ΔNp从SPB中删除了Sid4p。在这些条件下，SPB未检测到Spg1p-HA染色（图。D类). Sid4ΔNp的过量生产也阻碍了Sid2p在SPB中的定位（数据未显示）。我们得出结论，Sid4p在向SPB招募其他蛋白质方面的功能取决于其自身对SPB的定位。
Sid4p的二聚体。
Sid4ΔNp拯救了sid4号机组ts突变体，尽管它缺乏功能必需的结构域。这一观察表明sid4ΔN和sid4-SA1号机组表现出可能依赖于二聚体或更大多聚体形成的基因内互补；此外，允许这种相互作用的域必须存在于Sid4ΔNp内。为了检验这种可能性，构建了一个杂合的Sid4p HA/Sid4p myc二倍体菌株。当使用抗-HA或抗-myc时，Sid4p-HA和Sid4p-myc都是从天然细胞裂解物中共同免疫沉淀的（图。A类). 为了检查Sid4p复合物的表观尺寸，含有Sid4p-myc的裂解物通过甘油梯度沉淀进行分解，并通过免疫印迹分析进行分析（图。B类). Sid4p-myc在组分7到11中检测到，在组分8和9中达到峰值，类似于肌球蛋白（220kDa）；这些数据表明Sid4p-myc（≈100kDa）可能形成同型二聚体。
Sid4ΔNp-HA与myc抗体共免疫沉淀的能力支持了Sid4p二聚化结构域位于Sid4△Np内的假设sid4-myc公司应变（未显示数据）。为了进一步定义相互作用域，使用了酵母双杂交系统(32,39). 正如预期的那样，Sid4ΔNp没有与空的猎物质粒相互作用（数据未显示），但能够与自身相互作用（图。C类). Sid4ΔNp的N端和C端截断表明，蛋白质的整个C端半部分在该分析中对Sid4p–Sid4p相互作用很重要（图。C类).
为了排除在刚刚描述的分析中一种未经鉴定的酵母蛋白桥接Sid4p与自身的相互作用的可能性，Sid4p-myc和Sid4ΔNp-HA被分别翻译或一起翻译在体外免疫沉淀和免疫印迹分析表明，当共同翻译时，它们能够相互关联（图。D类). 这些结果强烈表明Sid4p可以与自身直接交互。
Sid4p的N端足以进行SPB定位。
由于Sid4ΔNp的过度生产阻止了其他途径成分在SPB的组装，我们推断Sid4p内的SPB定位信号位于已从Sid4△Np中移除的N末端片段中。为了直接测试这种可能性，将六个HA表位拷贝附加到N153Sid4p上，并测定该融合蛋白的定位。抗-HA在表达N153Sid4p-HA的细胞中检测到点，这些点与Sad1p共定位（图。). 类似地，当绿色荧光蛋白（GFP）被附加到C末端的氨基酸N153Sid4p并从质粒中表达时，在活细胞的SPB中检测到GFP（数据未显示）。这些数据一起表明Sid4p的N末端153个氨基酸包含SPB定位结构域。
Sid4p包含SPB本地化域。野生型细胞表达Sid4p的N末端153个氨基酸，并标记HA表位nmt1（纳米1）启动子（pKG1534）在32℃诱导条件下生长到中对数期。细胞固定并用DAPI、抗-HA染色检测N153Sid4p-HA和抗-Sad1p。（巴=10μm）
讨论
通过在蓬贝爵士，一条涉及Spg1p、Cdc7p、Cdc11p、Cd14p、Ccd16p、Byr4p、Sid1p、Sid2p和Sid4p蛋白的信号转导途径被证明可以调节胞质分裂的发生(4–6). 该信号级联的几个组件定位于SPB。这些包括GTPase Spg1p，Spg1p的双组分GTPase激活蛋白，以及两种蛋白激酶Cdc7p和Sid2p，它们作用于激活的Spg1b的下游(10,11,13). 与Spg1p和Sid2p一样，在整个细胞周期的SPB中检测到Sid4p-HA。使用几个标记版本的Sid4p，我们没有在内侧环检测到Sid4p（见上文；未显示其他数据）。我们和火花等。(10)发现Sid4p功能对至少四种其他蛋白质（Spg1p、Cdc7p、Bry4p和Sid2p）定位到SPB的能力至关重要，这表明Sid4p要么作用于Spg1p、Cdc7和Sid2的上游，要么可能充当此途径的支架。
与此途径中的其他蛋白质一样，Sid4p对生存能力至关重要，但与迄今为止描述的大多数其他成分不同，它在酿酒科学。这个线圈程序（版本2.2，窗口28；参考。40)表明Sid4p的C末端半部分可能存在两个卷曲-卷曲结构域，可能参与Sid4p与自身或另一个蛋白质的相互作用。这个sid4-SA1号机组突变等位基因在第二个假定的线圈结构域中包含从亮氨酸到脯氨酸的单一氨基酸变化。由于脯氨酸会中断螺旋线圈的α螺旋结构sid4-SA1号机组这可能是因为该结构域介导的蛋白质-蛋白质相互作用被破坏。
虽然Sid4ΔNp的过度生产对细胞是致命的，但适度水平的Sid4△Np可以挽救细胞sid4号机组ts突变体，但不是sid4号机组null突变体。这一观察结果表明，Sid4ΔNp缺乏一个对功能至关重要的结构域。由于Sid4p的N末端153个氨基酸的标记版本可以定位到SPB，因此Sid4ΔNp中缺失的域似乎是SPB定位域。然而，将N末端Sid4p片段定位到SPB需要其过度生产（数据未显示），这表明Sid4p的二聚化可能会提高定位效率。在未来的研究中，定义SPB定位所必需的氨基酸，并确定这些氨基酸与其他SPB蛋白质相互作用，将是很有意义的。
虽然Spg1p途径在Sz.pombe公司和酿酒酵母，的Sz.pombe公司用于Spg1p的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）尚未被鉴定。Sid4p仍有可能参与全球环境基金针对Spg1p的活动，但出于几个原因，这似乎不太可能。首先，Sid4p与酿酒酵母Lte1p，预计将为Tem1p提供全球环境基金活动(15,41). 其次，如果Sid4p是Spg1p的全球环境基金sid4号机组+可能挽救cdc16+; 情况并非如此（数据未显示）。同样，Sid4p的过度生产可能导致活化的、GTP结合的Spg1p增加，这反过来会产生类似于Spg1p-诱导的不受控制的隔膜形成的表型。然而，全长Sid4p的过度生产对细胞生长或形态没有影响。
我们的数据表明，Sid4p可能作为SPB的支架，在SPB上组装Spg1p信号通路的其他成分。然而，我们无法通过酵母双杂交或联合免疫沉淀分析检测Sid4p与Spg1p、Cdc7p或Sid2p之间的直接物理相互作用（数据未显示）。事实上，在酵母细胞裂解液中，我们只能检测到Sid4p与自身的相互作用。这些结果至少有三种可能的解释。首先，Sid4p与其他通路成分相互作用的形式可能嵌入SPB中，SPB是一种众所周知的抗溶解结构。也许与这个假设相关，Sid4p包含两个预测的线圈结构域，还有几个基本的结构SPB成分，包括Cut12p(42)，第110页(43,44)，Spc72p(45)，Spc42p(46)和Mps2p(47). 其次，该途径可能存在一个未知的组成部分，例如Spg1p的假定GEF将Sid4p与Spg1p联系起来。第三，Sid4p可能不会直接与任何通路成分相互作用，而是参与组织SPB，使通路成分能够与之结合。进一步研究Sid4p与SPB成分之间的相互作用，以及Sid4b与信号通路成分之间的交互作用，不仅应该提高我们对细胞分裂调控的认识Sz.pombe公司同时也提供了对间隔起始途径之间的保守特征的见解Sz.pombe公司和有丝分裂的退出途径酿酒酵母.
