霉菌致癌。作者手稿；PMC 2008年11月7日提供。
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组蛋白H3赖氨酸27三甲基化缺失是乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌预后不良的预测因素
,1 ,1 ,2 ,2 ,2 ,三 ,2 ,1 ,4 ,5 ,6 ,7和1,*
魏永坤
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心分子和细胞肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
伟亚霞
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心分子和细胞肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
张志宏
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
刘劲松
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
王华敏
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
纳兹米V.阿德赛
三密歇根州底特律韦恩州立大学卡马诺斯癌症研究所和哈珀大学医院病理学系
康斯坦斯·阿尔巴拉辛
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
迪华·余
1得克萨斯州休斯顿得克萨斯大学安德森癌症中心分子和细胞肿瘤学系
詹姆斯·拉布鲁泽斯（James L.Abbruzzese）
4德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心消化道肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
戈登·米尔斯
5德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学系，德克萨斯州休斯顿
小罗伯特·C·巴斯特。
6德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗系，德克萨斯州休斯顿
加布里埃尔·N·霍尔托巴吉
7德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心乳腺肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
Mien-Chie Hung公司
1得克萨斯州休斯顿得克萨斯大学安德森癌症中心分子和细胞肿瘤学系
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心分子和细胞肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
三密歇根州底特律韦恩州立大学卡马诺斯癌症研究所和哈珀大学医院病理学系
4德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心消化道肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
5德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学系，德克萨斯州休斯顿
6德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
7德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心乳腺肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
*通信地址：德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心分子和细胞肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号108号信箱，邮编：77030
Y.Wei和W.Xia为这项工作做出了同等贡献。
摘要
EZH2复合物使组蛋白H3（H3K27）上的赖氨酸27甲基化是介导基因沉默的表观遗传标记。EZH2在许多癌症中过度表达，与乳腺癌和前列腺癌的不良预后相关。然而，H3K27甲基化状态及其在癌症患者中的临床意义尚未见报道。因此，我们通过免疫组织化学方法检测了H3K27（H3K27me3）的三甲基化及其与乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的临床变量和预后的关系。我们发现，乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中H3K27me3的表达显著低于正常组织（乳腺癌中的62%，而正常乳腺组织中的88%，P（P）= 0.001; 卵巢癌为38.4%，正常卵巢组织为83.3%，P（P）< 0.05; 胰腺癌26%，正常胰腺组织89%，P（P）< 0.001). 在单变量生存分析中，H3K27me3表达对乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的预后有显著影响。在所有三种癌症类型中，与H3K27me3高表达患者相比，H3K17me3低表达患者的总体生存时间显著缩短。在多变量模型中，H3K27me3表达是所有三种癌症类型总生存率的独立预后值。这些结果表明，H3K27me3的表达是乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者临床结局的预后指标。
关键词：组蛋白修饰、癌症、预后
介绍
共价组蛋白修饰在调节染色质动力学和功能中起着重要作用[1]. 其中一种修饰，甲基化，发生在赖氨酸和精氨酸残基上。保守N末端组蛋白尾部赖氨酸残基的甲基化调节转录活性[2]. 组蛋白甲基化由甲基转移酶介导，甲基转移酶催化特定赖氨酸残基的单甲基化、二甲基化或三甲基化[三]. H3K27甲基化是染色质中的一个转录抑制组蛋白标记，EZH2是Polycomb（PcG）复合物的成分，是主要的H3-K27甲基转移酶[4——7]. 最近，研究表明EZH2在许多癌症中过度表达[8——11]EZH2的表达水平与两个前列腺的预后恶化相关[8]和乳腺癌[10]. 然而，目前还没有关于H3K27甲基化在癌症中的变化的报道。在这里，我们表明H3K27me3在一些乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中丢失，H3K17me3的丢失是癌症患者预后不良的预测因素。
材料和方法
患者
142例乳腺癌患者的石蜡包埋原发肿瘤来自中华人民共和国上海东方乳腺病医院病理科。中位年龄为51岁（范围为26-87岁）。所有病例的临床随访数据包括总生存率。总生存期的中位观察时间为50个月（范围为4-95个月）。此外，获得了43例与乳腺癌相邻的正常组织。
德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系在机构审查委员会（IRB）批准下提供了组织芯片，共包含255例卵巢癌。所有病例都有临床随访数据。中位随访期为35个月（范围为1-182个月）。还包括6例正常卵巢组织。
经IRB批准，从德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系、卡马诺斯癌症研究所病理学系和韦恩州立大学哈珀大学医院获取了包含165例侵袭性胰腺癌的组织微阵列。获得了72例癌旁正常胰腺上皮。所有病例均有临床随访数据。随访时间中位数为23.7个月（范围为1-144个月）。
免疫组织化学染色
样品在二甲苯中脱蜡，在一系列分级醇中再水化，并使用微波炉在0.01 M柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中回收抗原。然后用1%过氧化氢在甲醇中处理切片30分钟，以耗尽内源过氧化物酶活性。在10%的正常马血清中预培养1小时以防止非特异性染色后，将样品与小鼠抗人H3K27me3（#ab6002，Abcam，Inc.，Cambridge，MA）（1:60）在4°C下培养过夜。随后用生物素化马抗鼠免疫球蛋白处理切片，然后在室温下用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物溶液孵育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑溶液显色。使用迈耶苏木精进行反染色。
H3K27me3免疫染色评价
两位病理学家在不了解临床病理变量的情况下独立评估了H3K27me3染色水平。如果有核染色的组织学证据，则认为该肿瘤H3K27me3阳性。表达类别最初基于阳性染色细胞的百分比，同时考虑分布图，以及在确定低表达和高表达之间的最终分界点时的病例数和事件数（两类）。对于每种肿瘤类型，使用相同的截止点来分析相关性和结果；中位数用于所有肿瘤类型（乳腺癌和卵巢癌分别为30%，胰腺癌为10%）。因此，高表达和低表达的类别被一致定义为阳性细胞百分比高于或低于/等于每个肿瘤所用的截止点的组。
统计分析
使用10.0版SPSS软件进行统计分析。使用χ2和斯皮尔曼测试。根据Kaplan–Meier进行单变量生存分析，而生存曲线的差异通过对数秩检验进行评估。Cox回归分析用于多变量生存分析。全部P（P）价值观是双向的P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
人类肿瘤中H3K27me3表达的免疫组织化学分析
88%（38/43）的正常乳腺组织样本中检测到H3K27me3。乳腺癌中H3K27me3的表达显著降低()。在乳腺癌样本中，62%（88/142）的H3K27me3染色呈阳性(P（P）= 0.001). H3K27me3在正常胰腺组织和胰腺癌中的表达分别为89%（64/72）和26%（43/165）(P（P）<0.001）()。H3K27me3在83.3%（5/6）的正常卵巢组织样本中表达，而在卵巢癌中H3K17me3的表达仅为38.4%（98/255）(P（P）< 0.05) ().
正常组织和肿瘤组织中H3K27me3表达的免疫组织化学检测。在正常乳腺、卵巢和胰腺组织中检测到细胞核H3K27me3免疫染色。乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的细胞核H3K27me3表达水平低或高。右栏显示了同一例乳腺癌连续切片的阳性（含H3K27me3抗体）和阴性对照（不含H3K27me3）染色。原始放大倍数，400×。
H3K27me3表达与预后标志物的相关性
H3K27me3表达与各种预后标志物之间的相关性总结如下在乳腺癌中，低H3K27me3表达与大肿瘤相关(P（P）<0.001），ER阴性(P（P）=0.012），淋巴结阳性(P（P）=0.049），但与HER-2/Neu状态无关(P（P）= 0.13). 在卵巢癌中，H3K27me3的表达与高肿瘤分级相关(P（P）=0.031）和阶段(P（P）<0.001），但与组织学类型无关(P（P）= 0.124). 在胰腺癌中，H3K27me3与肿瘤分级相关(P（P）=0.016），但与肿瘤大小无关(P（P）=0.868）和淋巴结状态(P（P）= 0.051). 我们没有发现H3K27me3和EZH2在所有三种癌症类型中的表达之间的关联(P（P）> 0.05).
表1
| | H3K27me3型 | |
|---|
| |
| |
|---|
| 变量 | 案件数量 | 低 | 高 | P（P）-价值 |
|---|
| 乳腺癌 | | | | |
| 肿瘤大小 | | | | |
| ≤2厘米 | 61 | 14 | 47 | 0.001 |
| >2厘米 | 81 | 40 | 41 | |
| 节点状态 | | | | |
| 0 | 80 | 25 | 55 | 0.049 |
| 1–4 | 28 | 12 | 16 | |
| >4 | 34 | 17 | 17 | |
| Her2/Neu状态 | | | | |
| 阴性 | 85 | 27 | 58 | 0.13 |
| 积极的 | 49 | 22 | 27 | |
| ER状态 | | | | |
| 阴性 | 39 | 20 | 19 | 0.012 |
| 积极的 | 43 | 10 | 33 | |
| EZH2型 | | | | |
| 低 | 68 | 24 | 44 | 0.816 |
| 高 | 28 | 11 | 17 | |
| 卵巢癌 | | | | |
| 组织学 | | | | |
| 塞卢斯 | 138 | 80 | 58 | 0.124 |
| 其他 | 117 | 77 | 40 | |
| 肿瘤分级 | | | | |
| 低 | 28 | 12 | 16 | 0.031 |
| 高 | 227 | 145 | 82 | |
| 病理学阶段 | | | | |
| 低 | 37 | 13 | 24 | <0.001 |
| 高 | 218 | 144 | 74 | |
| EZH2型 | | | | |
| 低 | 60 | 36 | 24 | 0.588 |
| 高 | 62 | 34 | 28 | |
| 胰腺癌 | | | | |
| 肿瘤大小 | | | | |
| ≤3厘米 | 61 | 46 | 15 | 0.868 |
| >3厘米 | 97 | 72 | 25 | |
| 肿瘤分级 | | | | |
| 低 | 111 | 76 | 35 | 0.016 |
| 高 | 51 | 44 | 7 | |
| 节点状态 | | | | |
| 阴性 | 50 | 32 | 18 | 0.051 |
| 积极的 | 112 | 88 | 24 | |
| EZH2型 | | | | |
| 低 | 16 | 10 | 6 | 0.773 |
| 高 | 46 | 26 | 20 | |
H3K27me3表达与患者生存
生存分析的终点是疾病导致的死亡，死亡时对其他死亡原因进行审查。对于乳腺癌，H3K27me3低表达患者的5年生存率为46%，而其余患者的生存率为72%(P（P）= 0.005;)。卵巢癌患者的5年生存率为27%和47%（分别为低表达和高表达）(P（P）= 0.0028;)。低H3K27me3表达和高H3K27me3表达的胰腺癌5年生存率分别为11%和23%(P（P）< 0.001;).
根据乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者中H3K27me3的表达对总体生存率进行Kaplan-Meier分析。
进行多变量生存分析以评估H3K27me3表达作为预后因素的独立性。在乳腺癌系列中，H3K27me3的表达对预后有独立影响(P（P）=0.045），当与多种已知预后变量（如肿瘤大小、淋巴结状态、HER2/Neu状态和ER状态）一起纳入时()。在卵巢癌中，H3K27me3表达独立预测临床结果(P（P）=0.039），连同病理分期()。H3K27me3的表达对预后有强烈而独立的影响(P（P）=0.001），以及肿瘤大小和淋巴结状态().
表2
以死亡时间为终点的乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者的多变量生存分析
| 变量 | 危险比 | 95%置信区间 | P（P）-价值 |
|---|
| 乳腺癌 | | | |
| 肿瘤大小 | 2.448 | 1.094–5.477 | 0.029 |
| 节点状态 | 2.553 | 1.586–4.110 | <0.001 |
| HER-2/Neu状态 | 2.402 | 1.158–4.983 | 0.019 |
| ER状态 | 0.477 | 0.226–1.008 | 0.053 |
| H3K27me3表达 | 0.495 | 0.248–0.985 | 0.045 |
| 卵巢癌 | | | |
| 组织学 | 0.839 | 0.605–1.165 | 0.294 |
| 肿瘤分级 | 2.171 | 0.972–4.850 | 0.059 |
| 病理学阶段 | 2.843 | 1.411–5.728 | 0.003 |
| H3K27me3表达 | 0.699 | 0.497–0.981 | 0.039 |
| 胰腺癌 | | | |
| 肿瘤大小 | 1.652 | 1.140–2.394 | 0.008 |
| 肿瘤分级 | 1.295 | 0.875–1.916 | 0.196 |
| 节点状态 | 1.519 | 1.023–2.257 | 0.038 |
| H3K27me3型 | 0.489 | 0.318–0.751 | 0.001 |
讨论
组蛋白的共价修饰包括赖氨酸的乙酰化、赖氨酸和精氨酸的甲基化、丝氨酸和苏氨酸的磷酸化、谷氨酸的ADP-核糖基化以及赖氨酸残基的泛素化和氨解[12]. 这些共价修饰的结合产生了所谓的“组蛋白密码”[1]. 组蛋白修饰似乎在肿瘤转化过程中以特定模式发生。例如，研究表明组蛋白H4在Lys16的单乙酰化缺失和Lys20的三甲基化缺失是人类癌症的常见特征[13]. 最近也有报道称，免疫组织化学检测到的组蛋白修饰模式，如组蛋白乙酰化和H3和H4的二甲基化，可以预测前列腺癌的临床预后[14].
PcG蛋白通过产生和识别共价组蛋白修饰来介导可遗传的转录沉默。一个保守的PcG复合物PRC2由多个蛋白质组成，包括组蛋白甲基转移酶EZH2、WD-重复蛋白EED和Zin-finger蛋白SUZ12。赖氨酸27上的EZH2甲基化组蛋白H3[4——7]. EZH2的过度表达与前列腺癌的进展相关[8]和乳腺癌的侵袭性[10].
我们比较了H3K27me3在人类乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌与相应正常组织中的表达。我们发现肿瘤样本的三甲基化H3K27少于正常组织。我们还发现EZH2和H3K27me3在所有三种癌症类型中的表达没有相关性。肿瘤中H3K27me3缺失的机制尚不清楚。另一组先前的研究表明，cDNA转染导致正常前列腺上皮细胞中EZH2表达增加，导致靶基因染色质甲基化过度，并抑制靶基因表达[15]. 结果来自于使用正常细胞进行的细胞培养研究，它是否反映了癌症患者中EZH2过度表达的情况需要进一步研究。另一项研究表明，EZH2的过度表达促进了不同PRC复合物PRC4的形成，并表现出不同的组蛋白底物特异性[16]. 肿瘤中H3K27me3的丢失可能与这种新的PRC复合物的形成有关。鉴于EZH2甲基转移酶活性需要与其他PRC亚单位结合，有人认为肿瘤中EZH2-的过度表达可能导致PRC复合物完整性的破坏或可能形成新的PRC复合体[17,18]因此，甲基转移酶活性或对H3K27的特异性可能降低。另一种可能性是肿瘤中H3K27me3的丢失可能与PRC复合物成分中的蛋白质修饰有关[19].
本研究的主要发现是乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者中H3K27me3低表达与预后不良之间存在显著相关性。单变量生存分析显示，在所有三种癌症类型中，与H3K27me3高表达的癌症患者相比，H3K27me3低表达的癌症患者的总生存时间明显更短。当为整个系列构建Cox回归模型时，H3K27me3的低表达仍然是所有三种癌症类型死亡的独立预测因子。据我们所知，我们的数据首次证明H3K27me3的表达与人类癌症的临床结局直接相关。H3K27me3作为表观遗传标记介导沉默并抑制靶基因表达[4——7]H3K27me3表达缺失可能导致这些沉默基因的去表达，如一些癌基因；因此，有助于肿瘤的进展。在一项使用卵巢癌细胞系的研究中，Abbosh等人[20]发现显性负性组蛋白H3赖氨酸27突变体确实可以解除癌细胞中沉默的基因。
在最近的一项研究中，Seligson等人[14]据报道，全局组蛋白修饰模式可预测低级别前列腺癌的肿瘤复发风险。然而，任何单一组蛋白修饰水平的变异都不足以预测结果[14]. 有趣的是，我们的研究表明，H3K27me3的表达作为单一组蛋白修饰，可以作为乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的预后因素。
总之，我们在本研究中表明，H3K27me3是乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者的一个新的预后标志物。在所有三种癌症类型中，该标记物的预后价值独立于常规临床病理参数。其他研究应调查H3K27me3是否对其他形式的人类癌症的预后有类似影响。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款RO1 CA109311、PO1 CA099031、美国国立卫生研究院乳腺癌SPORE拨款CA116199、美国国立卫生研究院卵巢癌SPORE拨款P50 CA83639、美国国立卫生研究院胰腺癌SPORE拨款P20 CA101936、美国国家乳腺癌基金会、乳腺癌研究基金会和M.D.Anderson癌症中心支持拨款CA16672的支持。我们要感谢Jeng C.Cheng博士和Stephanie A.Miller博士编辑了这份手稿。
工具书类
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