跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
公共科学图书馆-遗传学。2008年11月；4（11）：e1000258。
在线发布2008年11月14日。 数字对象标识：10.1371/journal.pgen.1000258
预防性维修识别码：项目经理2576438
PMID：19008947

双向转录对人细胞转录基因的激活和抑制

凯文·莫里斯，1，* 沙伦·桑托索，1 安妮·马里·特纳，1，2 希亚拉·帕斯托里，三和彼得·霍金斯1，2
迈克尔·麦克马纳斯，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

针对人类细胞中基因启动子的小RNA已被证明可以调节转录基因的抑制和激活。然而，转录激活的机制仍不明确，转录基因沉默的内源性RNA触发因素尚未确定。本文描述了siRNA引导的转录基因激活的解释，以及非编码反义RNA作为效应分子驱动转录基因沉默的作用。p21基因表达的转录激活被确定为p21特异反义转录物的Argonaute 2依赖性转录后沉默的结果，该转录物在Argonate 1介导的p21 mRNA表达转录控制中起作用。这里提供的数据表明，在人类细胞中，双向转录是一种内源性基因调控机制，通过反义RNA将表观遗传调控复合物导向一个感觉启动子，从而产生RNA导向的表观遗传基因调控。这里的观察结果支持这样的观点，即抑癌基因（如p21）的表观遗传沉默可能是双向转录水平不平衡的结果。这种不平衡允许未经检查的反义RNA将沉默状态的表观遗传标记导向感觉启动子，从而导致稳定的转录基因沉默。

作者摘要

非编码RNA已被证明可以调节人类细胞中基因的转录表达。这种形式的基因调控已被证明是RNA将沉默状态的表观遗传变化导向靶基因启动子的结果。在这一精液观察后不久，针对基因启动子富含AT区域的小RNA被证明可以调节基因激活，称为RNA激活。虽然人们对非编码RNA介导的转录基因沉默有很多了解，但RNA激活的机制仍不清楚。在这里，我们提供证据表明RNA激活是内源性双向转录放松调控的结果。双向转录基因中的反义转录物在将沉默状态的表观遗传标记定向到感觉基因启动子方面起作用。抑制反义转录导致基因激活。总的来说，这些数据支持这样的观点，即双向转录是一种内源性机制，其中RNA定向基因调控是有效的，RNA激活是这种内源性途径中断的结果。对这种基于RNA的调节模式的理解将被证明对理解基因表达以及控制人类细胞中基因表达的潜在治疗方法非常有用。

介绍

在过去几年中，越来越明显的是，许多RNA介导的基因调控模式在生物系统中起作用[1]直到现在，人们才意识到这一网络有多么普及，以及在多大程度上可以将这种现象用于治疗。最近的观察表明，小的非编码RNA介导的转录调控可以在两种抑制因子中发挥作用，这增加了这种调控网络的复杂性[2]，[3]和激活方式[4]，[5]在人类细胞中。通过对基因启动子表观遗传修饰的特异性靶向，小RNA定向转录基因抑制功能的机制[6]，[7]。此活动需要Argonaute 1（Ago-1）[8]，[9]以及跨越靶基因座的低拷贝启动子相关RNA（pRNA）[6]虽然人们对人类细胞中小RNA定向转录基因沉默的机制知之甚多[10]关于可能驱动这一途径的内源性触发物的身份，或者小RNA如何也能引导基因激活，我们知之甚少。

据报道，人类细胞中p21、E-cadherin的小RNA定向转录激活[5]，[11]和孕酮受体（PR）[4]，[12]重要的是，这些小RNA被设计用于靶向富含AT的基因启动子区域，需要siRNA的5′末端和Argonaute 2（Ago-2）的活性[5]，[11]也观察到针对HIV-1 LTR/启动子的小RNA激活。然而，观察到的基因激活似乎是不分青红皂白的脱靶效应的结果[13]。

结果

在确定小RNA定向基因激活机制的研究过程中，我们确定激活siRNA p21-322的基因[5]理论上可以结合p21反义转录物并可能以其为靶点(图S1A). 针对E-cadherin靶向的siRNA E-cad640和miRNA miR373也有类似的观察结果，这两种RNA都被证明可以介导E-cadherin的基因激活(图S2A)[5]，[11].除了容易受到siRNA介导的基因激活[5]，[11]p21和E-cadherin基因都显示出双向转录[14]一种反义RNA与siRNA引导的前收缩素基因激活有关[12]。

为了确定p21激活siRNA p21-322与p21正转录或反转录相互作用的能力，进行了定向逆转录。p21 siRNA p21-322的两条链(表S1和[5])p21正反义转录物的有效引物反转录(图1A). 在更仔细地检查已知对p21反义的EST后[14]，确定了一个特定的EST，Bx332409型，与激活p21-322 siRNA的基因具有显著同源性[5]与p21的观察结果类似，E-cadherin 640和miR373都具有激活RNA的功能[5]，[11]，也能够启动E-cadherin的逆转录(图S2B和S2C）。据报道，E-cadherin还含有几种反义EST(图S2A和[14]).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1000258.g001.jpg
p21反义转录物的siRNA靶向导致p21的基因激活。

（A） p21-322 siRNA序列可以特异性地逆转录p21的正转录和反转录。图中显示了p21启动子和mRNA。转录起始位点（TSS），p21-322 siRNA靶位点[5]图中显示了p21-322正链或p21-321反链可以杂交的其他区域。p21-322正反义杂交通过引物特异性cDNA转换和特异性p21 mRNA表达的RT-PCR（插入）进行确认。（B） 靶向抑制p21反义RNABx332409型 [14]，导致显著的p21意义/mRNA表达。MCF-7细胞转染siRNAs，p21-322，Bx332409型，或R854（控制）[3]48小时后进行对比。根据对每个样品进行的qRT-PCR分析（一式三份）以及配对T试验的p值，显示了合并在一起的三份转染培养物的平均值和标准偏差。（C） 反义转录的抑制导致RNAPII义/mRNA转录活性的增加。通过定量RT-PCR测量的核运行分析显示来自重复处理的培养物，具有各自的范围和配对T检验的p值。（D） p21-322处理后，mRNA和pRNA在p21启动子处的转录表达均增加。通过斑点杂交分析评估（C）中的核运行数据。显示单个处理培养物的核运行，平均值使用图像J分析确定，并根据GAPDH标准化，标准偏差显示为配对T检验的p值。（E） p21反义RNA的siRNA靶向导致的基因激活需要Ago-2。首先用靶向Ago-2的shRNA表达质粒转染MCF-7细胞[23]（-Ago2）或对照质粒（+Ago2），然后用siRNAs p21-322进行第二次转染，Bx332409型，或R854（控制）[3]48小时后，测定p21 mRNA相对于GAPDH的表达。来自三份转染培养物的平均值显示为来自相应配对T测试的标准偏差和p值。（F） p21反义RNA沉默培养物中Ago-2的表达水平。转染48小时后，在p21反义siRNA靶向培养物（E）中测定相对于GAPDH表达的Ago-2 mRNA表达。三份转染培养物的平均值显示为标准偏差和配对T检验的结果。

p21反义RNA的抑制Bx332409型带有siRNA si-Bx332409型，它专门针对p21-322部分靶向的位点(图S1A)，表明p21反义转录物受到显著抑制，这与p21义/mRNA转录物表达的显著增加相关(图1B和S1B级). 与p21中的观察结果类似，用E-钙粘蛋白640或miR373处理的培养物显示出对E-钙粘蛋白反义转录的显著抑制，这与E-钙粘蛋白义/mRNA转录表达的显著增加相关(图S2D). 观察到的p21 mRNA表达增加似乎是由核连载分析测定的p21启动子转录活性增加所致(图1C和1D). 与之前的观察结果类似，Argonaute 2（Ago-2）似乎是siRNA p21-322和Bx332409型介导的基因激活(图1E和1F)[4]，[5]，[11]这些数据表明p21双向转录EST的转录后沉默Bx332409型足以调节p21义链转录的增加。

基因启动子的小的非编码RNA定向转录基因沉默与Ago-1的初始募集相关，随后不久，在靶位点出现沉默状态的表观遗传标记，如组蛋白3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）（综述于[10]). 最近，双向转录基因被证明可以调节表观遗传修饰，从而在肿瘤抑制基因沉默中发挥作用[14]因此，我们推测p21反义RNA的内源性功能Bx332409型是直接调控p21感觉/mRNA转录的表观遗传修饰。为了验证这一假设，在siRNA引导的基因激活后，进行染色质免疫沉淀分析（ChIP），以激活p21基因中不同位点的表观遗传修饰（H3K4me2，AcH3K14）和抑制性表观遗传修改（H3K27me3）(图2A). 在抑制反义转录后，在p21启动子处观察到H3K27me3的丢失(图2B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1000258.g002.jpg
p21反义转录的抑制导致p21启动子处抑制性H3K27me3表观遗传标记的丢失。

通过对p21-322和p21-323中的ChIP分析评估激活标记（H3K4和H3K14）和抑制标记H3K27me3Bx332409型siRNA处理的细胞。（A） 显示了后续ChIP分析中使用的各种p21-322和Bx33409 siRNA目标位点以及引物集（集1-3）的示意图。重复siRNA转染培养物的结果显示，引物集跨越（B）p21-322启动子靶位点（集A）、（C）p21编码区和（D）p21-332和Bx332409型p21 mRNA中的靶位点。重复转染培养物的四倍测量值和配对T试验的相应p值显示了平均值的标准误差。

相反，在p21编码区内未观察到H3K27me3的显著变化(图2C)或者在si-Bx332409型p21编码区的目标位点(图2D). 虽然在siBx332409位点和p21编码区内H3K14me2都有变化，但很难解释趋势。总的来说，这些数据表明p21反义转录物EST的抑制Bx332409型导致p21启动子的抑制性H3K27me3标记丢失。

我们之前的观察表明p21反义转录本Bx332409型负调节p21（sense，mRNA）表达。因此，我们推测抑制p21感觉转录物将促进不平衡，即反义不受感觉转录物的阻碍，可能调节p21感觉启动子的表观遗传变化。为了探索这一概念，我们筛选了抑制p21感觉/mRNA表达的siRNA。两种siRNA显著抑制p21 mRNA的表达，即si52和si858(图S3). 有趣的是，抑制p21正义转录物并没有显著影响p21编码区中p21反义转录物的水平(图3A). 然而，当p21启动子在p21感觉/mRNA抑制24小时后评估表观遗传标记的局部变化时，可以观察到Ago-1的显著增加，并且在较小程度上观察到组蛋白标记H3K27me3的抑制(图3B). 在抑制p21 sense/mRNA表达48小时后，观察到Ago-1和H3K27me3更显著的富集(图3C). 此外，核运行分析表明转录增加(图3D)这主要是反义的(图3E)因此，支持p21义/mRNA启动子中观察到的表观遗传变化可能是反义RNA介导的基因转录控制的结果。总的来说，这些数据表明，p21反义RNA在引导Ago-1募集到p21基因启动子以及增加沉默状态表观遗传标记的出现方面起作用。这一观察结果与之前关于siRNA定向转录基因沉默的观察结果惊人地相似[10]提示非编码RNA作为内源性效应分子在人类细胞中驱动转录基因沉默的作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1000258.g003.jpg
抑制p21义/mRNA表达导致Ago-1和H3K27me3向p21启动子募集。

（A） 靶向p21正义/mRNA的siRNA p21-si858抑制p21正义/mRNA转录，而对p21反义转录没有影响。三份转染MCF-7细胞培养的结果显示了标准偏差和配对T检验的p值。（B） 在siRNA转染后24小时，p21有义转录的抑制导致p21启动子处Ago-1的增加，而p21反义转录的抑制导致p21启动子处Ago-1富集的损失。单次ChIP分析的三种硅酸盐测量值显示为标准偏差和成对T检验的p值。（C） p21义转录的抑制导致Ago-1和沉默状态表观遗传标记H3K27me3的富集，特别是在siRNA处理48小时后的p21启动子处。平均值标准误差的平均值来自重复转染培养物和配对T检验的p值。（D） 抑制p21义/mRNA转录会导致p21启动子位点的转录增加，这是由核连载分析确定的。点杂交和图像J分析显示了两个单独的实验合并在一起。图像J分析也显示了成对T检验的平均值、标准偏差和p值。（E） 抑制p21正义/mRNA转录导致RNAPII p21反义转录活性增加。通过定量RTPCR测量的核运行分析显示了两个单独实验的平均值，该实验对siRNA处理后24-48小时的重复处理培养物进行了评估。显示平均值的标准误差以及配对T检验的p值。

小RNA导向的转录基因沉默（TGS）已被证明需要跨越基因启动子中靶位点的低拷贝启动子相关RNA（pRNA）[6]当p21反义RNA受到Ago-1依赖性抑制时，p21启动子内的转录活性被下调(图4A和S4系列). 相反，当p21感觉/mRNA被抑制时，p21 pRNA转录增加，主要由反义链转录组成(图4B). 然而，当p21有义/mRNA和Ago-1都被抑制时，反义p21 pRNA的富集减少，有义链p21 pRNA显著增加(图4C). 这些数据表明，跨越p21启动子的反义转录以及Ago-1参与了p21意义/mRNA转录表达的调控。综上所述，这些数据表明，p21正、反义双向转录之间的平衡是通过p21反义RNA定向表观遗传修饰的作用来维持的，这些表观遗传改造在p21启动子处内源性调节RNAPII活性。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1000258.g004.jpg
p21反义转录物和Ago-1都是调节p21启动子相关RNA和抑制启动子活性所必需的。

（A） 反义转录物，Bx332409型，在转录后被p21-322或si沉默（如插图所示-Bx332409型存在或不存在Ago-1时的siRNAs（50 nM）。在缺乏Ago-1的情况下，观察到dTT逆转录p21启动子相关RNA（pRNA）的富集。显示了三份转染培养物的平均值、标准偏差和配对T检验的p值。（B和C）在Ago-1存在（B）或不存在（C）的情况下，使用p21-52或p21-858 siRNAs（50 nM）在转录后（插图所示）沉默p21义转录物（编码mRNA）。在Ago-1和p21反义转录（B）存在的情况下，观察到p21反义pRNA的增加伴随着p21义pRNA的损失。然而，在缺乏Ago-1的情况下（C），可以观察到反义pRNAs的丢失和有义转录p21 pRNA的富集。来自配对T检验的平均值、标准偏差和p值显示自三份转染培养物。

讨论

显然，在正反义方向上转录的人类基因组数量要比先前设想的多得多[12]，[15]，[16]，[17]，[18]双向转录在细胞周期中究竟起什么作用，以及它是如何运作的尚不清楚。有趣的是，几个双向转录的基因在各自转录物的3′UTR中与互补的RNA对应物有显著重叠[18]该观察结果与大多数微RNA（miRNAs）靶向基因3′UTR的观察结果并置[19]可能暗示miRNAs在双向转录和非编码RNA的调节中可能发挥作用。

最近的双向转录例子已经证明了这些RNA在基因表达的表观遗传调控中的作用[14]，[20]，[21]我们在这里表明，siRNA介导的p21基因激活不是直接启动子靶向的结果，而是通过转录后抑制p21反义RNA（EST）起作用的Bx332409型这里的数据暗示了人类细胞双向基因调控的模型(图5). 在稳定状态下，内源性p21包含相当水平的正反义转录物(图5A和表S2). 当p21反义转录减少时，p21启动子处的低水平反义导向H3K27me3抑制标记丢失，p21义/mRNA表达增加(图5B). 该观察结果表明，通过p21反义转录物的作用，H3K27me3在p21启动子处得到了一定程度的富集，Bx332409型通过siRNAs或小反义RNAs利用的机制直接转录基因沉默[10]相反，p21正义/mRNA表达的减少导致p21反义介导的Ago-1募集到p21正义/mRNA启动子(图5C)随后不久，H3K27me3富集，类似于观察到的siRNA直接转录基因沉默的机制[10]相反的情况下，感觉转录物可以调节反义也可能是功能性的，尽管还没有数据支持这一点。无论如何，这种双向转录的不平衡导致显性反义RNA表达，从而导致感觉启动子的定向转录基因沉默的分子途径，可能解释了在一些人类细胞癌中观察到抑癌基因如p21的表观遗传沉默[22]。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1000258.g005.jpg
人类细胞中双向RNA介导的基因表达转录调控模型。

（A） 双向转录被认为是内源性p21基因表达的受控平衡，由此反义转录在p21感觉/mRNA启动子处指导Ago-1依赖的低水平表观遗传调控H3K27me3。（B） 在抑制反义转录后，定向H3K27me3减少，从而增强p21感觉/mRNA转录基因的激活。（C） 当p21感觉/mRNA表达受到抑制时，对p21反义转录物施加调节压力，允许p21反意义定向Ago-1和H3K27me3在p21感觉/mRNA启动子处富集。研究发现，在RNA定向转录基因沉默的早期阶段，Ago-1是必需的[9]因此，Ago-1在p21感觉启动子中的早期招募可能起到重新引导环的作用，从而对p21基因表达施加稳定的表观遗传沉默。

材料和方法

p21siRNA、E-cadherin 640和miR373转染和mRNA敲除

本研究中使用的所有siRNA(表S1)使用Silencer siRNA构建工具（德克萨斯州奥斯汀Ambion）生成。通过转染MCF-7细胞（～2.0×10）测定SiRNA转录活性∧（50–100 nM siRNAs，Lipofectamine 2000和/或RNAiMAX，Invitrogen，Carlsbad，CA）。48小时后收集培养物，进行计数以确定存活率，并分离出mRNA（RNeasy Mini Kit和Qiacube，Qiagen，Valencia，CA）。然后对细胞mRNA进行DNA酶处理（Ambion Turbo DNA-free，Austin，TX），并使用特定引物将约25 ng细胞mRNA转化为cDNA(表S1)或polydTT引物（iScript cDNA合成试剂盒，BioRad，Hercules，CA）。使用Ecad-ForqPCR和Ecad-RevqPCR以及GAPDHF和GAPDHR引物，用p21qRTPCRFor（Set2）、p21qRTPCRRev（Set2）或E-钙粘蛋白进行定量RT-PCR，并测定p21表达相对于GAPDH表达(表S1)如中所述[6]。

p21反义表达的斑点杂交分析

MCF-7细胞～4×10∧用对照或siBx332409（50 nM）转染6个，48小时后分离RNA。将总计500 ng的细胞RNA加热至95°C（10分钟），并在干冰中快速冷冻（～5分钟），然后将其吸附在预先清洗的（杂交缓冲液）上[3])硝化纤维素膜和交联膜。然后将细胞膜暴露于p21Bx332409型特异性5′生物素标记探针5′-ACT AAC GTT GAG CCC CTG GAG GCA CTG AAG TGC TTA GTG TAC TTG TAT TGG GGT CTG ACC AAC ACC TTC CAG CTG TAA CAT AC T GGC GAC TGT TTT-3′将其加热至95°C（10分钟）并在干冰中快速冷冻（～5分钟）。根据制造商描述的程序，将印迹和探针在37°C的杂交缓冲液中培养过夜，清洗，然后使用Ambion BrightStar BioDetect（Ambion，Austin TX）暴露。

双向转录的特征

为了确定双向转录物的表达水平，进行了定向RT-PCR。为了确定意义定向转录（相对于mRNA生成的方向），特别是在p21或E-cadherin的mRNA或编码区域，p21pRNA意义引物(表S1)或E-cadherin RevRace用于cDNA转换。而为了确定反义特异性转录水平（特别是在p21或E-cadherin的编码区），p21RNA反义或E-cadhelin ForRace引物(表S1)用于将mRNA转换为cDNA[13]当评估启动子RNA（pRNA）水平并应用相反情况时。为了表征意义定向转录（相对于mRNA生成的方向），p21pRNA反义引物(表S1)用于cDNA转换。而为了确定反义特异性转录水平（特别是在p21的编码区），p21RNA-Sense引物(表S1)用于将mRNA转换为cDNA。然后使用qRT-PCR和引物集1（pRNA特异）或2（mRNA特异）评估转换后的cDNA相对于dTT引物（SuperscriptIII Supermix，Invitrogen，Carlsbad，CA）的cDNA(表S1).

Ago-2表达的抑制

约5×105将MCF-7细胞转染三倍于相应siRNA(表S1)（100 nM siRNA，Lipofectamine 2000和/或RNAiMAX，Invitrogen），4小时后再次转染含有Ago-2特异性shRNA的质粒（500 ng/Lipofectamine 2000）。含有靶向Ago-2的shRNA的pENTER/H1/TO-Ago-2质粒[23]根据制造商描述的协议，克隆到BLOCK-iT诱导H1 RNAi进入载体试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，并通过序列分析确认。最后一次转染48小时后，收集培养物，并通过qRT-PCR分析测定p21表达，如前所述。

Ago-1表达的抑制

约5×105用对照pBSK+或pSH-Ago-1，一种shRNA表达质粒（BLOCK-iT，Invitrogen）（～200 ng质粒/2×10）三次转染MCF-7细胞∧5细胞，Lipofectamine 2000）靶向Ago-1中先前确定的易感基因座[23]20小时后，收集培养物，汇集在一起，并通过qRT-PCR评估Ago-1的mRNA表达是否符合GAPDH标准。

ChIP含量测定

MCF-7细胞（4×106/10 cm平板）转染p21-322、p21-Bx332409型p21si52、p21si130、p21si 858或对照siRNA R854（Lipofectamine 2000，1∶3 Vol∶Vol siRNA（100 nM）to Lipofeectamine）。48小时后收集培养物，并按照所述进行ChIP分析[7]使用抗乙酰基-H istone 3（Lys 14）（Upstate，Lake Placid，NY）、抗二甲基-H istone H3（Lys4）（Uptate，Lake-Placid，纽约）、抗双甲基-H estone 3(表S1).

核试运行

MCF-7细胞（～2×106)用siRNA（p21-322，Bx332409型，si-p21-858，或对照CCR5，50 nM，Lipofectamine 2000）。转染后24小时收集细胞，并根据先前公布的方法进行核连载试验[3]，[24]稍作修改。使用链霉亲和素偶联Dynabeads（Invitrogen，Carlsbad，CA）分离生物素标记的RNA。未从珠子中洗脱分离RNA，而是使用iScript cDNA合成试剂盒（加州Hercules BioRad）进行RT-PCR，同时仍与Dynabeads相连。定向RT反应是通过添加特定的寡核苷酸来进行的，这些寡核苷酸能够进行正或反义特异性cDNA转换(表S1)，直接添加到珠子混合物中。对每个样品进行三个独立的RT-PCR反应。在RT-PCR步骤后，将样品离心，使Dynabeads颗粒化，加热，并去除含有cDNA的上清液。然后对回收的cDNA进行qRT-PCR，以测定相对于GAPDH的荧光素酶表达水平。还使用斑点印迹来测量先前建立的程序中各自的核运行[3]使用ImageJ成像软件和按照GAPDH标准化的治疗样品测定相对网点强度。

支持信息

图S2

E-cadherin中预测的非靶点siRNA结合位点。（A）E-cadherin640[5]和miR-373[11]显示可以调节转录基因激活，可以在编码区或预计E-Cadherin特异性反义RNA重叠的地方结合E-Cadherin。已经报道了几种EST，并且可以根据使用程序Amplify的计算预测，结合E-cadherin 640和/或miR-373[14]（B）E-cadherin 640可以逆转转录E-cadherinmRNA。使用含有E-cadherins640反义序列同源性（sense/mRNA特异性）的引物逆转转录MCF-7总RNA，然后进行E-cadherine特异性PCR。（C） 反义miR373可以反转录E-cadherin mRNA。使用miR372反义引物（sense/mRNA特异性引物）反转录MCF-7总RNA，然后进行E-cadherin特异性PCR。（D） 与未经处理的细胞相比，经Ecad640或miR373处理的培养物表现出E-cadherin感观/mRNA表达增加，反义E-cadherin表达降低。用miR373或E-cadherin转染MCF-7细胞，48小时后通过定向RT检测E-cadherin的表达（使用E-cad qPCR引物，表S1).

（4.24 MB TIF）

图S3

抑制p21 mRNA表达。向MCF-7细胞转染以p21感觉（mRNA）转录物为靶点的各种siRNA。转染48小时后，评估培养物中p21 mRNA相对于GAPDH的表达。用配对T检验的平均值和P值的标准误差显示了三份处理过的培养物的平均值。

（217百万TIF）

图S4

Ago-1的抑制。先前显示Ago-1特异性shRNA（pENTR/H1/TO-Ago-1）抑制Ago-1表达[24]能有效抑制MCF-7细胞中Ago-1 mRNA的表达。配对T检验的标准偏差和P值的平均值显示为对三份经处理的混合样本进行三次测量的结果。

（1.73 MB TIF）

表S1

本研究中使用的寡核苷酸引物。

（0.06 MB文件）

表S2

p21的正反义表达与细胞数量有关。

（0.04 MB文件）

致谢

我们感谢David Corey与我们分享他对siRNA定向基因激活的见解。

脚注

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

该项目由R01 HL083473-02向KVM、斯克里普斯研究所的斯坦因捐赠基金和马里奥·卢维尼基金会向CP提供的奖学金资助。

工具书类

1Mattick JS公司。发育生物学的新范式。实验生物学杂志。2007;210：1526–1547。[公共医学][谷歌学者]
2Morris KV。siRNA-介导的转录基因沉默：组蛋白密码的潜在机制和可能作用。细胞分子生命科学。2005;62:3057–3066. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Morris KV，Chan SW，Jacobsen SE，Looney DJ。人类细胞中小干扰RNA诱导的转录基因沉默。科学。2004;305:1289–1292.[公共医学][谷歌学者]
4Janowski BA、Younger ST、Hardy DB、Ram R、Huffman KE等。利用启动子靶向双链RNA激活哺乳动物细胞中的基因表达。自然化学生物2007[公共医学][谷歌学者]
5Li LC、Okino ST、Zhao H、Pookot D、Place RF等。小分子dsRNA诱导人类细胞转录激活。美国国家科学院院刊。2006;103:17337–17342. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Han J，Kim D，Morris KV。人类细胞中RNA定向转录基因沉默需要启动子相关RNA。美国国家科学院。2007;104 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Weinberg MS、Villeneuve LM、Ehsani A、Amarzguioui M、Aagaard L、Chen Z、Riggs AD、Rossi JJ、Morris KV。小干扰RNA的反义链指导人类细胞中的组蛋白甲基化和转录基因沉默。RNA。2005;12 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Janowski BA、Huffman KE、Schwartz JC、Ram R、Nordsell R等。AGO1和AGO2参与哺乳动物转录沉默。自然结构分子生物学2006[公共医学][谷歌学者]
9Kim DH、Villeneuve LM、Morris KV、Rossi JJ。精氨酸-1指导人类细胞中siRNA介导的转录基因沉默。自然结构分子生物学。2006;13:793–797.[公共医学][谷歌学者]
10Hawkins P，Morris KV。RNA和基因表达的转录调控。细胞周期。2007;7 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Place RF、Li LC、Pookot D、Noonan EJ、Dahiya R.MicroRNA-373通过互补启动子序列诱导基因表达。美国国家科学院院刊。2008;105:1608–1613. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Schwartz JC、Younger ST、Nguyen NB、Hardy DB、Monia BP等。反义转录物是激活小RNA的靶点。自然结构分子生物学2008 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Weinberg MS，Barichievy S，Schaffer L，Han J，Morris KV。靶向HIV-1 LTR启动子的RNA调节不加区分的非靶基因激活。核酸研究2007 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Yu W，Gius D，Onyango P，Muldoon-Jacobs K，Karp J，Feinberg AP，Cui H。反义RNA对肿瘤抑制基因p15的表观遗传沉默。自然。2008;451:202–206. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Carninci P、Kasukawa T、Katayama S、Gough J、Frith MC等。哺乳动物基因组的转录图谱。科学。2005;309：1559–1563。[公共医学][谷歌学者]
16Katayama S、Tomaru Y、Kasukawa T、Waki K、Nakanishi M等。哺乳动物转录组中的反义转录。科学。2005;309:1564–1566.[公共医学][谷歌学者]
17Sun M，Hurst LD，Carmichael GG，Chen J.多细胞动物之间反义转录物丰度变化的证据，但反义转录与组织复杂性之间没有关系。基因组研究。2006;16:922–933. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Williams T，Fried M.两条DNA链的转录在其3′端产生互补mRNA的小鼠基因座。自然。1986;322:275–279.[公共医学][谷歌学者]
19Maziere P，Enright AJ。预测microRNA靶点。今日毒品发现。2007;12:452–458.[公共医学][谷歌学者]
20Camblong J，Iglesias N，Fickentscher C，Diepois G，Stutz F.反义RNA稳定通过组蛋白去乙酰化诱导酿酒酵母中转录基因沉默。单元格。2007;131:706–717.[公共医学][谷歌学者]
21Ebralidze AK、Guibal FC、Steidl U、Zhang P、Lee S等。PU.1的表达受一个共有的顺调控元件调节的功能性正、反义RNA的平衡调节。基因发育。2008;22:2085–2092. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Majid S、Kikuno N、Nelles J、Noonan E、Tanaka Y等。染料木素通过涉及活性染色质修饰的表观遗传机制诱导前列腺癌细胞中的p21WAF1/CIP1和p16INK4a抑癌基因。癌症研究。2008;68:2736–2744.[公共医学][谷歌学者]
23Meister G、Landthaler M、Peters L、Chen PY、Urlaub H等。新型精氨酸相关蛋白的鉴定。当前生物2005[公共医学][谷歌学者]
24张M、欧H、沈YH、王J、王J、科塞利J、王XL。小RNA对内皮一氧化氮合酶的调节。美国国家科学院。2005;102:16967–16972. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自PLOS遗传学由以下人员提供多环芳烃