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美国国家科学院院刊。2008年8月19日；105(33): 11915–11920.
2008年8月11日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0805434105
PMCID公司：项目经理2575310
PMID：18695239

靶向PCSK9的治疗性RNAi可大幅降低啮齿动物的血浆胆固醇和非人灵长类动物的低密度脂蛋白胆固醇

玛丽亚·弗兰克·卡梅内茨基,* 阿尔多·格雷夫霍斯特,† 诺玛·N·安德森,† 蒂莫西·S·拉西,* 比吉特·布拉姆拉奇,‡ Akin Akinc公司,* 大卫·巴特勒,* 克劳斯·查利斯,* 罗伯特·多尔金,* 范玉鹏,* 克里斯蒂娜·甘巴·维塔洛,* 菲利普·哈德维格,‡ 穆萨米·贾亚拉曼,* 马提亚斯·约翰,‡ K.Narayananair贾亚普拉卡什,* 马丁·迈尔,* 卢博米尔·内切夫,* Kallanthottathil G.Rajeev公司,* 蒂莫西·里德,* 英戈·Röhl,‡ 尤尔根·苏切克,* 帕梅拉·谭,‡ 黄蕴瑶,* 王刚（Gang Wang）,* 特蕾西·齐默尔曼,* 安东尼·德福格罗尔斯,* 汉斯·佩特·沃恩洛彻,‡ 罗伯特·兰格,§ 丹尼尔·安德森, 穆提亚·马诺哈兰,* 维克托·科特利安斯基,* 杰伊·霍顿,†‖和凯文·菲茨杰拉德*§
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补充资料

摘要

前蛋白转化酶枯草杆菌素/可欣9型（PCSK9）调节低密度脂蛋白受体（LDLR）蛋白水平和功能。PCSK9的缺失会增加肝脏中的LDLR水平并降低血浆LDL胆固醇（LDLc），而PCSK9活性过高会降低肝脏LDLR的水平并增加血浆LDLc。在这里，我们开发了能够靶向小鼠、大鼠、非人类灵长类（NHP）和人类PCSK9的活性、跨物种、小干扰RNA（siRNAs）。对于体内研究、PCSK9和对照siRNAs在脂质纳米粒（LNP）中配制。小鼠和大鼠体内PCSK9的肝特异性siRNA沉默使PCSK9 mRNA水平降低了50-70%。PCSK9转录物的减少与血浆胆固醇浓度高达60%的降低有关。这些效应被证明是由RNAi机制介导的，使用5′-RACE。在表达人PCSK9的转基因小鼠中，siRNAs使人PCSK 9转录物沉默>70%，并显著降低PCSK9血浆蛋白水平。在NHP中，单剂量靶向PCSK9的siRNA导致血浆PCSK9、载脂蛋白B和LDLc快速、持久和可逆降低，而对HDL胆固醇（HDLc）或甘油三酯（TGs）无明显影响。单次静脉注射后，PCSK9沉默的效果持续了3周。这些结果验证了以PCSK9为靶点的RNAi疗法作为一种特异性降低LDLc的方法，为开发PCSK9降低剂作为治疗高胆固醇血症的未来策略铺平了道路。

关键词：血浆PCSK9、组织LDLR水平

前蛋白转化酶枯草杆菌素/可欣9型（PCSK9）是哺乳动物丝氨酸前蛋白转换酶家族的成员，通常在分泌蛋白的蛋白水解过程和成熟过程中发挥作用(1,2). PCSK9是第一个与显性遗传型高胆固醇血症有关的家族成员(三). 针对小鼠和人类PCSK9功能的机制研究表明，PCSK9的过度表达或获得功能突变个人计算机9降低肝脏中的低密度脂蛋白受体（LDLR）蛋白水平，从而显著增加小鼠和人类的循环血浆胆固醇(4). 其他研究表明，删除件9在小鼠中，LDLR水平升高，加速低密度脂蛋白胆固醇（LDLc）的清除，并降低循环胆固醇水平(5). 最近，在小鼠身上进行的研究也表明，通过反义寡核苷酸降低PCSK9转录水平会导致血液中总胆固醇、LDLc和HDL胆固醇（HDLc）的降低，并且在治疗6周后肝脏中LDLR水平增加(6). 这种效果与在件9−/−老鼠(5). 总之，这些研究明确确立了PCSK9在胆固醇稳态中的作用。

PCSK9作为治疗高胆固醇血症的一个有吸引力的治疗靶点的验证来自人类的基因研究。科恩等。(7)首次发现的功能丧失突变PCSK9系列在达拉斯心脏研究中降低了血浆LDLc。在一项更大的15年前瞻性研究中，他们证明无义突变PCSK9系列非裔美国人LDLc水平降低28%，冠心病发病率降低88%(8). 尽管进行了基因验证，但潜在PCSK9修饰剂的几个生理方面必须进一步定义，以评估治疗潜力和益处。例如，PCSK9的急性降低（例如，超过48–72小时）是否会导致LDLc降低，如果是这样，这种降低是否与其他潜在的不良后果相关，如肝脂质增加？啮齿类动物缺乏胆固醇酯转移酶蛋白（CETP），并且在高密度脂蛋白（HDL）中携带大部分血浆胆固醇。因此，它们不是确定PCSK9沉默是否只会降低LDLc而不降低HDLc的理想模型。需要在更相关的模型中进行研究，例如非人类灵长类动物（NHP）。

目前，许多高胆固醇血症患者无法通过可用的治疗达到目标LDLc水平。为了解决通过siRNA机制抑制PCSK9的功效，我们设计并合成了几种siRNA治疗分子，以沉默小鼠、大鼠、NHP和人类的PCSK9 mRNA。使用脂质纳米粒（LNP）给药这些siRNA，以实现高效的肝细胞输送体内。这种方法使我们能够研究PCSK9系列多个物种中PCSK9 mRNA、血浆PCSK9蛋白、肝脏LDLR蛋白、总血清胆固醇、LDLc和HDLc浓度水平的沉默。这些体内研究表明，siRNA降低PCSK9对NHP中的血浆LDLc（而非HDLc）有急性影响。我们的数据验证了PCSK9作为siRNA治疗干预的靶点，并提供了治疗高胆固醇血症的策略。

结果

靶向PCSK9的活性siRNA分子的筛选和配制。

通过初步生物信息学分析和筛选，设计了一系列约150个具有跨物种反应性的siRNA在体外用于培养HepG2细胞的活性。根据其pM IC，选择活性分子PCS-A1、PCS-A2、PCS-B2和PCS-C2进行进一步研究50食蟹猴原代肝细胞的测定值[支持信息（SI）表S1].

某些siRNAs可以通过干扰素和促炎细胞因子诱导免疫反应(9,10). 这里研究的siRNAs旨在避免免疫刺激序列基序。选择用于进一步研究的siRNAs包含两个核苷酸3′末端，以阻止RIG-1通路的激活(11,12). 然而，对选定的siRNA也进行了原代人血单核细胞（hPBMC）免疫系统激活试验。具体而言，IFN-α和TNF-α在转染了表中所列每种分子的hPBMC中进行测量表S1发现亲本化合物PCS-A1可诱导IFN-α和TNF-α。然而，在这些分析中，其化学修饰型PCS-A2和化学修饰的双工PCS-B2和PCS-C2对IFN-α和TNF-α诱导均为阴性(表S1和图S1对于PCS-A1/PCS-A2配对示例）。这些结果表明，化学修饰能够减弱IFN-α和TNF-α对siRNA分子的反应。

LNP是一种由新型阳离子成分98N组成的类脂化合物12-5 (1)·4HCl(图1A类)胆固醇和聚乙二醇脂质(13). 我们已经证明，LNP形成的siRNAs靶向载脂蛋白B或因子VII介导体内5 mg/kg剂量下肝脏沉默，毒性最小，且不干扰内源性miRNA生物生成途径(12). 在这里，我们使用LNP在小鼠、大鼠和NHP中制定和测试针对PCSK9的RNAi治疗药物。

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类脂制剂和PCSK9在野生型小鼠中的沉默作用。(A类)配方的阳离子类脂成分结构。(B类)给药后2天肝脏PCSK9 mRNA的剂量依赖性下降（相对于对照组）(n个=每组6人）。(C类)小鼠肝脏PCSK9 mRNA和血清总胆固醇水平(n个=5/组）5 mg/kg LNP-PCS-A2或PBS剂量后3天(D类)小鼠肝脏PCSK9转录物沉默的持续时间(n个=5 mg/kg或7.5 mg/kg LNP-PCS-A2单次注射后。(B类)学生的单向方差分析t吨测试；(C类和D类)采用Bonferroni检验的双向方差分析。(B–D类)每个值为组平均值±STDEV。星号表示PBS和PCSK9 siRNA处理组之间的统计差异。**，P（P）≤ 0.01; ***,P（P）≤ 0.001

啮齿动物肝脏PCSK9 mRNA沉默导致血清胆固醇快速可逆降低。

件9−/−小鼠血清总胆固醇浓度降低了约50%(5). 为了测试PCSK9特异性siRNA对PCSK9转录物的急性沉默是否会导致血清胆固醇水平急剧降低，我们在LNP中配制了一种跨物种siRNA分子PCS-A2，用于研究体内通过小鼠和大鼠的尾静脉注射不同剂量的脂质形成的PCS-A2（LNP-PCS-A2）。

在小鼠中，采集肝脏以测量PCSK9 mRNA水平，并采集血液进行总胆固醇分析。如所示图1B类LNP-PCS-A2在5 mg/kg剂量下表现出剂量反应，PCSK9 mRNA最大沉默≈60-70%。mRNA转录水平的降低（最高剂量）转化为血浆总胆固醇≈30%的降低(图1C类). 血清胆固醇的降低与杂合子小鼠体内测定的胆固醇水平相似件9等位基因（5和J.D.H.，未发表的观察结果）。此外，对PCSK9转录物的影响持续约20天，高剂量显示初始转录水平降低更大，随后影响更持久(图1D类).

接下来，我们研究了对高剂量HMG-CoA还原酶抑制剂（他汀类药物）降低胆固醇有抵抗力的大鼠(14,15). 在大鼠中，LNP-PCS-A2的剂量为1-5 mg/kg，这导致PCSK9转录物的剂量依赖性减少，最高剂量时沉默50-60%(图2A类). mRNA沉默与血清总胆固醇急性下降50-60%有关(图2 A类和B类)持续10天，约3周后逐渐恢复到给药前水平(图2B类)

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大鼠肝脏PCSK9沉默、肝脏TG和LDLR水平。(A类)LNP-PCS-A2介导的剂量依赖性降低给药后3天肝脏PCKS9 mRNA和血清总胆固醇(n个=每组6人）。每个值为组平均值±STDEV。学生的单向方差分析t吨测试。星号表示PBS-和PCSK9 siRNA-处理组之间的统计差异*，P（P）≤ 0.05; **,P（P）≤ 0.01. (B类)LNP-PCS-A2治疗大鼠血清总胆固醇的降低(n个=6/组）在给药后2天达到最大值（≈60%），并在≈21天后恢复到基线水平。与PBS和LNP-Crtl组相比，PCSK9治疗组在统计学上具有显著性（直到大约第16天）（单向方差分析，Student’st吨测试，使用P（P）值≤0.05）。(C类)治疗组和对照组动物的肝脏TGs和胆固醇含量（与A类). 肝脏TGs无显著差异（ANOVA：P（P）胆固醇含量方差分析=0.824；P（P）=0.935（LNP-PCS-A2处理的动物与LNP-Crtl-或PBS处理的对照组的TG水平）。(D类)LNP-PCS-A2-、LNP-Crtl-和PBS治疗大鼠肝脏提取物的免疫印迹（与A类). 转铁蛋白受体（TFR）水平用于蛋白质负荷的正常化。（请注意，治疗后的动物通道15是一个明显的异常值，未上调LDLR，仔细检查也未降低PCSK9水平，可能是因为错误注射）。†，相对于PBS。

通过基因缺失、小分子抑制剂或siRNA降低参与极低密度脂蛋白组装和分泌的蛋白质（微粒体甘油三酯转移蛋白；MTP或apoB），导致肝脏TGs增加(16,17)（T.Z.，未发布数据）。为了确定通过抑制PCSK9降低胆固醇是否会改变肝脏脂质含量，对治疗组和对照组动物的肝脏胆固醇和TG浓度进行了量化。如所示图2C类与对照大鼠相比，给予PCSK9 siRNAs的动物的肝脏TG或胆固醇浓度没有统计学上的显著差异。

PCSK9影响血浆胆固醇水平的机制与肝细胞表面LDLR的密度有关(5,18–20).件9−/−与野生型小鼠相比，小鼠的肝脏LDLR蛋白水平高出2至3倍，而他汀类药物的作用更大(5). 同样，在6周内，高脂肪饮食小鼠PCSK9（使用反义寡核苷酸）的减少导致LDLR水平上调(6). 为了研究大鼠PCSK9 siRNA沉默后是否发生肝LDLR的调节，用5 mg/kg LNP-PCS-A2治疗大鼠后，通过免疫印迹分析定量肝脏LDLR水平。如所示图2D类与PBS或LNP-Crtl处理的动物相比，LNP-PCS-A2处理的动物的LDLR水平诱导显著增加3-5倍。总之，啮齿类动物研究表明，通过靶向PCSK9的siRNAs降低肝脏中PCSK9 mRNA的水平，会导致肝脏LDLR表达增加，从而导致血清胆固醇的急性持久性降低，而LDLR的急性表达变化与肝脏中过量的脂质积聚无关。

在体内PCSK9沉默的机制是siRNA介导的。

为了证实在啮齿动物中观察到的PCSK9转录物减少是由于siRNA机制，对治疗组或对照组大鼠的肝脏提取物进行cDNA末端快速扩增（5′-RACE），这是一种以前用于证明siRNA介导的卵裂发生的方法(21,22). 对LNP-PCS-A2治疗的动物肝脏mRNA的5′-RACE分析显示，产物的大小符合预期(图3). 对克隆的PCR产物的序列分析表明，这些产物中的84个产物中有73个来源于位置(GAGT公司/TTAT公司). 在PBS或LNP-Crtl处理的动物的5′-RACE实验中，没有扩增出特定的条带。这些结果表明，观察到的LNP-PCS-A2对肝脏PCSK9mRNA水平的影响与通过靶向RNAi特异性机制切割PCSK9转录物一致。

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siRNA介导的大鼠PCSK9 mRNA的切割（5′-RACE）。大鼠(n个=4/组），服用4 mg/kg LNP-PCS-A2、LNP-Crtl或PBS，4天后处死。5′-RACE在LNP-PCS-A2-中检测到预测的mRNA裂解产物，而在LNP-Crtl-或PBS-治疗的动物中未检测到预测mRNA裂解产品。圆圈带中87%的克隆映射到预测的siRNA特异性切割位点。

siRNA-介导的人PCSK9抑制转基因小鼠的疗效。

接下来，我们测试了LNP-PCS-A2和LNP-PCS-C2的能力（PCS-C2仅针对人类和NHP PCSK9 mRNA）（参见表S1)让人类沉默体内PCSK9为此，我们使用在apoE启动子下表达人类PCSK9 cDNA的转基因小鼠系(23). 设计了特异性PCR试剂和抗体，分别检测人类而非小鼠的转录物和蛋白质。将人源化转基因小鼠组注射单剂量5 mg/kg LNP-PCS-A2或LNP-PCS-C2，72小时后收集肝脏和血液。如所示图4A类，单剂量LNP-PCS-A2或LNP-PCS-C2能够将人类PCSK9转录水平降低>70%，这导致ELISA测定的循环人类PCSK9protein水平降低>500倍(图4B类). 这些结果表明，这两种siRNAs都能够沉默人类转录物，并随后减少循环血浆中人类PCSK9蛋白的数量。有趣的是，人类/NHP选择性PCS-C2的疗效与跨物种PCS-A2相当。这一结果验证了一种方法，即跨物种活性siRNA可用于RNAi治疗药物的开发。

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PCSK9人源化小鼠中人PCSK9 mRNA沉默和蛋白质减少。(A类)转基因小鼠(n个=4个/组）表达载脂蛋白E启动子下的人PCSK9全长cDNA，用LNP-PCS-A2和LNP-PCS-C2以及LNP-Crtl或PBS进行给药。根据给药后3天的定量PCR测定，LNP-PCCS-C2和LNP-PCS-A2均显著降低人转录物。每个值为组平均值±STDEV。（单向方差分析，学生的t吨测试，P（P）PBS-和PCSK9 siRNA处理组之间≤0.001）。(B类)与对照转基因小鼠相比，经治疗的转基因小鼠的循环人PCSK9蛋白水平降低(n个=每组4个）。每个值代表组平均值±STDEV。与PBS相比，PCSK9 siRNA治疗组的所有时间点具有统计学意义（双向方差分析、Bonferroni检验、，P（P）≤ 0.01).

RNAi沉默PCSK9可显著降低NHP中的PCSK9蛋白和血浆LDLc，但不降低血浆HDLc。

上述结果表明，靶向PCSK9的siRNAs可显著降低小鼠和大鼠的血浆PCSK9蛋白和总胆固醇水平，其作用在单次给药后大约持续3周。为了将这些发现推广到与人类更相似的脂蛋白谱更相关的物种，我们在食蟹猴中进行了类似的实验。

根据第3天的LDLc水平对动物进行随机分组。在给药当天（指定第1天），PBS和1mg/kg或5mg/kg LNP-PCS-A2、-B2和-Crtl作为单次输注在30分钟内给药。随着实验的进展，很明显，1mg/kg剂量对降低血浆LDLc无效(图S2). 因此，我们在第14天给PBS组动物服用5 mg/kg LNP-Crtl，以便它们可以作为接受5 mg/kg的LNP-PCS-A2和LNP-PCS-B2的动物的对照。PBS和LNP-Crtl处理的动物在所有测量的终点表现相似（未显示数据和图S2和S3A类).

如所示图5A类，5 mg/kg LNP-PCS-A2或LNP-PCS-B2的单剂量导致LDLc从剂量后的第3天开始在统计学上显著降低，该剂量在≈14天（对于LNP-PCS-A2）和≈21天（LNP-PCS-B2）内恢复到基线。在PBS组、LNP-Crtl组或1 mg/kg治疗组中未观察到这种效果(图5A类和图S2和S3A类). LNP-PCS-B2在给药72小时后平均降低了56%的LDLc，与给药前相比，四只动物中的一只实现了近70%的血浆LDLc降低（参见图5A类和图S3A类). 正如预期的那样，经治疗的动物中LDLc的降低与血清ELISA测定的循环载脂蛋白B水平降低的趋势相关(图S3B类).

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NHP中PCSK9沉默的药理学。(A类)5 mg/kg LNP-PCS-A2治疗的食蟹猴血清LDLc的直接测定(n个=每组5人），LNP-PCS-B2(n个=每组4人），或PBS(n个=每组3人）。(B类)总胆固醇/高密度脂蛋白比值，如A类. (C类)来自治疗组的血浆样本A类用ELISA法分析其PCSK9蛋白水平。LDLc、Tc/HDLc和PCSK9浓度的值以动物体内给药后平均值与给药前平均值的比值绘制。然后将这些值合并为组平均值。(A–C)LNP-Crtl在d4和d7上的表现与PBS相似（数据未显示）。PBS值是各组的平均值±STDEV（第3-14天的平均值）。每个值代表组±STDEV的平均值。采用双向方差分析和Bonferroni检验。星号表示PBS-和PCSK9 siRNA-处理组之间的统计差异。**，P（P）≤ 0.01; ***,P（P）≤ 0.001.

在本研究中，LNP-PCS-A2和LNP-PCS-B2治疗均未导致HDLc降低。事实上，这两种siRNAs导致（平均）总胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇比率下降的趋势(图5B类). 此外，血浆TG水平没有改变（数据未显示）。ALT和AST水平没有受到显著影响（同一只动物的诱导率比基线水平低3倍），但动物6002除外，其ALT增加了4到5倍，AST增加了4-9倍(表S2). 我们注意到，本研究中的动物是幼稚和非幼稚动物的混合物（每组一只幼稚），有几只动物基线时ALT或AST有所升高（动物6002为非幼稚性）。然而，观察到的胆固醇影响与这些测量无关，因为肝脏酶没有明显增加的动物与动物6002的低密度脂蛋白胆固醇降低相似(表S2和图S3A类).

由于这些实验是非终结性的，我们无法测量肝脏中转录水平的降低。作为siRNA处理对PCSK9转录沉默影响的替代物，我们通过ELISA测定了治疗和对照NHP的血浆PCSK9蛋白水平。如所示图5C类与给药前浓度相比，LNP-PCS-A2和LNP-PCS-B2治疗均显著降低血浆PCSK9浓度。在LNP01制定的siRNAs背景下测量循环PCSK9水平的一个警告是，与其他组织（如肠）相比，PCSK9在肝脏中的传递和沉默最大，肠中也表达PCSK9。因此，我们的测量结果可能低估了肝脏PCSK9蛋白的降低。然而，总的来说，这里检测到的血液PCSK9蛋白质水平的降低与观察到的LDLc和循环载脂蛋白B降低的程度和持续时间一致。

讨论

目前的高胆固醇血症护理标准对许多患者来说已经足够了，但对于其他无法通过现有治疗达到目标LDLc水平的患者来说却远远不够。尽管最近才进行了描述，但PCSK9代表了降低LDLc的最佳验证目标之一。人类携带PCSK9系列功能丧失突变显著降低血浆LDLc，并显著防止心血管疾病(8). 此外，人类复合物杂合子PCSK9系列-已确定零个人的LDLc极低（<20 mg/dl），但其他健康状况正常(24). 最后，PCSK9的作用在动物模型中高度保守，包括PCSK9系列转基因和敲除小鼠。

在这里，我们已经证明，通过药物和RNAi介导的降低肝脏中PCSK9转录水平，可以急性降低小鼠、大鼠和食蟹猴的血浆总胆固醇水平。小鼠和大鼠体内PCSK9 mRNA的沉默是特异性的，在使用5′-RACE的大鼠中，这种沉默作用被证明是通过RNAi机制介导的。如参考文献所述，脂质纳米粒制剂促进了PCSK9 siRNA向肝脏的传递。13制备的siRNA沉默了肝脏PCSK9 mRNA，导致肝脏LDLR蛋白水平显著增加。同样的siRNA在小鼠、大鼠、转基因小鼠和NHP模型系统中表现出沉默。

大鼠研究中的一个意外发现是PCSK9沉默可以显著降低总胆固醇，而众所周知缺乏他汀类药物的作用(14). 与其他提议的低密度脂蛋白c降低靶点（如MTP或apoB）相反，在没有证据表明肝甘油三酯增加或其他不良反应的情况下实现了这一效果，从而进一步验证了PCSK9是治疗干预的首选靶点。他汀类药物对血浆胆固醇的影响仅次于对NHP和人类LDLR水平的影响。我们的结果表明，至少在PCSK9水平及其对LDLR的控制方面，小鼠、大鼠、NHP和人类的途径是保守的。

啮齿类动物缺乏CETP，其血浆胆固醇大多以高密度脂蛋白颗粒形式存在。此外，啮齿动物体内的高密度脂蛋白也含有大量载脂蛋白E，这有助于低密度脂蛋白受体的清除。人类的遗传数据也证实，PCSK9的缺失会降低LDLc，但对HDLc没有影响(7). 因此，我们试图在一个更接近人类的模型（食蟹猴）中显示对LDLc降低的急性和特异性影响。在对食蟹猴的研究中，我们证明，单次30分钟输注两种不同配方的PCSK9 siRNAs可导致血浆LDLc、apoB和PCSK9蛋白水平的显著、急性、特异性和持久性降低，但HDLc或TGs没有降低。具体而言，siRNA介导的PCSK9 mRNA和蛋白的减少导致给药后48小时内LDLc降低≈50–60%；这种减少持续了近3周。如果NHP中观察到的≈50–60%的LDLc降低转化为人体，那么这种降低量将与当前胆固醇吸收抑制剂观察到的LDLc降低量相比较有利（服用依泽替米贝的人体中约20%LDLc下降）或HMG-CoA还原酶抑制剂（在PROVE-IT-TIMI试验中，普伐他汀降低约21%的LDLc，阿托伐他汀最高80 mg/d时，约51%的LDL c在30天内降低）(25,26). 此外，对小鼠的观察表明，PCSK9的降低和他汀类药物的活性可能协同作用(5). 在其他动物模型（如NHP）中测试这一观察结果是否属实将是一件有趣的事情。最后，通过PCSK9 siRNAs获得的急性LDLc降低可能对急性心肌梗死患者子集有益，因为急性心肌梗死可能需要快速降低LDLc(27).

总之，本文的结果证实了RNAi降低PCSK9是一种极具潜力的治疗方法，可以大幅降低LDLc，并为开发用于治疗高胆固醇血症的新型PCSK9降低剂铺平了道路。

材料和方法

靶向PCSK9的siRNAs的合成。

单品牌RNA由Alnylam Pharmaceuticals公司生产。根据既定程序，采用阴离子交换HPLC对粗寡核苷酸进行脱保护和纯化。siRNAs由等摩尔量的互补正、反义链退火产生。

将siRNA配制成LNP类脂质纳米粒。

类脂98N储备溶液12-5 (1)·4HCl、胆固醇和mPEG2000-在乙醇中制备DMG MW 2660（由Alnylam合成），并混合以获得42:48:10的摩尔比(13). siRNA以1:7.5（wt:wt）的比例并入纳米颗粒中。所得颗粒的平均粒径为≈50 nm，siRNA包埋效率>95%。

体外PCSK9 siRNAHepG2细胞和原代食蟹猴肝细胞的筛选。

在siRNA转染实验中，HepG2或原代肝细胞接种于2.5×10496 well板中每孔的细胞数。根据制造商的协议，使用Lipofectamine 2000转染siRNA。根据制造商的协议，转染24小时后对细胞进行裂解，并使用基于分支DNA技术的QuantiGene试剂系统（Panomics）对PCSK9 mRNA水平进行量化。PCSK9 mRNA水平归一化为GAPDH mRNA。

按照参考文献所述进行5′-RACE。20（请参见SI文本).

在体内啮齿动物实验。

在阿尼勒姆进行的动物研究中使用的所有程序都得到了机构动物护理和使用委员会的批准，并符合适用的地方、州和联邦法规。小鼠和大鼠保持12小时光照/12小时黑暗循环，并在黑暗循环结束时死亡。C57BL/6小鼠和Sprague-Dawley大鼠通过尾静脉注射以0.01 ml/g的体积接受脂质制剂中的PBS或siRNA。给药后，通过吸入异氟醚对动物进行麻醉，并通过逆行出血将血液收集到血清分离器管中。采用Wako胆固醇E酶比色法（Wako Chemicals）测定小鼠血清中的总胆固醇。在评估肝脏mRNA水平的实验中，采集肝脏并在液氮中快速冷冻。将冷冻肝组织研磨并制备组织裂解物。通过使用分支DNA分析（QuantiGene试剂系统，Panomics）测定裂解物中PCSK9 mRNA相对于GAPDH mRNA的水平。使用20μg经SDS/PAGE处理并转移至硝化纤维素膜的肝膜蛋白定量LDLR蛋白，如参考文献所述。20然后使用LI-COR Odyssey红外成像系统进行免疫印迹和成像(28).

表达人PCSK9转基因小鼠的研究。

参考文献中描述了表达人类PCSK9的转基因小鼠。23使用参考文献中描述的标准定量PCR方法，从肝脏提取物中测量人类PCSK9 mRNA转录。23.使用所述的夹心ELISA方法测定收集的小鼠血浆中的人PCSK9蛋白浓度(20,23).

NHP研究。

动物治疗由一家经认证的合同研究机构按照测试设施的标准操作程序进行，该程序符合美国农业部动物福利法案（9 CFR，第1-3部分）中概述的规定和实验动物护理和使用指南（ILAR出版物，1996年，国家学院出版社）。在给药的第一天（PBS组的第1天或第15天），给所有猴子静脉滴注LNP配制的siRNAs 30分钟。在给药后的不同时间点采集血样进行药效学分析。通过直接测量LDLc、HDLc、TGs和Tc进行血清化学实验。

PCSK9酶联免疫吸附试验。

采用夹心ELISA法对食蟹猴血液中PCSK9浓度进行定量分析，正如之前报告的对人类进行轻微修改的方法（参见SI文本).

其他材料和方法。

实验方案和试剂的详细描述见SI文本.

补充材料

支持信息：

致谢。

我们感谢John Maraganore提供的有益意见和指导；Maryellen Duckman和Nancy Heard提供图形协助；Thuchien Thi Nguyen、Sara Nochur和Akshay Vaishnaw提供有用的建议和意见；科尔斯汀·扬·霍夫曼、斯蒂芬·塞弗特、加里·拉文、谢尔盖·舒尔加·莫斯科伊、凯西·米尔斯、克里斯汀·登、纳丁·林奇、安德烈·韦泽尔、丹尼斯·米勒、阿斯特里德·德根哈德、迈克·鲍尔、阿比盖尔·卡波宾科、哈拉尔德·施贝尔、古恩特·奥特、多丽丝·特拉珀、乌西·鲍尔芬德、克劳迪娅·沃普曼、Y.K.何、劳伦·库布、图耶特·丹格、，和朱迪·桑奇寻求帮助和有益的建议。这项工作得到了佩罗家庭基金会、国立卫生研究院HL-20948和EB00244以及荷兰皇家艺术和科学院特默伦基金会的部分资助。

脚注

利益冲突声明：R.L.是Alnyam科学咨询委员会的股东和成员。D.G.A.和J.D.H.是Alynylam Pharmaceuticals的顾问。阿尼勒姆还拥有安德森博士、兰格博士及其同事在麻省理工学院发明的某些知识产权的许可证。M.F.-K.、T.S.R.、A.A.、D.B.、K.C.、R.D.、Y.F.、C.G.-V.、M.Jayaraman、K.N.J.、M.Maier、法律公告、K.G.R.、T.R.、J.S.、J.W.、G.W.、T.Z.、A.D.F.、M.Manoharan、V.K.和K.F.是Alnyam Pharmaceuticals的员工。B.B.、P.H.、M.John、I.R.、P.T.和H.-P.V.是罗氏Kulmbach的员工。

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