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《计算机神经学杂志》。作者手稿；PMC 2009年7月20日发布。
以最终编辑形式发布为：
《计算机神经学杂志》。2008年7月20日；509(3): 259–270.
数字对象标识：10.1002/cne.21744号
PMCID公司：PMC2573460型
尼姆斯：美国国立卫生研究院70746
PMID：18481275

老龄黑猩猩的成对螺旋丝Tau病

丽贝卡·F·罗森,1 AARON S.FARBERG公司,1 MARLA GEARING公司,2,三 子宫颈水肿,1 帕特里克·M·朗,1 丹尼尔·安德森,1 杰里米·戴维斯·图拉克,4 乔瓦尼·科波拉,4 丹尼尔·赫·格什温,4 杰夫·帕雷,1 蒂莫提·秦·DUONG,1,5 威廉·霍普金斯,1 托德·M·普鲁斯,1,2和拉里·C·沃克1,5,*
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

与年龄相关的神经退行性疾病的一个神秘特征是，在自然条件下，它们很少在非人类物种中完全表现出来。神经退行性τ蛋白病的典型表现是过度磷酸化、微管相关蛋白τ（MAPT）的细胞内聚集以及受影响神经元的功能障碍和死亡。我们记录了第一例老年黑猩猩的成对螺旋丝tau病(黑猩猩). 在整个新皮层以及在较低程度上在皮质外和皮质下结构中，从组织学角度确定了神经元胞体、神经丝和斑块状神经突簇中tau的病理形式。在超微结构上，神经原纤维缠结由τ免疫活性的成对螺旋丝组成，其直径和螺旋周期与阿尔茨海默病中的螺旋丝无明显区别。脑血管系统中存在中度Aβ沉积，老年斑块中较少。基因组中外显子和相关内含子的测序地图该基因座没有发现与已知人类遗传性τ蛋白病相关的突变，也没有发现任何具有明显功能意义的多态性。尽管这只黑猩猩的病变特征与阿尔茨海默病有所不同，但成对螺旋丝和Aβ淀粉样变的共存表明，老年黑猩猩中存在两种典型阿尔茨海默氏病病变（神经纤维缠结和老年斑）发病的分子机制。

关键词：Aβ、衰老、淀粉样蛋白、阿尔茨海默病、脑淀粉样血管病、神经变性、神经原纤维缠结、泛球虫、蛋白质病、老年斑、tau

τ蛋白病是一类人类神经退行性疾病，其特征是异常磷酸化的τ蛋白在细胞内聚集和选择性神经元丢失(Lee等人，2001年). Tau功能障碍可能在疾病发病机制中起主要作用，因为MAPT基因座的突变与这些Tau病中的几个相关(Goedert和Jakes，2005年). 在哺乳动物的神经系统中，tau通常与微管蛋白相互作用，以稳定微管并促进其组装(Mandelkow等人，2007年). 在神经退行性tau病中，tau被细胞内激酶过度磷酸化，这阻碍了蛋白质与细胞骨架元素的正常结合，从而增加了其聚合成更高分子量集合物的趋势，如神经纤维缠结(Ballatore等人，2007年;Mandelkow等人，2007年). 已知20多种人类τ蛋白病，每种疾病都有特定的临床表现和神经元和/或胶质细胞中非典型τ蛋白聚集的模式(Goedert，2004年;Lee等人，2001年;威廉姆斯，2006年).

最常见的τ蛋白病是阿尔茨海默病（AD），这是一种痴呆症，大脑的特定区域被神经纤维缠结以及脑血管壁老年斑块中的aβ肽沉积所困扰(Duyckaerts等人，1998年;Hardy和Orr，2006年). AD中的神经纤维缠结主要包括双螺旋丝，扭曲的τ带，其螺旋半周期为~80nm，表观直径在~8和20nm之间交替(克劳瑟，1991年). 尽管遗传和生物化学证据表明AD的致病级联反应是由异常的Aβ启动的，尤其是42-氨基酸形式（Aβ42）(哈迪和塞尔科，2002年)，tau病理学程度与认知能力下降密切相关(Arriagada等人，1992年;Crystal等人，1988年;Giannakopoulos等人，2007年;Wilcock和Esiri，1982年).

人类对阿尔茨海默病和其他τ蛋白病特别敏感，而且可能是独一无二的(Nelson等人，1996年;沃克和科克，1999年). 然而，现存物种的氨基酸序列相似性表明，Aβ前体蛋白（APP）和tau蛋白在进化上都是高度保守的。APP695的氨基酸序列在人类和黑猩猩中的一致性>99%(Cervenakova等人，1994年)两个物种的tau序列完全相同(Holzer等人，2004年). 此外，在人类大脑中发现的所有六种τ亚型也已在非人类灵长类中鉴定出来(Holzer等人，2004年;Nelson等人，1996年).

在正常衰老过程中，许多哺乳动物表现出脑Aβ淀粉样变(科克等人，1988年;Elfenbein等人，2007年;Erwin等人，2000年;Gearing等人，1996年;Gearing等人，1997年;Geula等人，2002年;Hartig等人，1997年;Kimura等人，2003年;Mestre-Frances等人，2000年;Nakamura等人，1996年;Nakamura等人，1997年;Poduri等人，1994年;Roertgen等人，1996年;沃克和科克，1999年;Walker等人，1990年)和Aβ在老年非人类灵长类动物大脑中的积累有时可以达到与AD相当的水平(Elfenbein等人，2007年)（R.F.Rosen，未发表的数据）。许多老年哺乳动物的胶质细胞和神经元中都有聚集的τ蛋白(Braak和Braak，1994年;科克等人，1988年;Hartig等人，1997年;Kiatipattanasakul等人，2000年;Nelson等人，1994年;Nelson等人，1993年;Nelson和Saper，1995年;Roertgen等人，1996年;Schultz等人，2001年)，但没有任何非人类tau病理学的记录病例完全重现了人类tau病中神经元内tau积聚的程度和位置。此外，从未在非人灵长类动物中发现具有AD样配对螺旋丝的神经元tau病理学(Erwin等人，2000年;沃克和科克，1999年). 在这里，我们首次证明了一只老年黑猩猩的类人配对螺旋丝存在τ蛋白病。

材料和方法

学科

一只41岁的群居雌性黑猩猩(黑猩猩)耶基斯国家灵长类动物研究中心（CO494）自发出现急性嗜睡和快速进行性运动功能障碍，提示中风。T2加权核磁共振（MR）扫描显示一个巨大的左半球病变，主要累及颞叶、顶叶和枕叶(图1B). 尸检时，对大脑进行了大体检查，确认左半球存在大量缺血性（非出血性）坏死。右半球大体正常。大脑总重量为287.5克，低于成年黑猩猩大脑的平均重量(Herndon等人，1999年)可能是因为左半球坏死。除15岁时首次诊断为慢性收缩性心脏杂音、中度肥胖（死亡时体重61.5 kg）和高血清胆固醇（1995年、2000年和2005年的总胆固醇水平分别为262、244和359mg/dl）外，既往病史无显著性。1995年进行的T1加权MR扫描显示大脑没有明显异常(图1A).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-70746-f0001.jpg

中风前后黑猩猩大脑的MR图像。A-D公司（顶行）：死亡前10年所做的一系列冠状T1加权MR图像的前后序列。E-H公司（下一行）：症状出现后拍摄的T2加权MR图像，用星号表示左半球受累组织的位置。[中风前未进行T2加权扫描]。

为了进行比较，从另外八只30至59岁的黑猩猩的新皮质和/或海马组织样本中检测了与年龄相关的Aβ和tau损伤(表1). 此外，作为MAPT基因分型的参考组，从Yerkes档案中选择了7只黑猩猩的冷冻小脑进行tau基因序列分析。所有研究均按照联邦和地方动物人道护理和使用指南进行。

表1

对补充的黑猩猩进行Aβ和τ病理学检查（档案材料）

主题性别年龄（岁）
N00-39磅（f）30
N00-40吨米34
N00-34磅米37
N01-20磅（f）41
Y06-147点米43
Y07-25磅（f）44
Y06-108磅（f）47
C-612型（f）56

脑组织样本的采集和制备

从右侧（无损伤）上颞皮质切除新鲜、未固定的组织块（～500 mg），以通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行分析。【ELISA的未固定组织样本也取自5例终末期AD患者的颞叶上皮层进行比较；表2]. 然后将大脑冠状切成约2cm厚，浸入10%中性缓冲福尔马林中至少7天。从前额叶、颞叶和枕叶皮质（避免梗死核心），以及间脑、苍白球、壳核、下脑干和小脑的一组双侧匹配组织块，在振动机上以50μm的厚度切片，并在4°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中保存在免疫染色之前。来自右颞叶的额外固定脑样本在30%蔗糖中冷冻，冷冻，并在冷冻滑动切片机上切割50μm厚。对八只参考黑猩猩的冰冻切片进行切片并以类似方式保存，所有冰冻切片均保存在-20°C的防冻液（30%蔗糖/30%乙二醇PBS）中，直到免疫染色。将黑猩猩CO494前额叶、颞叶和枕叶的单独双侧组织块石蜡包埋，切片厚度为8μm，并安装在硅烷化载玻片上（Newcomer Supply，Middleton，WI）进行银和免疫染色，以及其他组织病理学染色（见下文）。

表2

AβELISA检测AD病例

主题性别年龄（岁）PMI（小时）
操作系统02-159米615.5
OS03-300型（f）7512
OS02-106标准（f）812
E04-172号（f）876
OS01-128标准（f）912.5

PMI：尸检间隔

抗体和试剂

以下抗体用于免疫组织化学：自动变速箱8来自Pierce Biotechnology（Rockford，IL）的小鼠IgG1单克隆抗体（1:5000），Cat#MN1020，PBS中针对部分纯化的人PHF-tau培养，在磷酸丝氨酸202/磷酸苏氨酸205周围区域有一个表位，并且与正常tau不发生交叉反应(Goedert等人，1995年);CP13型（1:10000）小鼠IgG1单克隆抗体是由Peter Davies博士（纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院）慷慨捐赠的，它是用从阿尔茨海默病脑组织中纯化的PHF-tau免疫小鼠，通过详细描述的方法制备的Jicha等人（1999）.选择抗体与磷酸肽GYSSPG（phosphosphate S）反应)PGTPGSRS，其中磷酸化S是τ的磷酸丝氨酸202。未检测到与任何其他tau磷丝氨酸的反应性(Jicha等人，1999年);第一阶段（1:10000）鼠IgG1单克隆抗体，也来自Davies博士，是针对洗涤剂提取的PHF制剂制备的，并已被表位定位到磷酸丝氨酸396/404周围的区域(Greenberg等人，1992年;Otvos等人，1994年). 转染细胞裂解物的Western blots证实了特异性(Otvos等人，1994年);MC1公司同样来自Davies博士的（1:10000）小鼠IgG1单克隆抗体针对Alz50免疫纯化PHF进行培养，然后将表位映射到与Alz50相似的构象特异性区域，但不是FAC1(Jicha等人，1997年)（在同一研究中，蛋白质印迹和斑点印迹显示MC1对tau蛋白PHFs的特异性）；6E10型（1:5000）来自Covance（新泽西州普林斯顿）的小鼠IgG1单克隆抗体，Cat#SIG-39320，在PBS中纯化的蛋白G，针对Aβ肽的残基1-16进行培养，其表位位于残基3-8(Kim，1988年);4G8（1:5000）来自Covance的小鼠IgG2b单克隆抗体，Cat#SIG-39220，在PBS中纯化蛋白G，针对Aβ肽的残基17-24进行培养，其表位位于残基18-22(Kim，1988年). 6E10和4G8抗体的特异性在源参考文献中进行了描述。兔多克隆抗体361兰特和398兰特Pankaj Mehta博士（纽约州斯塔顿岛发育障碍基础研究所）慷慨赠送的礼物（均为1:15000），分别针对合成的aβ32-40和aβ33-42（加利福尼亚州圣何塞市AnaSpec），与PBS中的锁孔帽贝血蓝蛋白偶联。通过夹心ELISA和蛋白质印迹分析检测这些抗体的特异性(Potempska等人，1999年). 用人AD组织切片对磷酸化tau和Aβ的所有抗体进行免疫组织化学检测，并分别对异常tau积聚和实质及血管淀粉样沉积进行特异性染色。抗泛素（1:10000）从Dako（Carpintia，CA）（Cat#Z-0458）获得兔多克隆抗体，用于对抗从奶牛红细胞中分离的泛素，并用戊二醛与鸡丙种球蛋白结合，用人血浆蛋白固相吸收纯化（在Western blotting中，抗体标记对应于游离泛素和泛素结合物的条带）；抗GFAP（1:5000）纯化的来自Dako（Carpindia，CA）的兔抗血清的免疫球蛋白部分，类别号Z0334，针对从牛脊髓分离的胶质纤维酸性蛋白，用人和牛血清蛋白固相吸收纯化（通过交叉免疫电泳和间接ELISA与人血浆或牛血清无交叉反应）。抗体的免疫组织化学显示了人类AD和黑猩猩组织切片中预期的星形细胞染色模式。抗Iba1针对与Iba1的C末端相对应的合成肽（PTGPPAKKAISELP），从Wako（日本大阪）获得（1:10000）兔多克隆抗体，Cat#019-19741，在TBS中，通过亲和抗原层析从兔抗血清中纯化，一种17-kDa EF手蛋白，在巨噬细胞/小胶质细胞中特异表达，并在这些细胞激活期间上调。Western Blot（Imai等，1996）证实了特异性，抗体免疫组化显示了人类AD和黑猩猩组织切片中小胶质细胞染色的预期模式。抗α-突触核蛋白（1:300）兔多克隆抗体是Bernardino Ghetti博士（印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学）的礼物，针对α-突触核蛋白C末端的119-137残基（DPDNEAYEMPSEEGYODYE）肽进行培养(Piccardo等人，1998年). 帕金森病患者路易小体的特异性免疫标记证实了其特异性。Vectastain Elite试剂盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA）用于基于ABC的抗原-抗体复合物免疫检测。

组织化学

用3%H灭活组织切片中的内源性过氧化物酶2O（运行）2在甲醇中在室温下保持10分钟。在室温下，用2%的正常血清在0.2%吐温中阻断非特异性试剂结合1小时。对于Aβ免疫检测，切片在90%甲酸中预处理10分钟以暴露抗原位点。切片在4°C的一级抗体中培养过夜（用封闭血清在缓冲液中稀释）。冲洗后，在室温下将切片在生物素化二级抗体中培养1小时，冲洗，在亲和素-生物素复合物中浸泡30分钟，然后用二氨基联苯胺（DAB）或与镍络合的DAB进行显影（Vector Laboratories）。用人类AD病例的组织作为阳性对照，用非免疫小鼠IgG或兔血清代替一级抗体作为阴性对照。在某些情况下，在免疫染色后应用浅色苏木精复染。

采用双重免疫染色法对组织切片中的多种抗原进行定位。为了进行荧光免疫染色，将切片在2%正常山羊血清/0.1%Triton X-100中的PBS中在室温下封闭1小时，在4°C的小鼠单克隆抗体（在2%正常羊血清中稀释）中孵育过夜，冲洗干净，然后在Cy2-结合的抗鼠二级抗体（1:200；Jackson ImmunoResearch Laboratories，宾夕法尼亚州西格罗夫）。再次彻底冲洗切片，在4°C的稀释兔多克隆抗体中孵育过夜，冲洗，并放置在罗丹明-Red-X山羊抗兔二级抗体（1:200；Jackson）中90分钟。为了阻止内源性自体荧光，将双染色切片安装在凝胶涂层载玻片上，在70%乙醇中冲洗5分钟，并在室温下浸泡在1%苏丹黑（70%乙醇中，每次使用前过滤）中30分钟。在乙醇中通过3次冲洗去除多余的苏丹黑，并用Farmount水性安装介质（Dako）覆盖PBS中的切片，以进行荧光显微镜检查。为了通过标准透照光显微镜在同一切片中观察多个抗原，按照上述方法应用抗体进行单抗原/DAB免疫组化，但第一个抗体-抗原复合物用DAB+镍标记（黑色），随后的抗体只用DAB标记（棕色）。

最后，我们用刚果红、贝尔肖夫斯基和坎贝尔-盖利亚斯染色法对选定的切片进行染色，以检测AD型病变，用普鲁士蓝（Perls）染色法检测铁，用苏木精和伊红染色，用革兰氏染色法检测细菌（没有任何脑区细菌感染的证据）。使用Leica DMLB显微镜（德国Wetzlar）和SPOT XPlorer和FLEX数码相机（诊断仪器，密歇根州斯特林高地）拍摄光显微照片。使用蔡司LSM 510激光扫描共聚焦显微镜拍摄共聚焦图像。所有图像均在Photoshop（Adobe）中编辑，无需任何进一步操作。

Tau和Aβ病变的定量标测

在匹配的CP13-、R361-和R398-免疫染色切片中，对Tau病变（体内神经纤维缠结和免疫反应性神经突起的斑块样簇）和Aβ病变（脑Aβ淀粉样血管病[CAA]和实质[老年]Aβ斑块）进行双侧定位和定量，这些切片取自额叶前、颞叶、，和枕叶皮质使用神经清醒图像分析系统（MBF Biosciences，Williston，VT）。在额叶中回的头端水平进行前额皮质切片（Bailey&Bonin FE/FD；Brodmann区10/9/46）(Bailey等人，1950年;布罗德曼，1912年); 初级听觉皮层（A1）前方水平的颞叶皮层切片（TA/TE，Brodmann区20/21/22）；枕皮质切片位于月沟和枕极之间，包含V1区和纹状体外皮质（OB/OC；Brodmann区18/17）。

一名研究人员使用神经清醒系统对每个切片中发现的每个tau或Aβ损伤进行计数。每个离散细胞体或τ免疫活性元件簇被视为一个单独的病变。识别并计数了两种不同类型的τ斑块：神经炎斑块和点状斑块。同样，组织图上显示了每个不同的Aβ斑块或Aβ反应性血管轮廓。节段内空间连续的R361-或R398-阳性血管被视为单个病变；否则，分别计算离散的血管轮廓。根据每个截面的总平面面积计算免疫反应性病变的数字密度(Elfenbein等人，2007年). 使用配对方法对两个半球的病变密度进行统计比较t吨-检验，显著性设定限为p<0.05。神经管螺纹（未组织成斑块的τ阳性突起）在大脑中大量分布（参见图2)组织学上未进行定量。

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老年黑猩猩的Tau和Aβ病理学。A类：左前额叶皮层的Tau免疫活性躯体（箭头表示2个）和神经炎Tau斑块（箭头表示1个）。许多tau免疫反应过程（线）占据了中间的神经膜。抗体AT8。B类：右侧海马CA1区Tau免疫活性神经元（箭头）；注意附近锥体细胞的完整性。抗体AT8，苏木精复染。C类：双免疫组化切片显示左前额叶皮层的tau-（CP13/Nickel-DAB，黑色，最先发育）和Aβ-（R398/DAB，棕色）免疫反应。出现τ斑块（黑色箭头）和τ阳性锥体神经元（箭头）。灰色箭头表示Aβ免疫反应性CAA的病灶。请注意，τ斑块中没有Aβ核，这是该动物τ神经节局灶性堆积的典型特征。D类：大脑淀粉样血管病（箭头表示两条血管）和右侧颞叶新皮质的老年斑块（箭头）。抗体6E10。棒材=100μm（A、C）、50μm（B）、200μm（D）。

电子显微镜

为了进行超微结构分析，将左前额叶皮层的组织样本固定在4%多聚甲醛和0.5%戊二醛中，在磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.4）中清洗，并在四氧化锇（1%磷酸盐缓冲液）中浸泡20分钟。然后在磷酸盐缓冲液中冲洗，并在分级系列乙醇和环氧丙烷中脱水。将乙酸铀酰（1%）添加到70%乙醇中（浸泡35分钟），以提高电子显微镜中的对比度。然后将切片嵌入显微镜载玻片上的环氧树脂（Durcupan ACM；Fluka，Ft.Washington，PA）中，并在60°C下加热48小时。选择感兴趣的区域，从载玻片上切除并粘在树脂块上。用Leica Ultracut T2（Nussloch，德国）切割超薄切片，收集到单槽铜格栅上，并用柠檬酸铅染色。

对于免疫金EM，非固定切片在含有5%脱脂奶粉的PBS中预先培养，然后在Tris缓冲盐水（TBS）-明胶缓冲液（0.02 M Tris，0.15 M NaCl，1μl/ml鱼胶，pH 7.6）中清洗，以阻断非特异性位点。然后将切片在4°C的CP13抗体（1:10000）中在PBS-BSA中稀释培养48小时，在TBS-明胶中冲洗，并在室温下在黄金结合的山羊抗鼠Fab’片段中培养2小时（稀释度1:100；Nanogold[Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY]）。使用HQ银试剂盒（纳米探针）对金颗粒（1.4 nm）进行银增强。作为免疫标记特异性的控制，从培养液中省略一级抗体完全取消了相应抗原的免疫染色。然后按照上述方法将组织嵌入并切割。

所有薄片均使用蔡司EM10-C电子显微镜（德国Oberkochen）进行检查，并使用双视摄像头（加利福尼亚州普莱森顿Gatan Inc.）拍摄数字图像。

AβELISA

将未固定的右侧颞叶皮层组织在5体积的均质缓冲液（50mM Tris-HCl、150mM NaCl和蛋白酶抑制剂片[Santa Cruz Biochemicals，Santa Crux，CA]）中进行固液分离，然后在4°C下10万g离心60分钟，以生成“可溶”上清液。将颗粒在70%甲酸中进行探针渗透，并在4°C下以14000rpm离心60分钟，以生成“不溶性”上清液。根据制造商的说明，通过ELISA（瑞士纹影基因公司）测定每个提取物中的Aβ40和Aβ42。可溶性提取物在样品缓冲液中以1:50的稀释度稀释，不溶性提取物在1.0M Tris碱中中和，pH值为11（1:20稀释度），并在样品缓冲中稀释至总稀释度为1:1000。所有样本均重复运行。在450 nm处读取平板，并在4参数标准曲线上插值每个提取物的平均光密度值，以确定aβ浓度。

DNA提取和MAPT基因分型

41岁受试者未固定肝脏的基因组DNA（作为参考组，来自另外7只黑猩猩未固定小脑组织）采用采用固相可逆固定的大规模自动模板纯化系统进行纯化（马萨诸塞州贝弗利Agencourt Bioscience Corporation）。然后使用ABI染料终端化学对纯化的DNA样品进行测序。所有后续步骤都基于自动DNA测序方法的测序。ABI染料终止序列读取在ABI 3700/3730（Applied Biosystems）机器上运行，数据被传输到Linux机器。使用PHRED程序确定基本呼叫和质量分数(尤因和格林，1998年;尤因等人，1998年).

结果

Tau组织病理学

尸检免疫组织化学分析显示，病理形态tau抗体在大脑两半球多个皮层区域和皮层下结构（较小程度上）显示异常的细胞内tau免疫反应。在整个新皮质（受影响最严重的大脑结构），病变包括τ型神经元、神经丝和多样的斑块状神经节簇（“au斑块”）(图2A-C). tau病灶的区域密度在皮质区之间和皮质区内各不相同，并且有特别强烈的病理学病灶(图2A). 前额叶皮层样本中的病变最为丰富，其次是颞叶皮层和枕叶皮层，在所检测的新皮质区域中，τ蛋白病变最少(表3). 在海马体中，偶有τ阳性神经元(图2B)、神经丝和tau斑块存在，但数量远少于新皮质的大多数区域。tau斑块通常与聚集的aβ核心无关(图2C). 皮质下，tau免疫反应性主要以线状突起存在，不同程度地存在于苍白球、新纹状体和间脑，偶尔也存在于白质通路中。分散的免疫反应谱也出现在脑干下部，很少出现在小脑。总的来说，与新皮质相比，皮质下牛磺酸病较为少见。

表3

黑猩猩CO494双侧前额叶、颞叶和枕叶皮质的匹配组织块中的体内神经原纤维缠结和tau斑样免疫反应神经元簇的定量绘图数据。病变密度表示为所分析组织单位面积的病变数量。抗体CP13

地区#N-铭牌#P-菌斑#细胞体N-菌斑密度（#/mm2)#P-菌斑密度（#/mm2)细胞体密度（#/mm2)
利物浦足球俱乐部158793490.61320.30661.3546
LOC（锁定）58220.01820.02910.0802
长期资本22431380.06720.13140.4215
副本请求3946810.12460.14690.2587
世界车王争霸赛000000
RTC公司120250.00720.14360.1795

五十： 左；R： 右；FC：前额叶皮层；OC：枕皮质；TC：颞叶皮层；N斑块：τ神经炎斑块；P-菌斑：tau点状菌斑

在邻近的额叶、颞叶和枕叶皮质切片中，AT8和CP13抗体始终检测到最多的tau损伤。抗体PHF1检测到较少的损伤，抗体MC1识别tau上的AD型构象表位，检测到四种抗tau抗体中最少的缠结、tau斑块和神经丝。一部分神经元、斑块神经突和神经丝对泛素具有免疫反应性（未显示）。Campbell-Gallyas和Bielschowsky银染也能明显显示神经炎斑块和神经纤维缠结(图3). 未见颗粒空泡变性。这种动物中存在的τ-酮斑块促使我们确定τ-神经细胞是否可能起源于星形胶质细胞，如皮质基底细胞变性（CBD）中的“星形胶质细胞斑块”(小森等人，1998年). 左、右额叶皮层GFAP和CP13的双重免疫抑制显示，神经突起不是星形细胞突起(图4A). 小胶质标记物Iba-1的轴突也为阴性(图4B)和α-突触核蛋白（未显示）。

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老年黑猩猩左前额叶新皮质的银色病变。A类：Campbell-Gallyas染色的神经炎斑块（弯曲的黑色神经炎，箭头所示）。该斑块在邻近部位（未显示）抗金抗体CP-13呈阳性。B类：两个皮质细胞用贝尔肖夫斯基银染法染色。A和B的Bar=50μm。

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老年黑猩猩左前额叶皮层τ神经和反应性胶质细胞的双荧光免疫染色。通过共焦显微镜观察，tau斑块中的CP13阳性神经突（绿色）与GFAP染色的星形胶质细胞（品红色）没有共存(A类)也不与Iba1-免疫活性小胶质细胞（品红）共定位(B类). 神经胶质线对这些胶质标记物也是阴性的。A和B的Bar=20μm。

超微结构上，神经原纤维缠结由成对螺旋丝组成的致密神经元内束组成，其大小和螺旋周期与阿尔茨海默病患者相同(克劳瑟，1991年;Metuzals，1986年) (图5,图6B). 用抗体CP13进行免疫金标记证实了成对螺旋丝上存在磷酸化抗原表位(图5B、C).

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老年黑猩猩左前额叶皮层神经元成对螺旋丝的超微结构。A类：神经元内成对螺旋丝的高倍视图。扭曲的丝状带的平均半周期为～79nm，最大宽度为～20nm，最小宽度为～10nm。B至C：CP13/免疫金标记的神经元内成对螺旋丝。B类是CP13免疫反应神经元的低倍视图；原子核在左下方。由于厚厚的切片在切片前进行了免疫染色，免疫金优先修饰PHF（箭头）的周围。注意细胞质中成对螺旋丝的沉重束。C类显示了来自B.lf中细胞的CP13/免疫金标记的PHFs的更高放大视图：脂褐素。棒材=100nm（A）、1μm（B）和200nm（C）。

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阿尔茨海默病患者的Tau病。A类：光显微照片显示阿尔茨海默病中的τ免疫活性神经元（两个由箭头指示）和轴突簇（一个由箭头表示）；抗体AT8。B类：阿尔茨海默病神经元内成对螺旋丝的电子显微照片。丝状体的大小和螺旋周期与黑猩猩CO494中的丝状体非常相似(图5). 棒材=100um（A）和200nm（B）。

Aβ组织病理学

Aβ抗体免疫组织化学显示中度CAA(图2C、D)在所有检查的新皮质区域，以及轻微的局灶性Aβ斑块病理(图2D) (表4). 与人类一样，与颞叶新皮质相比，海马体中的Aβ沉积很少，基底神经节、间脑和下脑干中基本上没有Aβ沉积。小脑表现为非常轻微的CAA。在受累地区，大多数Aβ免疫阳性老年斑本质上是弥漫性的，这可以通过实质沉积物中刚果红染色/双折射的缺乏得到证实。Aβ42阳性斑块数量与Aβ40阳性斑块数量无显著差异，但CAA对Aβ42的免疫反应性略高于Aβ40(t吨=2.560; p=.0506）。令人惊讶的是，右半球、非中风半球的总CAA程度显著高于左半球(t吨=4.668; p=.043）(表4).

表4

黑猩猩CO494双侧前额叶、颞叶和枕叶皮质的匹配组织块中Aβ薄壁斑块和CAA的定量绘图数据。病变密度表示为单位面积组织分析的病变数，分别为针对Aβ40和Aβ42的抗体R361和R398

地区总Aβ40-CAA总Aβ42-CAA总Aβ40-菌斑总Aβ42-斑块Aβ40-CAA密度（#/mm2)Aβ42-CAA密度（#/mm2)Aβ40斑块密度（#/mm2)Aβ42-斑块密度（#/mm2)
利物浦足球俱乐部162298200.55121.01470.00680
LOC（锁定）4578000.17230.295700
长期资本6711212100.25050.33290.04490.0297
副本请求35866657261.22272.18100.19470.0851
世界车王争霸赛289966三00.99473.17740.01030
RTC公司11828443500.85922.03150.31310.3577

五十： left:R：右；FC：前额叶皮层；OC：枕皮质；TC：颞叶皮层

AβELISA

通过ELISA评估，来自黑猩猩非受损半球的颞叶新皮质样本中的不溶性Aβ40和Aβ42水平低于5个参考AD大脑中的水平。然而，黑猩猩体内的可溶性Aβ水平高于AD患者(图7).

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黑猩猩右侧颞叶新皮质（CO494）中的Aβ水平，与5名确诊AD患者的对照组中的水平相对，采用ELISA测定。A类：不溶性Aβ40（灰色，顶部）和Aβ42（黑色，底部）水平。B类：可溶性Aβ40和Aβ42水平。注意不溶性和可溶性Aβ在y轴上的不同刻度。条形图=AD组的标准偏差。

MAPT基因分型

基因组DNA序列分析显示，tau基因座（包括saitohin）没有发生具有功能意义的突变。在外显子7和9中发现了两个同义碱基对变化，而所有其他多态性均位于距离最近剪接位点40到145个碱基对的非编码区。仅在该黑猩猩的内含子3中发现了一个异常的4碱基对缺失，但该缺失被认为不太可能具有致病意义，因为它位于最近预测的剪接位点的67个碱基对中。

讨论

这是首次报道一只老年黑猩猩出现双股螺旋丝脑τ蛋白病。tau病变包括神经纤维缠结、神经丝和神经炎tau斑块；超微结构上，神经原纤维缠结由成对的螺旋丝组成，与阿尔茨海默病患者的螺旋丝没有区别(图2,图5,图6) (克劳瑟，1991年;Metuzals，1986年). 这只年老的黑猩猩还表现出大脑β淀粉样血管病和罕见的aβ免疫反应性老年斑的种典型特征(Gearing等人，1994年;Gearing等人，1996年).

这种黑猩猩类人τ病理学的动力尚不明确。对tau的表达或剪接的任何影响，无论是环境还是遗传，都可能改变tau病的发生概率(Hardy等人，2006年). tau基因的几个突变与人类原发性tau病有关(Goedert和Jakes，2005年;Lee等人，2001年). 然而，基因组中外显子和相关内含子的测序地图该受试者的基因座没有发现已知的tau病相关突变，也没有发现任何其他具有明显功能意义的遗传改变。人类中出现的两种扩展MAPT单倍型（H1和H2）被认为对神经纤维缠结的发生概率有不同的影响(Hardy等人，2006年). 然而，黑猩猩的tau单倍型是人类H1和H2单倍型的混合物(Conrad等人，2004年;Holzer等人，2004年;Pittman等人，2005年)目前尚不清楚这种基因结构是否会影响黑猩猩出现tau损伤的可能性。虽然还可能发现基因或表观遗传变化调节tau的致病性，但我们的分析表明，这种动物的tau基因中没有序列修饰，这可能导致类人tau病。

老年是人类AD和其他神经退行性疾病的最重要风险因素(Katzman和Kawas，1999年)年龄可能是导致这种黑猩猩tau病理学出现的原因。记录的最大使用寿命黑猩猩是59岁(Herndon等人，1999年). 此前研究表明，40多岁和50多岁的黑猩猩表现出大脑Aβ淀粉样变，主要以CAA的形式出现(科克和沃克，1993年;Erwin等人，2000年;Gearing等人，1994年;Gearing等人，1996年;沃克和科克，1999年)，但之前在黑猩猩中还没有发现显著的神经元内tau病理学(Gearing等人，1994年;Gearing等人，1996年;沃克和科克，1999年). 虽然在老年动物中偶尔出现τ免疫反应神经元和突起并不罕见，但对另外八只30至59岁的黑猩猩的档案、尸检组织样本进行免疫组织化学检查，发现τ免疫活性几乎没有异常（R.F.Rosen，未发表）。因此，虽然年龄可能在这种41岁的动物的tau病的个体发育中起到作用，但其他年龄相近或更大的黑猩猩的tau病变很少，这表明还涉及其他因素。

Tau病理学也可能与导致缺血性中风的条件有关，这在非人类灵长类动物中似乎是罕见的(Borkowski等人，2000年;Fish等人，2004年). 这项研究中的黑猩猩在其成年生活中胆固醇水平很高，高胆固醇血症被认为是中风和tau病的危险因素(Ohm和Meske，2006年). 此外，缺血损伤本身可能直接引发了这种黑猩猩的AD-like tau病理学。在人类中，流行病学证据表明脑缺血和痴呆之间存在关系，近三分之一的AD患者在死后有脑梗死的证据(卡拉里亚，2000年). 然而，关于缺血和tau病理之间关系的实验证据尚不明确。研究发现，人类中风后脑脊液中的总τ增加，但大脑中的磷-τ似乎没有升高(Hesse等人，2001年). 在大鼠实验性缺血部位的神经元中，tau通过cdk5相关机制迅速过度磷酸化(Wen等人，2007年). 然而，过度磷酸化仅发生在梗死区的神经元中，未观察到成对的螺旋丝和神经炎性牛磺酸斑。在这项研究中，黑猩猩的Tau病在两个半球都是晚期和广泛的，并且在梗死区域本身或邻近的新皮质中没有增加，这表明这些病变可能是在急性缺血事件之前出现的。虽然在我们取样的组织切片中，Perls铁染色并没有显示出以前有过微梗死的证据，但在黑猩猩死亡前几年，临床上无症状的微梗死可能导致tau病理改变的可能性无法消除。

淀粉样级联假说暗示Aβ的多重聚合是致病过程中的关键上游效应器，最终导致AD中神经原纤维缠结的生成(哈迪和塞尔科，2002年).体内和在体外证据表明，异常折叠的Aβ可以诱导神经元中tau的过度磷酸化和聚合(Bloom等人，2005年;Gotz等人，2001年). 特别是Aβ42:Aβ40的比率被假设为控制AD发生的风险(Kim等人，2007年;McGowan等人，2005年)越来越多的人认为可溶性Aβ低聚物起着关键作用(Catalano等人，2006年;沃尔什和塞尔科，2007年). 对这只黑猩猩（非中风）颞叶新皮质的ELISA检测显示，aβ42:aβ40的比例相对较高，与AD患者相似。此外，颞叶皮质中缓冲可溶性aβ（低分子量单体和低聚物）的水平远高于AD患者的平均可溶性aβ水平(图7). 因此，与神经原纤维缠结共存的Aβ谱表明，过量可溶性大脑Aβ42可能是导致τ蛋白病的原因。然而，应谨慎解释该动物体内的可溶性Aβ数量，因为Aβ前体蛋白可能会被与脑损伤相关的条件上调(Raby等人，1998年)，包括冲程(Popa-Wagner等人，1998年).

总之，我们报告了一例史无前例的老年黑猩猩出现神经元内成对螺旋丝、神经丝和神经炎tau斑块的tau病。受试者还表现出中度大脑aβ沉积，主要在脑血管中。尽管有着诱人的相似性，但这只黑猩猩和患有AD的人类之间也有重要的病理差异，特别是海马中神经原纤维缠结的罕见性，缺乏β淀粉样蛋白核心的不寻常、同向性神经炎斑块的存在，以及薄壁Aβ（老年）斑块的缺乏。然而，tau和Aβ病理学的出现表明，老年黑猩猩中完全存在产生AD两个关键特征的细胞和分子机制，即神经纤维缠结和Aβ淀粉样变。除了为人类和黑猩猩在生命后期的生物学相似性提供证据外，这些发现还迫使我们重新考虑人类是唯一随着年龄增长而表现出阿尔茨海默样tau病的灵长类动物这一假设。

补充材料

补充图1

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补充图2

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补充图3

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补充图4

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补充图5

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补充图6

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Supp Figs腿

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致谢

我们感谢C.Suwyn、X.Zhang、T.Nagaoka、S.Maxson、L.Strickland、H.Rees、S.N.Dodson、D.Cooper、R.Baul和C.Allen的协助，感谢P.Mehta和P.Davies的抗体，感谢M.Jucker、Y.Smith和S.Zola的有益讨论。耶基斯国家灵长类动物研究中心得到国际实验动物护理评估和认证协会的全面认证。

由NIH RR-00165、P01AG026423、P50AG025688和James S.McDonnell基金会21002093资助。

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