冠状病毒是一种阳性的RNA包被病毒，属于冠状病毒科家庭病毒目订单。这些病毒存在于多种动物中，可引起不同严重程度的呼吸道和肠道疾病(11,18). 在过去5年中，发现了几种人和动物冠状病毒，包括引起严重急性呼吸综合征（SARS-CoV）的高致病性病毒(34,58,60,64,68,69). 冠状病毒颗粒由螺旋状核衣壳结构组成，由核衣壳（N）磷酸蛋白和病毒基因组RNA之间的结合形成，其被脂质双层包围，其中插入三种或四种类型的结构蛋白：刺（S）、膜（M）和包膜（E）蛋白，仅对某些冠状病毒而言，血凝素酯酶（HE）蛋白（综述见参考文献14). 一旦产生了足够数量的新基因组RNA和结构蛋白，就会发生粒子的组装。病毒的组装和释放是病毒生命周期的最后阶段。
三跨膜糖蛋白M驱动冠状病毒的组装，冠状病毒萌芽进入内质网高尔基体间室（ERGIC）的内腔(32,33,62,63). M是最丰富的包膜蛋白，可对病毒成分进行分类，以整合到病毒中。主要由其跨膜结构域驱动的M齐聚被认为可以在ERGIC膜上形成M蛋白晶格(16,41). S和E膜蛋白通过与M的横向相互作用整合到晶格中，而N和病毒RNA与M C末端结构域相互作用，后者暴露于细胞溶质中(4,8,15,19,30,36,48,54,55). 冠状病毒S蛋白负责受体结合和膜融合，似乎在冠状病毒组装中没有任何主要作用。最近的研究表明E是一种形成离子通道的病毒孔蛋白(46,66,67). 尽管它与病毒粒子结合很小(7,22,40)，小E蛋白在病毒形态发生和出芽中起着重要但尚未完全理解的作用(20,35,70). 对包括严重急性呼吸系统综合征冠状病毒在内的冠状病毒进行的研究表明，冠状病毒基因组中E基因的缺失大大减少了病毒的生长和颗粒的形成(9,12,35,37,57). N蛋白通过独立于E和S蛋白与M蛋白的相互作用，自结合和包裹RNA基因组以并入出芽病毒(24,52,53,61). 对于SARS-CoV，N与M的相互作用被描述为独立于病毒RNA(25,45).
对小鼠肝炎病毒（MHV）、牛冠状病毒、传染性支气管炎病毒和传染性胃肠炎病毒的研究表明，E和M蛋白对于组装病毒样颗粒（VLP）是必要的，并且足够的，VLP与真实病毒具有相同的大小和形态特征(1,2,7,8,38,65). 然而，SARS-CoV VLP组装的最低要求仍然存在争议。Y.Huang等人描述了转染人293肾上皮细胞中VLP的形成，该细胞只需要M和N病毒蛋白的共表达(29). 相反，其他研究表明，共表达的M和E蛋白足以从转染的哺乳动物细胞中释放沉积颗粒(27)或昆虫细胞，使用杆状病毒表达系统(26,50). 一些团体已经提出用严重急性呼吸系统综合征冠状病毒VLP免疫作为一种有效的疫苗策略。这些研究中使用了昆虫细胞产生的VLP或哺乳动物细胞产生的嵌合MHV/SARS-CoV VLP(42,44).
我们的目的是描述哺乳动物细胞中调节SARS-CoV出口的分子机制。在这里，我们证明，尽管VLP很难从共表达M和E或M和N蛋白组合的细胞的培养基中回收，但SARS-CoV E和N与M的共表达允许在1天内释放显著水平的VLP。当共表达时，在VLP中发现三聚体S蛋白。因此，与其他冠状病毒明显不同的是，SARS-CoV的出口强烈依赖于三种结构蛋白：M、E和N。在病毒结构蛋白中添加荧光标记使我们能够可视化荧光VLP在活细胞中的出口。监测活细胞中VLP的出口将是研究SARS-CoV生命周期后期病毒和细胞因子参与的一个强有力的新工具。
材料和方法
细胞和培养条件。
Vero E6非洲绿猴肾细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养，该培养基补充有10%热灭活胎牛血清、100 U青霉素和100μg链霉素/ml，37°C，5%CO2.
质粒结构。
编码SARS-CoV M、E、S和N结构蛋白的cDNA是针对哺乳动物细胞优化的密码子，由GeneArt（德国雷根斯堡）合成。通过PCR扩增M cDNA，并将其亚克隆到pIRES质粒载体（BD Biosciences，San Jose，CA）中上游多重克隆位点的NheI和EcoR I限制位点之间。通过PCR扩增E cDNA，并将其插入到位于KpnI和NotI限制位点之间的pcDNA3.1质粒载体中，或插入到位于下游多克隆位点的SalI和Not限制位点间的pIRES质粒载体中。通过PCR扩增S cDNA，并将其插入到NheI和ApaI限制位点之间的pcDNA3.1质粒载体中。pcDNA-Nflag质粒是使用KpnI和XhoI限制性位点从原始pCRScript-Nflag（由德国雷根斯堡GeneArt生产）构建的。Flag标签与N cDNA的3′端融合，并由编码两个甘氨酸残基的六个核苷酸从N cDNA中分离出来。编码增强黄色（eYFP）、青色（eCFP）和绿色（eGFP）荧光蛋白和单体红色荧光蛋白（mRFP1）的cDNA(5)通过PCR从Clontech Laboratories（Takara Bio，Shiga，Japan）购买的质粒中扩增，并亚克隆到pcDNA3.1或pIRES载体中。然后使用ClaI和ApaI位点（S和N）或XhoI和MluI（M）限制位点将S、N或M cDNA插入荧光蛋白cDNA中5′。两个融合cDNA由编码甘氨酸的两个密码子分离。
抗体。
用兔抗每个蛋白C末端的多克隆抗体检测M和E蛋白。抗M C末端结构域的兔多克隆抗体购自ProSci，Inc.（Poway，CA）。抗E蛋白的兔多克隆抗体由Nicolas Escriou（法国巴黎巴斯德研究所）使用C末端肽产生。用购自Sigma-Aldrich的小鼠单克隆免疫球蛋白G1 M2抗体检测Flag标签。如前所述，用哺乳动物细胞中表达的纯化S三聚体免疫小鼠，获得抗S蛋白的小鼠多克隆抗体(31). 抗N蛋白的小鼠单克隆抗体是香港大学微生物学系陈国浩（K.H.Chan）慷慨赠送的礼物，按上述方法生产(56).
SARS-CoV VLP的瞬时转染和产生。
共8×105细胞被镀成75厘米2培养皿，孵育过夜，并根据制造商的说明使用FuGENE 6转染试剂（Roche，Basel，Switzerland）用质粒构建体转染。简单地说，将54μl FuGENE 6转染试剂与DMEM混合，然后培养5分钟，然后添加6μg每个质粒。FuGENE 6质粒混合物在室温下培养30分钟。丢弃细胞培养基，用3ml温DMEM替换。将FuGENE 6质粒混合物添加到细胞中。在37°C下培养3 h后，丢弃含有转染混合物的培养基，并添加10 ml新鲜培养基。培养细胞21或45小时。
SARS-CoV VLP的纯化。
在转染后24或48小时，收集细胞培养基，并通过低速离心（1000×克在通过0.45μm孔径的过滤器后，将清除的细胞培养基加载到20%蔗糖垫上，并使用SW41转子以28000 rpm超速离心3小时（加利福尼亚州富勒顿Belkman Coulter公司）。将含有VLP的颗粒重新悬浮在TNE缓冲液中（50 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，0.5 mM EDTA，[PH7.4]）。
VLP和细胞裂解物的蛋白质印迹分析。
对于纯化VLP的Western blot分析，将来自超速离心培养基的15μl再悬浮颗粒与5μl含有十二烷基硫酸锂的加载缓冲液混合，并加载到4%至12%的聚丙烯酰胺凝胶上（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini gels；Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用同一制造商的NuPAGE吗啉丙基磺酸钠（SDS）流动缓冲液进行电泳。或者，将48小时时间点的再悬浮颗粒装载在20%至60%蔗糖梯度上，并以26700 rpm超速离心3.5小时(27). 收集20个组分并通过Western blotting进行分析。对于细胞裂解物的Western blot分析，细胞在转染后24或48小时用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，并在含有1%Triton X-100、150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）和1 mM EDTA的裂解缓冲液中进行裂解，在冰上频繁涡流15分钟。然后通过16100×离心将裂解产物清除克在4°C下持续15分钟，并通过Western blotting进行分析。接下来，将15μl每种裂解液与5μl十二烷基硫酸锂加载缓冲液混合，并加载到聚丙烯酰胺凝胶上。为了检测E而非S，用二硫苏糖醇处理样品，并在95°C下加热5分钟，然后在聚丙烯酰胺凝胶上迁移。为了检测同一制剂中的E和S三聚体，在分别装入两种单独的凝胶进行E和S检测之前，将样品分开并处理或不处理。M和Nflag治疗前后的结果相似。
电子显微镜。
对于透射电镜实验，在转染后24和48小时收集转染细胞。用10 mM EDTA分离细胞，用2.5%戊二醛固定在二羧酸缓冲液中，并用1%四氧化锇（OsO）固定4)室温下，在二甲氨基甲酸盐缓冲液中放置1h。然后将细胞包埋在2%琼脂糖中，形成细胞块，在梯度系列乙醇中脱水，并包埋在环氧树脂中。超薄切片用2%醋酸铀酰水溶液染色45分钟，用雷诺兹柠檬酸铅染色30分钟。为了分析分泌的VLP，在20%蔗糖缓冲液上通过超速离心从细胞培养基中纯化VLP，并在20-60%不连续蔗糖梯度上分离，收集馏分10，然后在28000 rpm的TNE缓冲液（pH 7.4）中通过超速离心浓缩1 h。接下来，将5μl VLP悬浮液与等体积的阴性染色液（2%醋酸铀酰水溶液和2%磷钨酸盐溶液[PH7.0]）混合，放置在Formvar-carbon-涂层铜格栅上2 min，并排空多余的悬浮液。使用Philip CM100电子显微镜在80 kV电压下观察和拍摄格栅。
荧光显微镜。
对于固定细胞的荧光显微镜，Vero E6细胞生长在玻璃盖玻片上，转染，并在转染后24小时进行分析。细胞用PBS洗涤，细胞核用DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）染色，盖玻片贴在玻片上进行分析。使用ApoTome模块在AxioObserver Z1倒置电动荧光显微镜下对固定细胞进行可视化，并通过Axiovision 4.6软件进行引导，通过MRm AxioCam高分辨率电荷耦合设备相机（德国卡尔蔡司）获取图像。为了对活细胞进行荧光显微镜观察，Vero E6细胞在玻璃底培养皿（MatTech）中生长，转染，并在转染后24小时进行分析。清洗细胞，并将培养基改为Hanks平衡盐溶液-OptiMEM预热培养基。使用上述系统获得了活细胞的宽场图像采集。在香港大学Core Imaging Facility使用配备有旋转圆盘共焦成像系统（UltraVIEW ERS；Perkin Elmer，Shelton，CT）的AxioObserver Z1倒置机动荧光显微镜采集活细胞的共焦采集。对于布雷费尔丁A（BFA）治疗，细胞与每毫升6μg BFA孵育指定时间。为了释放BFA效应，细胞在1×PBS中清洗三次，并在正常培养基中重新培养指定时间。
结果
M、N和E结构蛋白的共表达推动了SARS-CoV VLP的高效生产和释放。
为了确定高效生产SARS-CoV VLP的最佳条件，我们选择在Vero E6非洲绿猴细胞系中共存不同结构蛋白组合，这允许SARS-CoV复制(34). 编码SARS-CoV结构蛋白M、E和N的cDNA是为在哺乳动物细胞中表达而优化的密码子。我们了解在转染细胞中保持低E/M比率的重要性，以确保E低掺入VLP并防止潜在的含E小泡形成，因此我们认为应适当使用pIRES双顺反子质粒。该质粒具有双重优势，可确保转染细胞中两个cDNA的共表达，并通过利用部分失活的内部核糖体进入位点（IRES）序列降低下游基因的翻译速率。因此，我们在pIRES载体中亚克隆了E cDNA上游的M。N由带有C末端标记的pcDNA质粒表达。Vero E6细胞未转染或仅转染pcDNA-E、pIRES-M或pIRES-M-E、pIRES-M加pcDNA-Nflag和pIRES M-E加pcDNA-Nflag（图。). 在转染后24和48小时，收集培养基和细胞。将培养基置于20%蔗糖垫上进行超速离心以分离VLP，并通过Western blotting分析组装到VLP中的SARS-CoV结构蛋白。
转染Vero E6细胞产生SARS-CoV VLP。（A） M、E和N的共表达是Vero E6细胞在转染后24和48小时高效分泌SARS-CoV VLP所必需的。用质粒转染Vero E6细胞单层，质粒驱动SARS-CoV结构蛋白M、E和标记N的表达，如每条通道顶部所规定。转染后24和48小时，通过Western blotting分析细胞裂解物和从培养基中分离的VLP中的蛋白质表达，如以下相应面板所示。样品在加载前用二硫苏糖醇进行热变性和还原。用针对每个蛋白C末端产生的兔多克隆抗体检测M和E蛋白。用识别Flag标签的M2单克隆抗体检测N蛋白。除了从超速离心培养基（底板）中检测丸粒中包含的E外，将印迹暴露1分钟进行信号检测，其中印迹暴露10分钟。印迹之间显示分子质量（单位为千道尔顿）和蛋白质标准物的迁移。（B） 双顺反子pIRES-M-E载体的使用抑制了E的表达水平，有利于M-E-N VLP的产生。用所示质粒组合转染Vero E6细胞，并在转染后48小时分析细胞裂解物和培养基，如图A所示。为了确保更好地检测E，VLP的浓度是图A的四倍。将印迹暴露10 s进行信号检测，但检测来自超速离心培养基（右下面板）的颗粒中包含的E除外，其中印迹暴露1 min。（C）分泌的病毒结构蛋白以蔗糖梯度混合。三个75厘米2用质粒转染Vero E6细胞培养皿，分别或联合驱动SARS-CoV结构蛋白M、E和标记N的表达。转染后48小时，通过Western blot控制细胞裂解液和20%蔗糖垫上超速离心培养基颗粒中的蛋白表达（左面板）。然后将超速离心细胞培养基中的再悬浮颗粒装载在20%至60%的不连续蔗糖梯度上，并通过超速离心进行分馏。收集了20个600μl的馏分（1到20个，从最轻到最重）。通过Western blotting（a to e）确定与每个组分相关的病毒蛋白的性质。装载前，对部分样品（15μl）进行热变性，并用二硫苏糖醇还原。蛋白质标准物的分子质量（单位为千道尔顿）和迁移显示在印迹的右侧。在两个单独的实验中生成了来自（i）pIRES-M、pIRES-M加pCDNA-E和pIRESM-加pCDMA-E加pCDNA-Nflag以及（ii）pCDNA-E和pIRES-M加pCDNA加Nflag.的样品。Ctrl，非转染细胞；E、 pCDNA-E；M、 pIRES-M；M-E、pIRES-M-E；M+N标志，pIRES-M加pcDNA-N标志；M-E+N标志，pIRES-M-E加pcDNA-N标志；M+E，pIRES-M+pcDNA-E；M+E+N标志，pIRES-M加pcDNA-E加pcDNA-N标志。
在转染后24和48小时，在转染pIRES-M、pIRESM-E、pIRES-M加pcDNA-Nflag和pIRES M-E加pcDNA-Nflag的Vero E6细胞的裂解液中都可以很容易地检测到M蛋白（图。，上部面板）。如前所述，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到三种主要形式的M，它们对应于不同的糖型：ca处的两条带。18和28kDa处，以及反映糖基化模式异质性的较高分子尺寸处的涂片(51). 正如预期的那样，转染后48小时细胞裂解液中检测到的M水平高于24小时。虽然在转染pcDNA-E质粒的细胞裂解液中很容易检测到与E对应的10-kDa蛋白，但在转染pIRES-M-E双顺反子载体的细胞中，其表达要低得多。在来自pIRES-M加pcDNA-Nflag和pIRES-M-E加pcDNA-Nflag转染细胞的细胞裂解物中以相似水平发现Nflag蛋白。检测到一条与表观分子大小为45kDa的蛋白质相对应的主带。
令人惊讶的是，病毒蛋白的共同表达显著影响了VLP生产的效率（图。，下部面板）。尽管在转染后24小时，在pIRES-M、pIRESM-E或pIRES-M+pcDNA-Nflag转染细胞的超速离心培养基中未检测到M，但在pIRES-M-E+pcDNA-Nflag转基因细胞的制剂中发现显著水平。同样，在这个早期点，仅在pIRES-M-E加pcDNA-Nflag转染细胞的超速离心培养基中检测到N蛋白。E的信号在24小时时低于检测极限，仅在48小时时可检测到。在VLP中发现少量E，这与冠状病毒颗粒中该蛋白的少量存在相一致，尽管它对病毒粒子的组装和出芽起着重要作用(9,20,37,57,65). 总之，只有当M、E和N蛋白共存时，才能在转染后24小时从培养基中分离出含有M和N蛋白的VLP。
在转染后48小时，从仅转染pcDNA-E质粒的细胞的超速离心培养基中发现E。这与之前发表的描述E蛋白分泌独立于其他病毒元件的数据一致(7,47,50). 此时，在pIRES-M和pIRESM-E转染细胞的超速离心培养基中检测到微量M，而在pIRES-M和pcDNA-Nflag超速离心培养液中发现显著水平的M和N。Mortola和Roy描述了Vero E6细胞中SARS-CoV M蛋白的独立分泌以及M-E VLP的产生(50)转染后4天。Y.Huang等人已经报道了转染293肾上皮细胞在转染后63小时产生SARS-CoV M-N VLP(29). 非常有趣的是，在这里描述的条件下，在转染后48小时，从pIRES-M-E+pcDNA-Nflag转染细胞中纯化的VLP中发现M和N蛋白的水平显著高于从pIRES-M+pcDNA-Nflag转基因细胞中提取的VLP。在这些条件下，我们也能够检测到E，但当细胞仅转染pIRES-M-E载体时，检测不到E。
为了验证转染pIRES-M-E的细胞产生M-E VLP的无效性不是由于E表达效率低下，我们进行了类似的实验，但从pCDNA-E质粒表达E，并在转染后48小时分析了细胞和培养基（图。). 正如预期的那样，与分别转染pIRES-M-E和pIRES-M-E加pCDNA-Nflag的细胞裂解液相比，转染pRIES-M+pCDNA-E和转染pCRES-M-E+pCDNA-Nflags的细胞裂解物中检测到的E水平更高（图。，左侧面板）。然而，E表达的增加既没有改善M-E VLP的产生，也没有改善M-E-N VLP的生成（图。，右侧面板）。相反，当使用双顺反子载体时，M-E-N VLP的生成量增加，如分泌的Nflag、M和E蛋白水平更高，并且在这些条件下E（培养基）/E（裂解液）的比率显著更高。这一结果表明，来自pIRES-M-E双顺反子载体的E和M的表达以及与N的结合有利于SARS-CoV VLP的产生。
然后，我们通过在超速离心细胞培养基上进行蔗糖梯度分离来研究分泌的病毒结构蛋白的共沉淀。如前所述，用单个质粒或质粒组合转染细胞。在这个实验中，我们使用E表达的单个质粒来验证当E在更高水平表达时，培养基中可能存在含E的囊泡。转染后48小时，在20%蔗糖缓冲液上超速离心清除细胞培养液，并将颗粒重新悬浮在TNE缓冲液中。作为对照，通过Western blotting（图。，左侧面板）。将颗粒装载在20%至60%不连续蔗糖梯度的顶部。在另一轮超速离心后，收集20个组分并通过Western blotting进行分析（图。，右侧面板a至e）。结果与图中描述的数据一致。当M单独表达时，在细胞培养基中发现很少蛋白质，并且在片段9中检测到微量蛋白质（图。). 与E或Nflag的共表达允许在细胞培养基中分泌稍高水平的M，并在组分7至11中检测到M，在组分10中富集（图。)或11（图。)分别是。在pCDNA-E或pIRES-M加上pCDNA_E转染细胞的培养基中的组分中未检测到E蛋白（图。). 当共存时，Nflag与M共沉淀（图。). 正如预期的那样，在表达所有三种病毒蛋白的细胞培养基中发现了更高水平的M、E和Nflag蛋白（图。). M和Nflag以比例水平存在于分数5至14中。在第8至10组分中检测到E，其中M和N蛋白也得到了富集。总之，这些结果表明，分泌的病毒结构蛋白在蔗糖梯度中共同沉积，因此强烈表明病毒蛋白与VLP相关。此外，在我们的系统中，仅表达E或与其他病毒蛋白联合表达E的Vero E6细胞中，含E小泡的分泌似乎不是主要现象。事实上，在所有条件下，细胞培养液中E的水平系统性地较低，只有与M和N共存时才能在组分中检测到。
总之，这些数据首次证实，所有三种M、E和N结构的SARS-CoV蛋白对SARS-CoV-VLP的高效生产和释放都很重要。
S被纳入包含SARS-CoV M-E-N的VLP中。
然后我们研究了SARS-CoV S糖蛋白是否可以并入分泌的M-E-N VLP。在pcDNA载体中对S cDNA进行了密码子优化和亚克隆。用pIRES-M-E、pcDNA-Nflag和pcDNA-S转染Vero E6细胞。转染后48小时，在细胞裂解液中验证了蛋白质表达（数据未显示）。为了监测S与M-E-N VLP的关联，我们对之前从培养基中纯化的VLP进行了蔗糖分馏（图。). 所有S、Nflag、M和E蛋白都被复合培养，并在对应于～40%蔗糖的组分9和10中富集。值得注意的是，S主要以天然三聚体形式存在于这些组分中（540 kDa），尽管我们也检测到低水平的单体（180 kDa，二聚体（360 kDa。这可能是由于样品处理和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条件造成的。用抗S抗体检测到的高分子量蛋白质在最轻组分1至6中发现。这些形式可能对应于形成聚集体的可溶性、非结合形式的S蛋白。我们之前描述了从哺乳动物细胞裂解物制备纯化SARS-CoV S三聚体时S聚集体的形成(31). 这一结果证实了所有四种严重急性呼吸系统综合征冠状病毒结构蛋白与可以从转染细胞的培养基中纯化的S-M-E-N VLP的结合。
S-糖蛋白三聚体并入SARS-CoV M、E和含N的VLP。pcDNA-S质粒与pIRES-M-E和pcDNA-Nflag载体共转染。在转染后48小时收集培养基，并在20%蔗糖缓冲液上超速离心，将颗粒重新悬浮在TNE缓冲液中，并在20至60%不连续蔗糖梯度上超速离心。收集20个组分（1到20个，从最轻到最重），并通过Western blotting进行分析。样品在加载前进行热变性并用二硫苏糖醇还原，以检测Nflag、M和E，或不加热且不还原，以分析S。将斑点暴露10 S以进行信号检测，但E除外，其中斑点暴露10 min。S、M、N、，在对应40%蔗糖的组分9和10中发现了E结构蛋白。用针对纯化的S三聚体产生的小鼠多克隆抗体检测S蛋白。箭头表示与S的三聚体和单体形式相对应的条带。分子质量（以千道尔顿为单位）和蛋白质标准物的迁移显示在斑点的右侧。
VLP萌芽进入核周隔室，并在小泡内运输至质膜。
接下来，我们通过电子显微镜研究了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒VLPs的亚细胞定位（图。). pIRES-M-E加pcDNA-Nflag和pcDNA-S共转染的Vero E6细胞在转染后24和48小时固定，并制备超薄切片用于透射电镜（图。). 在阳性细胞的细胞质中发现大量VLP，其直径在40至150 nm之间。观察到三种主要的亚细胞定位模式。首先，在核周隔室中发现了VLP，这些隔室具有一组液泡的外观（图。)或者，虽然很少观察到，但呈现了内质网的形态特征（图。). 转染后24和48小时，在切片上均观察到直径为300 nm至1.5μm的空泡。非常有趣的是，我们检测到一些VLP在液泡膜上发芽的事件（图。). 尽管VLP积聚在其中，但在该隔室中并未高度压实。此外，VLP出现了多晶型，也观察到了异质材料（图。). 在一些含VLP的液泡中可以看到管状结构，主要是在转染后24小时（数据未显示）。其次，在细胞质中分散的小泡中观察到VLP（图。). 这些囊泡在截面上的直径从200 nm到1μm不等，VLP内部更加致密。它们可以在核周含VLP的隔室附近找到，直至皮质区。这些囊泡中的VLP在大小和形状上看起来更均匀。第三，偶尔在细胞表面发现VLP（图。). 虽然我们无法观察到VLP包络周围明显的尖峰状结构，但偶尔也会检测到尖峰状突起（图。). 此外，VLP与细胞表面的结合表明存在棘波和受体识别。一些细胞中发现了非常高的VLP，呈现出细胞核碎片化和细胞膜破裂的凋亡特征（数据未显示）。这些细胞的细胞质中充满了游离或胞内的VLP。通过电子显微镜对从细胞培养基中纯化的负染色颗粒进一步研究释放的VLP的形态（图。). 很容易观察到直径为80至100 nm的圆形颗粒。同样，我们无法观察到VLP周围典型的尖峰电晕(21)但检测到从VLP突出的球状结构，这可能对应于三个峰值。总之，我们的数据表明，SARS-CoV VLP在Vero E6细胞的细胞内室中萌芽，并在囊泡内有效地运输至质膜，在那里释放。分泌的VLP的形状和大小符合SARS-CoV的形态特征，因此这些VLP应该是研究SARS-CoV病毒的组装和释放的一个安全和合适的模型。
SARS-CoV VLP的结构分析和细胞内分布。用pIRES-M-E、pcDNA-Nflag和pcDNA-S共转染Vero E6细胞。在转染后24和48小时固定细胞，并通过电子显微镜分析超薄切片（A至G）。（A） VLP存在于细胞内空泡（vc）和分散在胞浆中并与质膜（pm）结合的小泡（vs）中。箭头指向连接到单元表面的VLP。（B） 内质网管腔内和细胞质小泡内的大量VLP。n、 核心。（C） 液泡和小泡中存在VLP。箭头指向质膜下含有VLP的小泡。（D） 含有VLP的液泡的放大。黑色箭头指向萌芽的事件。（E） 在质膜下发现致密的含VLP的小泡。（F） VLP结合在生产细胞表面。箭头指示了两个膜结合VLP。（G） VLP与细胞丝状体结合。VLP表面可见尖峰状突起（箭头所示）。（H） 转染后48小时从细胞培养基纯化的负染VLP的电子显微镜图像。每个图片都会显示一个比例尺。面板A至D和面板F至G对应于转染后48小时固定的细胞。面板E中的图像取自转染后24小时固定的细胞。n、 细胞核；er、er；vc，液泡；vs，囊泡；pm、质膜。
组装和释放包含荧光标记结构病毒蛋白的VLP。
为了实时可视化SARS-CoV VLP的组装、贩运和释放，我们构建了质粒结构，允许病毒蛋白与荧光蛋白融合表达。开发了pIRES-MmRFP1-E、pcDNA-NeCFP和pcDNA-SeYFP构建物，并通过荧光显微镜分析了单个转染或共转染细胞中融合病毒蛋白的表达（图。). 我们没有包括荧光标记的SARS-CoV E蛋白的任何构建物编码，因为它不耐受荧光蛋白标记（C.Chan等人，未发表的数据）。荧光显微镜可以很容易地观察到所有嵌合病毒蛋白。在单独转染pIRES-MmRFP1-E的细胞中，MmRFP1融合蛋白主要存在于核周隔室，很可能是ERGIC/高尔基体（图。). 我们还发现MmRFP1位于细胞质内，偶尔也出现在质膜上。正如预期的那样，在ERGIC/高尔基体和单个转染细胞的质膜上都观察到SeYFP蛋白（图。). 这些表达模式与我们之前在感染Semliki Forest病毒表达载体后15小时观察到的MeGFP和SeGFP融合蛋白的表达模式类似(51). 在大多数细胞中，单独表达的NeCFP蛋白形成明亮的细胞溶质斑块，表明在缺乏功能性病毒蛋白伴侣的情况下，该蛋白在细胞溶质中聚集（图。). 这种模式可能反映了核衣壳的大内含物，这些内含物被描述为在HCoV、MHV-JHM和SARS-CoV感染细胞的后期积累(6,17,23)或者可能构成一个细胞溶质蛋白库，用来喂养病毒的出芽系统。有趣的是，当质粒共转染时，所有三种MmRFP1、SeYFP和NeCFP荧光蛋白都呈现出相似的细胞内分布，在细胞质和质膜中共定位（图。和图。). 当与MmRFP1、E和SeYFP共表达时，NeCFP蛋白的亚细胞分布发生了显著变化，很少发现明亮的胞浆斑块（图。和图。). 在共转染细胞中，NeCFP被贩运到细胞表面，表明与其他病毒蛋白发生了相互作用，导致NeCFP易位。然而，在共转染细胞的培养基中未检测到VLP（数据未显示）。总之，这些结果表明，尽管MmRFP1、SeYFP、NeCFP和E在Vero E6细胞中共表达时可能相互作用，但它们在细胞培养基中不会以VLP的形式释放。
荧光蛋白标记的病毒结构蛋白的表达和亚细胞分布。在玻璃盖玻片上生长的Vero E6细胞要么用单质粒转染（左面板），要么用编码MmRFP1、E、SeYFP和NeCFP蛋白的三种质粒共同转染（右面板）。转染后24小时，用DAPI染料处理细胞进行核染色，固定，并在配备ApoTome设备的荧光显微镜下进行分析，以获取光学切片图像。a、 b、g和h，MmRFP1；c、 d、i和j，SeYFP；e、 f、k和l，NeCFP；m和n，合并图像。对于所有情况，并排显示两个具有代表性的图像。
然后，我们推断，每次共转染只包含一个编码荧光标记病毒蛋白的质粒，就可以产生荧光VLP。在这些条件下，我们研究了Vero E6细胞在转染后48小时的蛋白表达和VLP的释放（图。). 作为阳性对照，我们监测了pIRES-M-E、pcDNA-Nflag和pcDNA-S转染细胞的VLP释放。正如预期的那样，在细胞裂解液和VLP制剂中检测到S、Nflag、M和E蛋白（图。，车道2和7）。虽然MmRFP1融合蛋白很容易通过荧光显微镜观察到，但无法通过Western blotting检测到。最有可能的是，当与mRFP1荧光标记融合时，针对M C末端结构域的兔多克隆抗体不能识别其表位。尽管在pIRES-MmRFP1-E+pcDNA-Nflag+pcDNA A-S转染细胞的细胞裂解液中检测到E、Nflag-和S蛋白（图。，通道3），培养基中未发现与纯化VLP相对应的蛋白质（图。，车道8）。我们得出结论，M的C末端mRFP1蛋白的融合抑制VLP的产生。相反，pIRES-M-E加上pcDNA-NeCFP加上pcDN A-S，以及pIRESM-E加上pcDNA A-Nflag加上pcDNA-SeYFP转染的细胞能够在细胞培养基中释放VLP，如病毒蛋白的存在所示（图。，泳道9和10）。在这些条件下，NeCFP蛋白被一种针对N的小鼠单克隆抗体检测到(56)并迁移到70 kDa的表观分子尺寸。
转染Vero E6细胞产生荧光VLP。（A） SARS-CoV荧光VLP最佳质粒组合的测定。通过Western blotting分析来自细胞裂解物（左侧面板）和来自培养基（右侧面板）的沉淀VLP的病毒蛋白。当N或S（9和10道）而不是M（8道）被荧光蛋白标记时，可以产生VLP。（B） 荧光VLP的产生以及NeCFP和SeYFP融合蛋白掺入VLP的效率。用指定的质粒组合（对应于面板A的第9和第10道）共同转染细胞，并使用蔗糖梯度分析培养基中纯化的VLP。与标记N（上印迹）相比，标记S（下印迹）产生的VLP产量更高。然而，eYFP标签大大减少了S在VLP中的掺入（较低的印迹）。箭头表示穗状三聚体和单体。
为了确认NeCFP或SeYFP病毒蛋白正确地并入VLP中，我们通过在20至60%蔗糖梯度上进行分馏来分析纯化的VLP（图。). NeCFP和SeYFP均与其他病毒蛋白共沉淀，表明它们被并入纯化的VLP中（图。上下面板）。M-E-NeCFP-S VLP浓缩在馏分10和11中。未检测到E蛋白，很可能是因为M-E-NeCFP-S VLPs在培养基中的含量低于M-E-Nflag-S VLPs，而其E水平已经很低。M-E-Nflag-SeYFP VLP在馏分9和10中更有效地生成和浓缩，尽管在馏分6、7和8中也发现了高水平的VLP。考虑到在这些组分中检测到高水平的M和Nflag，SeYFP的合并效率似乎低于S（参见图。带有图。，下部面板）。总之，我们的结果表明，通过加入标记的N或S融合蛋白，可以在Vero E6转染细胞中容易产生荧光VLP。
活Vero E6细胞中M-E-NeC/GFP-S VLP生成和运输的可视化。
然后，我们通过荧光显微镜研究了荧光SARS-CoV VLP在活转染细胞中的形成和转运。我们知道S在单转染细胞和共转染细胞的分泌途径中都有表达，因此我们推断N是监测SARS-CoV VLP组装的更好标记物。此外，我们已经证明M、E和N是SARS-CoV VLP组装和流出的关键因素，并预计含S的VLP可以通过ACE-2驱动的内吞作用内化回生产细胞，因此我们决定省略S。因此，pcDNA-NeCFP质粒要么单独转染，要么与pIRES-M-E共转染。在转染后24小时分析Vero E6细胞。在大多数pcDNA-NeCFP转染细胞中，eCFP信号非常明亮，集中在细胞核外围胞浆中的大聚集体中（图。). 相反，非常有趣的是，在pIRES-M-E和pcDNA-NeCFP共同转染的大多数细胞中观察到了不同的模式。在这些细胞中，eCFP荧光在细胞胞浆中更为弥漫：中等大小的明亮小泡集中在靠近细胞核的地方，较小且较暗的小泡分散在细胞质中，偶尔在细胞皮层区域出现亮点（图。). 周围培养基中的细胞外也发现了一些亮点。NeCFP分布模式的这种差异表明，NeCFP与共表达的M和E病毒蛋白组装，形成VLP，并从核周组装室进入细胞表面，荧光VLP释放到介质中。
活细胞中荧光SARS-CoV VLP的追踪。（A） 宽场荧光显微镜图像显示荧光VLP在pIRES-M-E加pcDNA-NeCFP共转染细胞的质膜上积聚（图b），而在单独表达NeCFP的Vero E6细胞中观察到强核周染色（图A）。（B） 表达M-E-NeGFP VLP的活细胞的共焦显微镜。观察到四类荧光信号：一个明亮且静止的大核周隔室（白色环行线）、较小且较暗的主动运输小泡（橙色环行线。补充材料中提供了视频。（C） 用BFA处理转染细胞可以改变荧光囊泡的运输。用pIRES-M-E加pcDNA-NeGFP质粒转染Vero E6细胞。细胞未经处理（a组）或用6 mg BFA/ml处理4小时（d组）或过夜（g组）。然后将BFA添加到未处理的细胞中，进行延时采集。图b和c显示与图a中相同的细胞，但在与药物孵育25分钟和70分钟后。或者，对BFA处理后的BFA进行清洗和回收分析（面板e和f以及面板h和i）。面板a、b和c、面板d和e以及面板g和h在不同的时间点显示相同的单元格。补充材料中提供了说明面板b、f、h和i的视频。
然后，我们进一步分析了荧光标记的N蛋白与M和E包膜蛋白在活Vero E6细胞中共存的贩运动力学。使用旋转圆盘共焦显微镜和适用于高速和高分辨率成像的电荷耦合器件相机采集图像。在这些实验中，我们用NeGFP融合蛋白取代NeCFP，该融合蛋白可被显微镜配备的氩激光激发。我们可以一致地识别出三种类型的含NeGFP的囊泡，其中荧光信号强度、大小和运动不同（图。; 补充材料中提供了相应的视频）。首先，在靠近细胞核的地方发现了最大和最亮的小泡，它们是静止的。第二，较小且较暗的囊泡活跃地运输，大多数时间以多向方式，与其他囊泡进行短暂的相互作用。偶尔，这些小泡以快速、单向的方式移动，距离更长，很可能沿着微管移动。第三，一些细胞在皮层区域出现亮点堆积，这可能与较小的分泌囊泡和释放VLP相对应。在细胞外发现了几个亮点，可能与产生细胞释放的荧光VLP相对应。这些结果表明，将荧光标记融合到核衣壳病毒蛋白的C末端使监测SARS-CoV VLP的流出成为可能。
然后我们研究了BFA的作用，BFA是一种真菌代谢产物，对分泌途径的细胞器有多种影响，包括抑制从内质网向高尔基体的转运，高尔基池与内质网的融合，以及跨高尔基网与内质体的融合(59). BFA已用于以前的研究，用于分析病毒蛋白转运和病毒组装(10,49). 在转染后24小时，获得了转染M-E和NeGFP的活Vero E6细胞的时间序列图像（图。; 有关视频，请参阅补充资料）。在第一次实验中，细胞要么没有被处理（图。)或用6μg BFA/ml处理4小时（图。)或过夜（图。). 在这些条件下采集几分钟后，将培养基更改为含有BFA的培养基（图。)或正常介质（图。和图。)分别是。获得了新的图像序列，并分析了荧光重分布。在BFA治疗后，我们观察到分散的荧光小泡融合成大的细胞溶质荧光簇，聚集在细胞中心并减少斑点（图。另请参阅补充资料）。用BFA处理细胞4小时后，大部分荧光出现在细胞核周围的大亮斑中（图。). 在胞质溶胶中仍然可以观察到囊泡，尽管它们的数量比未处理的细胞少。在BFA清洗步骤后，我们无法观察到荧光的大规模重新分布的任何明显可逆性（对比图。和图。). 与BFA孵育过夜后，荧光与大的细胞溶质簇和ER有关（图。)，在BFA清洗和恢复1小时30分钟后未观察到剧烈变化（图。)尽管网状室边缘的小管被拉长，但膜动力学似乎有所增加（图。; 另请参阅补充资料）。过夜BFA治疗后的3小时恢复期部分恢复了转染细胞中荧光小泡的运输（图。). BFA治疗后的恢复过程缓慢，由于重复暴露于激光诱导细胞凋亡，因此数小时内无法跟踪动力学。总之，我们的结果表明：（i）BFA诱导NeGFP相关隔间的重组，改变囊泡的形成和运输；（ii）为了恢复NeGFP关联隔间和囊泡运输的动态，BFA清洗步骤后需要数小时的恢复。需要进一步研究，以阐明亚细胞隔室VLP与什么相关，并描述与细胞结构相关的出口动力学。
讨论
SARS-CoV病毒有效组装和流出的最低分子要求仍然存在争议。我们在此描述了一种基于质粒的转染方法的开发，该方法可在允许的Vero E6绿猴肾上皮细胞中高效生产和释放SARS-CoV VLP。与其他冠状病毒的报告相比，我们证明了M、E和N三种SARS-CoV结构蛋白都是转染细胞有效组装和释放VLP所必需的。当S病毒包膜糖蛋白与M、N和E共存时，S的三聚体并入VLP。特别有趣的是，将荧光标记的N蛋白并入VLP中，可以可视化产生细胞中新生粒子的运输。荧光VLP为通过荧光成像技术研究严重急性呼吸系统综合征冠状病毒在活细胞中的逃逸机制和细胞机制的具体作用提供了一个新的强大模型。
其他研究小组描述了这两种昆虫中SARS-CoV VLP的形成(26,44,50)或哺乳动物(27-29)细胞，使用各种表达系统。Y.Huang等人是第一个报告在人类293肾上皮细胞中产生SARS-CoV VLP的人(29). 将编码M、E、N和S蛋白的人类密码子优化基因亚克隆到哺乳动物表达载体中，并在转染后63 h通过透射电镜监测转染细胞上VLP的形成。这些作者表明，在他们的实验条件下，M和N对于独立于E和S的细胞内VLP的形成是必要的和充分的，但VLP的分泌是无效的。此外，他们将S描述为促进VLP从细胞中成熟和排出的重要病毒因子，但M-N-S VLP在培养基中的释放仍然无效。相反，在我们的系统中，我们从M+N表达细胞的培养液中检测到可沉积的M和N蛋白，这表明M-N VLP可以形成和分泌（图。). 此外，E的共表达大大提高了在培养基中检测到的VLP的水平（图。)添加S不会影响VLP的生成速率（图。和数据未显示）。相比之下，谢等人(27)结果表明，在没有S和N蛋白的情况下，共表达的E和M蛋白在Vero E6细胞培养基中转染4天后释放。在该研究中，先前感染了含有T7聚合酶基因的重组痘苗病毒的Vero E6细胞，与编码MycHis或V5His标记的S、M、E和N结构蛋白的质粒共转染。然而，即使是单独表达，在培养基中也发现了可沉淀的E和M蛋白，与其他病毒蛋白相比，在VLP制剂中发现了非常高的E含量，这表明形成了含E的小泡。其他研究表明，MHV和传染性支气管炎病毒E蛋白单独表达会导致含E蛋白的囊泡的组装，其密度与VLP相似(7,47). 我们还从单个pcDNA-E转染细胞的培养液中发现了可沉积的SARS-CoV E蛋白，这表明E小泡分泌，但在蔗糖梯度分级后，我们在任何组分中都没有检测到它们，这表明其产生率较低（图。). 我们也可以在转染后48小时通过共表达E和M蛋白来检测M-E VLP，尽管水平很低（图。). 在我们的研究中，我们利用pIRES双顺反子载体来确保E和M的伴随表达，并保持E的低表达水平。我们表明，结合使用该载体系统和N的表达，可以确保在培养基中M-E-N VLP的水平稍好，E的大量掺入（图。). 当单独的pcDNA-E载体用于E表达时，表达了更高水平的E，并导致细胞培养基中E/M和E/N比率增加（图。). 我们无法得出结论，这是否是由于更高水平的E并入VLP或同时释放含E的囊泡和VLP所致。通过蔗糖梯度分馏对细胞培养基中病毒蛋白的分析表明，E仅在与M和N蛋白共表达时释放出显著水平，并与之共沉淀（图。). 我们在293T、HeLa和Huh-7人类细胞系中观察到有效的M-E-N-S VLP形成和释放（数据未显示）。一直以来，C.Huang等人报道的另一项研究显示，293T细胞中M-E-N-S VLP的形成和释放，其中作者使用了基于哺乳动物表达质粒的pCAGGS转染系统(28). Lokugamage和同事能够从2×10产生约1.3μg SARS-CoV VLP7293T电池(42). 最近，我们测量了从我们的系统中含有VLP的蔗糖馏分纯化的M-E-N-S VLP包膜中的S含量。从10μg到28μg的硫存在于VLP制剂中7VeroE6和293T电池（数据未显示）。
我们还通过透射电镜和纯化分泌颗粒的阴性染色研究了转染细胞中SARS-CoV VLP的形成和分泌（图。). 我们能够确定细胞质核周隔室中的出芽事件。含有VLP的小泡散布在细胞质内，并位于质膜下方。偶尔，分泌的VLP结合到细胞表面。我们在转染的Vero E6细胞中观察到的VLP相关亚群与SARS-CoV感染的Vero E6细胞在感染后3至5天所描述的含病毒亚群有显著相似性(23). 通过负染和电子显微镜，很容易在培养基沉淀物组分中检测到VLP（图。). 偶尔检测到从VLP包膜突出的球状结构，该结构应与尖峰蛋白聚合体相对应，但我们无法识别出任何显示典型冠状结构的颗粒，该结构是病毒粒子包膜上尖峰三聚体最佳结合的标志。
有趣的是，我们发现C末端标记或eYFP标签影响S三聚体并入VLP的水平（数据未显示或图。）。然而，Sflag和SeYFP蛋白仍然可以并入VLP，标签可以用作标记物。MHV也获得了类似的结果，其中S序列通过与GFP荧光蛋白融合而扩展(三). 这些数据可以用几个因素来解释：30-kDa荧光蛋白可能会引起几何约束；M-S相互作用对S合并很重要，可能会受到标签的影响；和S在病毒组装位点的保留可能受到干扰(43,48). 我们还尝试生产包含mRFP1荧光蛋白的VLP，该荧光蛋白融合到M的C末端（图。和). 虽然MmRFP1在转染细胞中表达，但VLP的产生被取消。M内域对M-N、M-E和M-S相互作用和VLP的形成至关重要(8,13,15,19)，其与荧光蛋白标签的融合可能会影响其结构和/或与其他伙伴相互作用的可用性。兔血清对M的C末端肽完全失去对嵌合MmRFP1的识别，这一假设得到了证实（图。，左侧面板）。
最后，尽管培养基中检测到的VLP水平显著降低（图。). 有趣的是，尽管在细胞胞浆中发现了单独表达的NeCFP或NeGFP，通常积聚在核周区域，但当与M和E共表达时，标记的N蛋白有显示囊泡分布模式的趋势（图。). 我们通过共焦显微镜分析了转染活细胞中NeGFP蛋白的分布和转运（图。). 当细胞与pIRES-M-E和pcDNA-NeGFP共转染时，NeGFP蛋白通常存在于细胞核附近的静止区室中，存在于散布在胞质溶胶中并积极移动的运输囊泡中，与其他囊泡产生短暂的相互作用，以及作为散布在质膜下皮层区域的小点，通常富含细胞突起。在活细胞周围的细胞培养基中也检测到荧光点。NeGFP的亚细胞分布与我们的透射电镜数据一致。最有可能的是，通过荧光显微镜确定的核周静态隔室和运输囊泡分别对应于核周液泡（观察到VLP出芽事件的膜）和电子显微镜发现的含VLP的囊泡。在细胞皮层区域观察到的荧光点可能对应于较小的分泌囊泡，其中含有较少的VLP-电子显微镜发现的囊泡中只含有一个VLP和/或释放的VLP，这些VLP结合在细胞表面。有趣的是，荧光囊泡的转运受到药物BFA的影响，众所周知BFA会影响分泌途径中的膜转运(39,59). BFA处理诱导荧光囊泡向后运输并融合成明亮的核周簇（图。). 长效BFA治疗抑制了囊泡运输，在质膜上没有发现荧光点（图。)在正常培养基中数小时后，囊泡运输恢复（图。).
总之，我们的数据表明M、E和N结构蛋白是SARS-CoV组装和流出的关键分子。活细胞中荧光M-E-NeGFP SARS-CoV VLP的产生和分析使我们能够识别沿着分泌途径具有不同速度特征的三种亚细胞结构。将使用先进的荧光显微镜技术进一步研究SARS-CoV组装和出口的分子和细胞决定因素。
