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《计算机神经学杂志》。作者手稿；PMC 2008年10月26日发布。
以最终编辑形式发布为：
《计算机神经学杂志》。2006年5月10日；496（2）：172–186。
数字对象标识：10.1002/cne.20944
预防性维修识别码：项目编号2572724
NIHMSID公司：NIHMS70038标准
PMID：16538679

Prox1在小鼠耳蜗发育过程中的表达

奥利维娅·伯明翰-McDonogh,* 伊丽莎白·欧斯特尔,詹妮弗·斯通,克利福德·R·休谟,Huy M.Huynh先生、和Toshinori Hayashi先生
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

我们对小鼠内耳发育过程中Prox1（一种同源域转录因子）的表达进行了分析，特别强调了听觉系统。Prox1在胚胎第11天开始的耳囊中，在发育中的前庭感觉斑块中表达。E16.5在成熟（肌球蛋白VIIA免疫反应性）前庭毛细胞中表达下调，随后在底层支持细胞层表达下调。在听觉感觉上皮中，Prox1最初在胚胎第14.5天在耳蜗底部的一条狭窄的细胞中表达。这条条纹覆盖了感觉上皮的全部厚度，包括发育中的毛细胞和支持细胞。在接下来的几天里，表达条纹延伸到顶点，随着感觉上皮的分化，Prox1局限于支持细胞的一个子集。Prox1和细胞类型特异性标记物的双重标记显示，外毛细胞瞬时表达Prox1。E18后，毛细胞中不再检测到Prox1蛋白，但在胚胎发生的剩余时间和出生后第二周，它继续在支持细胞中表达。在此期间，Prox1并没有在Corti器官的所有支持细胞类型中表达，但仅限于发育中的Deiters细胞和支柱细胞。在出生后的第二周，这些细胞中的表达保持不变，此时Prox1动态下调。这些研究为我们分析Prox1在脊椎动物感官发育中的作用奠定了基础。

关键词：毛细胞、听觉、Corti器官、Deiters细胞、柱细胞

简介

Corti器官是哺乳动物调节听觉功能的感觉上皮。它位于内耳的骨质耳蜗中。在Corti的成熟器官中，感觉毛细胞与非感觉支持细胞以高度定型的模式排列。有两种特殊类型的听觉毛细胞，内毛细胞沿内侧形成一排，外毛细胞沿外侧形成三排。毛细胞沿着Corti器官的长度按眼压方向排列，对高频的反应位于耳蜗底部，对低频的反应位于蜗尖。支持细胞位于毛细胞之间，形态多样。内毛细胞被内指骨细胞和边缘细胞包围，外毛细胞被Deiters细胞包围。位于内外毛细胞之间的是两排柱状细胞，它们围绕着一个被称为科尔蒂隧道的纵向充满液体的空间(雷齐乌斯，1884年;1926年举行;Lim和Anniko，1985年). 前庭感觉上皮（胞囊、球囊和嵴）也含有毛细胞和支持细胞。前庭感觉上皮中似乎只有一种类型的支持细胞。与耳蜗一样，前庭结构中有两种不同类型的毛细胞，称为I型和II型。

内耳的上皮成分，包括Corti器官，是从耳板发育而来的，耳板是头部外侧外胚层的一块，在早期发育过程中内化。在Corti器官中，新细胞的产生以从顶部到底部的梯度进行(鲁本，1967年)而毛细胞和支持细胞的显性分化方向相反。近年来，在脊椎动物内耳发育研究领域取得了一些进展，为理解脊椎动物的内耳发育做出了重要贡献果蝇属神经发育，因为神经发生的许多分子途径都是保守的(Myat等人，1996年;Adam等人，1998年;Haddon等人，1998年;Lanford等人，1999年;Shailam等人，1999年;Lanford等人，2000年;Zhang等人，2000年). 虽然这些研究对毛细胞分化所需的分子有了基本的了解，但对支持细胞发育的关键调控因子知之甚少。在果蝇属感觉器官、神经元和非神经元支持细胞都来自一个共同的前体，即感觉器官前体（SOP）。一些基因已被确定为对非神经元细胞的发育至关重要果蝇属通过基因筛选和最近的基因组方法检测感觉器官(Freeman等人，2003年). 其中一个基因在果蝇属胶质细胞发育普洛斯佩罗，一种同源域转录因子。突变分析表明普洛斯佩罗对于发育中的CNS和PNS中的胶质细胞来说都是必要的。普洛斯佩罗需要上调神经胶质特异性基因，通用控制模块(胶质细胞缺失)诱导胶质细胞分化(Freeman和Doe，2001年).普洛斯佩罗还调节苍蝇周围神经系统中的胶质细胞增殖(格里菲斯和伊达尔戈，2004年).

脊椎动物与Prox1普洛斯佩罗已定位于斑马鱼发育中的内耳(格拉斯哥和托马列夫，1998年)和鸡(Stone等人，2003年). 在鸡胚中，Prox1在耳囊区域高度表达，该区域将产生听觉和前庭感觉上皮细胞以及静态听觉神经节(Stone等人，2003年). 在雏鸡听觉上皮的发育过程中，Prox1蛋白首先在16期早期耳囊感音和神经原性区域的祖细胞中被发现(汉堡和汉密尔顿，1992年). Prox1在未成熟的毛细胞和支持细胞中表达，但在分化毛细胞中表达很快下调。当支持细胞分化时，Prox1的表达在更长的时间内下调，从基底乳头上皮中心的支持细胞开始，向神经侧和非神经侧扩散。上皮神经侧的支持细胞不会完全失去Prox1免疫反应性，但在成年后仍保持低水平(Stone等人，2003年;Stone等人，2004年).

为了确定Prox1是否在哺乳动物内耳支持细胞的发育中发挥作用，我们对其在小鼠中的发育表达进行了分析。小鼠在这一分析中有几个优点，包括Corti器官中的一组高度专业化的支持细胞，它们可以根据感觉上皮的形态和位置相互区分。此外，这些研究形成了一个基线，从中我们可以分析神经原途径突变的影响，以进一步确定Prox1在脊椎动物感觉发育中的作用。

在这项研究中，我们表征了Prox1蛋白在发育中的小鼠Corti器官和前庭器官中表达的时间和空间模式。Prox1在E11至E16.5的前庭上皮中表达。在胚胎第14.5天（E14.5），我们首先在发育中耳蜗基底端的毛细胞和支持细胞的前体中检测到Prox1。在接下来的几天里，我们看到表达扩散到顶点，随着感觉上皮分化，Prox1仅限于支持细胞。Prox1并不在Corti器官的所有支持细胞类型中表达，但仅在Deiters和发育中的支柱细胞中表达。这些细胞中的表达一直维持到出生后第二周，此时Prox1表达下调，在出生后第20天检测不到。

方法

动物

动物被安置在比较医学系，所有程序均按照华盛顿大学动物护理委员会的指南进行。胚胎取自从哈兰（印第安纳波利斯）购买的瑞士韦伯斯特或CBA小鼠的定时妊娠交配。我们使用Theiler（1989）的分级系统在收获时准确地分级胚胎(http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Atlas/intro.html). 对于出生后的动物，P0定义为出生日期。数学1-GFP小鼠取自简·约翰逊（德克萨斯大学西南分校）；这些小鼠的产生和特征已经在前面描述过了(Chen等人，2002年;Lumpkin等人，2003年).

组织学/免疫荧光

在胚胎第11、12、14、14.5、15、15.5、16.5和18.5天从定时怀孕的瑞士韦伯斯特雌性大鼠身上采集胚胎。在室温下将整个头部固定在4%多聚甲醛中2小时。还从P0、P3、P4、P5、P6、P10、P12、P20和成年小鼠（瑞士韦伯斯特和CBA）获取内耳组织。每个时间点至少检查三只动物。对于P0至P6小鼠，在室温下将整个头部浸泡在4%多聚甲醛中2小时。对于P10动物，在将颞骨浸入固定剂中2小时之前，快速取出颞骨，取出镫骨，并在耳蜗顶部开一个小口。对于P12至成年动物，在将颞骨浸泡在固定剂中2小时之前，进行迷路内固定剂灌注。对于胚胎和一些出生后的组织，将组织在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）的多次变化中洗涤1小时以上，在蔗糖浓度不断增加的连续变化中冷冻保护，包埋在OCT中，并在10μm下切片。切片收集在SuperFrost载玻片上，风干不超过30分钟。切片平面的方向是通过耳蜗产生中耳切片。在PBS中清洗其他作为表面准备的产后组织3次，并从耳蜗上仔细解剖器官片段（半圈）。从内耳中分离出胞囊，并去除耳蜗。

对于免疫荧光，在PBS中清洗切片，然后将Corti器官的切片或自由漂浮的胞囊、球囊和片段与10%的正常山羊血清在PBS/0.1%TritonX100中孵育20-30分钟，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜，在PBS/0.1%TritonX100中稀释。第二天，用PBS/0.1%TritonX100冲洗组织，用荧光结合二级抗体孵育30-60分钟（分段）或90分钟（半圈），用PBS冲洗并盖上Flouromount G（Southern Biotechnology Assoc.，Inc.）（分段）或安装在含有核标签碘化丙啶（Vector Laboratories）的Vectashield防褪色安装介质中（半圈）。使用的主要抗体如下：以1:1000稀释度使用兔抗Prox1（Chemicon，AB5475）；小鼠抗p27抗体（BD Transduction labs，610241），在抗原回收后以1:100稀释使用10mM柠檬酸钠，pH 6.0；以1:5000稀释度使用的豚鼠抗肌球蛋白VIIA（哈佛医学院Stefan Heller赠送）；小鼠抗S100A1（Dako）在1:300使用。使用的二级抗体为山羊抗小鼠Alexa 594、山羊抗兔Alexa 584和山羊抗豚鼠Alexa 488，均来自分子探针，并以1:400的比例使用，以及来自Aves Labs的山羊抗鸡荧光素。使用Photometrics CoolSnap CCD相机和Slidebook软件，在蔡司Axioplan显微镜上拍摄切片图像。使用MRC-1024共焦激光扫描显微镜（Bio-Rad）对Corti半弯器官作为整体进行检查，并使用激光夏普2.1版（Bio-Read）收集图像。使用NIH Object Image（2.10）、ImageJ（1.32）和Photoshop 7.0（Adobe）软件对共焦图像进行进一步处理。

这些实验中使用的Prox1兔抗血清是针对Prox1蛋白的C端15个氨基酸生成的(Bagri等人，2002年). 这种抗血清剂在早期晶状体中提供了预期的免疫染色，我们使用免疫肽证明了我们在内耳中看到的模式是特定的（参见补充图S1). 从Stanislav Tomarev（NEI）获得的大部分Prox1蛋白产生的抗血清的结果类似。本研究中使用的p27抗体是针对小鼠Kip1产生的，并通过western blot显示出27kD的特异性条带（BD Transduction labs，610241，包装说明书）。来自Dako的S100A1是针对人类S100A1产生的，制造商进行的western blot也证明了其特异性，并在小鼠内耳中描述了这种抗血清的染色Woods等人，2004年:Sage等人，2005年)通过注射亲和纯化的六组氨酸标记的肌球蛋白VIIA尾蛋白（氨基酸845-994），在豚鼠（Covance）中产生鼠肌球蛋白VIIA的多克隆抗体（斯坦福大学Stefan Heller赠送），该尾蛋白使用Gibco/BRL pFastBac杆状病毒表达系统在SF9昆虫细胞中表达。该抗血清识别毛细胞，并显示与其他兔肌球蛋白VIIA抗体相同的染色模式(Hasson等人，1997年;Sahly等人，1997年).

原位杂交

在Hank’s pH 7.3（HBSS）缓冲盐水溶液或PBS中解剖组织，并在室温下将其固定在改良Carnoy’s中2-4小时。然后将样品脱水，并在4°C下用100%乙醇清洗过夜。将组织包埋在石蜡中，并收集6-8μm切片。制备了地高辛标记的Prox1探针NT 41-2210（cDNA是Stanislav Tomarev赠送的），并根据Etchevers等人(Etchevers等人，2001年). 使用抗地高辛碱性磷酸酶结合二级抗体（罗氏生物化学）对原位产物进行可视化。

结果

Prox1在前庭上皮中的表达

以前对非哺乳动物脊椎动物的研究表明，Prox1早在耳囊泡期就在内耳中表达，并最终局限于感觉上皮和静态听觉神经节(格拉斯哥和托马雷夫，1998年;Stone等人，2003年). 因此，我们对胚胎第11天的小鼠胚胎进行Prox1免疫反应性分析。在所示的切片中，在发育中的耳囊中可以看到Prox1表达的三个不同区域(图1，箭头).图2A显示了E14处使用Prox1探针进行的原位杂交。可以在发育中的胞果（箭头）和半规管的三个嵴（箭头）中看到标记。在E14，我们还发现Prox1在发育中的前庭结构中有强烈的免疫反应。图3 A、B和C分别代表球囊、胞果和嵴的图像。有趣的是，相对于其他结构，胞果中的免疫反应似乎正在减弱。这一观察可能反映了该器官的早期发育(鲁本，1967年).图3D图中显示了E14球囊的另一段，其中可以清楚地看到表达肌球蛋白VIIA和Prox1的毛细胞。Prox1首先在发育中的毛细胞中下调，随后在支持细胞中下调。我们在E16.5之后的胞果中没有看到Prox1标记。还检查了产后小囊和椭圆囊样本中Prox1的表达，但未检测到表达。

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用Prox1抗体（红色）标记E11处的耳囊切片。箭头指向Prox1免疫反应的三个区域。R=吻侧，M=内侧。比例尺=50μm

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用探针对mProx1进行原位杂交。（A） E14处的耳囊切片显示发育中的前庭结构均表达Prox1，箭头指向发育中的椭圆囊和箭头至发育中的半规管嵴。（B） E16耳蜗的一部分，箭头表示Corti的发育器官，箭头表示螺旋神经节。（C，D，E）Corti发育器官染色的高倍图像。在发育的这个阶段，相对于顶点（E），基底（C，D）的标记更强烈。A中的标尺=50μm，也适用于B，D中的标杆=20μm，适用于C-E。

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E14胚胎耳囊切片显示发育中前庭器官中Prox1（红色）和Myosin VIIA（绿色）免疫反应。（A） 通过正在发育的球囊的一部分。（B） 通过发育胞果的部分。（C） 半规管的嵴。（D） 球囊发育过程中的切片显示一些双标记毛细胞（箭头）。比例尺=50μm

听觉上皮Prox1发病

在E14，非增殖细胞区（ZNPC：Chen和Segil，1999年)在耳蜗中由p27定义基普1标签(图4A、C). 早期有丝分裂后细胞的这一区域预示着听觉感觉上皮的位置。在E14，在听觉感觉上皮中未检测到Prox1(图4B、D)但此时在发育中的螺旋神经节中表达。我们通过原位检测Prox1的表达(图2B箭头)和免疫荧光(图4B，箭头)螺旋神经节；然而，这种表达比发育中的感觉上皮细胞弱得多，似乎不是核。螺旋神经节内的标记物在所有年龄段的检查中都是非核的。我们首次在小鼠听觉上皮E14.5处检测到Prox1免疫反应性，该上皮位于Corti发育器官的最基础区域(图5D). Prox1标记是细胞核的，并且跨越上皮的深度。Prox1免疫反应细胞构成ZNPC内细胞的一个子集(图5A-C). 自第27页起基普1表达与感觉前体细胞从细胞周期中退出一致(Chen和Segil，1999年)，我们得出结论，Prox1免疫反应首次在小鼠耳蜗细胞完成最后一轮分裂后不久检测到。

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用p27（A，C）、肌球蛋白VIIA和Prox1（B，D）抗体标记的E14小鼠耳蜗切片。A框中的区域在C中以高倍显示，而B框中的面积在D中以高倍率显示。A和C中的箭头指出了表达p27的非增殖细胞（ZNPC）区域。B中的箭头指向螺旋神经节SG，显示该年龄段Prox1免疫反应。（D） 显示E14处Prox1或肌球蛋白VIIA缺乏标签（箭头）。在面板A和B中，顶点位于图的顶部。比例尺=100μm

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E15（A，B，C）和E14.5小鼠胚胎耳蜗切片，标记有p27（A）、肌球蛋白VIIA和Prox1（B，C，D）抗体。（A） ZNPC可以通过p27标签（箭头）清晰识别。（B） 显示肌球蛋白VIIA和Prox1免疫反应的相邻切片。SG细胞强烈标记为Prox1，而ZNPC内位于耳蜗基底端的细胞子集标记为肌球蛋白VIIA和Prox1。（C） 放大倍率较高时显示B框中区域的双标签。箭头指向肌球蛋白VIIA（绿色）标记的毛细胞，而紧邻它们的是Prox1标记的细胞核（红色）。（D） 耳蜗底部E14.5处的Prox1免疫反应细胞（箭头所示）。在面板A和B中，顶点位于图的顶部。比例尺=A和B的100μm，C和D的25μm。

为了确定在早期胚胎阶段表达Prox1的细胞类型，我们分析了两种毛细胞标记物的表达切片，即肌球蛋白VIIA免疫反应性和GFP转基因，这两种标记物在胚胎早期的控制下表达数学1发起人(Helms等人，2000年;Lumpkin等人，2003年)(数学1-GFP）。我们还使用S100A1标记支持细胞和内毛细胞(Woods等人，2004年). 在E14.5小鼠中(图6)，最早数学1-GFP表达细胞不表达Prox1(图6A). 在早期耳蜗发育的这个阶段，尚不清楚是否所有Math1阳性细胞都会继续分化为毛细胞，或者一些细胞会成为支持细胞。在E15，肌球蛋白VIIA开始在耳蜗的基底区被检测到。表达最高水平肌球蛋白VIIA免疫反应的毛细胞细胞核不表达Prox1（箭头，图7C). 这些数据表明，最早生成的毛细胞不表达Prox1。12小时后，E15.5，更多数学1-GFP阳性细胞存在于发育器官的基底部，Prox1免疫反应细胞现在主要存在于上皮的支持细胞层(图6 B、E). 我们没有发现同时表达Prox1免疫反应性和数学1-GFP转基因于大上皮嵴（GER），即产生内毛细胞的上皮区域(艾格斯顿和沃尔夫，1947年;Lim和Rueda，1992年). 相比之下，我们发现许多Prox1免疫反应核位于数学1-小上皮嵴（LER）中表达GFP的毛细胞，该区域被认为产生外毛细胞(艾格斯顿和沃尔夫，1947年;Lim和Rueda，1992年). 表达最高水平Prox1的外毛细胞通常位于外侧边缘(图6D，箭头). 在早期胚胎切片中，Prox1阳性细胞的数量似乎超过了最终对Corti器官的贡献。这可能是因为耳蜗在细胞停止分裂后生长，而分裂过程被认为包括会聚延伸(Chen和Segil，1999年;McKenzie等人，2004年).

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通过E14.5和E15.5小鼠胚胎耳蜗的切片，在控制下表达GFP数学1发起人。（A） 数学1-GFP标记的内毛细胞出现在E14.5处（绿色），在这个阶段紧邻Prox1免疫反应细胞（红色）。（B） 数学1-E15.5的LER和GER中都存在GFP毛细胞；Prox1免疫反应细胞主要存在于LER的支持细胞层，尽管一些表达Math1的毛细胞也对Prox1具有免疫反应性。（C-E）B中显示的Corti器官放大倍率较高，以更好地显示Prox1（E）和GFP（C）的双标记（箭头）。LER：小上皮嵴，GER：大上皮嵴。比例尺=20μm。

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E16小鼠胚胎耳蜗切片显示p27（A，D）、肌球蛋白VIIA和Prox1（B，C）的标记。C所示的显微照片是B框中区域的高倍视图。B所示的截面与a所示的相邻。（B）螺旋神经节（SG）细胞在此阶段表达Prox1，LER中的许多细胞也是如此。（C） 内毛细胞（绿色，箭头）在此阶段表达肌球蛋白VIIA，但未标记Prox1抗体（红色）。（D） E16小鼠耳蜗的一部分显示，只有p27阳性细胞的一个子集（红色）也标记为Prox1（绿色）。LER：小上皮嵴，GER：大上皮嵴。比例尺=B为100μm，D为20μm。

胚胎晚期

如上所述，Prox1最初在E14.5处的耳蜗基底端表达。随着发育的进行，Prox1的表达在p27中进行基普1域。由E16(图7)，Prox1可在发育中的耳蜗顶部区域检测到(图7B). 在E16，肌球蛋白VIIA在发育中的内毛细胞中明确表达(图7C，箭头)耳蜗底端的一些外毛细胞。表达Prox1的细胞与肌球蛋白VIIA阳性毛细胞相邻，但Prox1不在内部毛细胞中表达。偶尔有毛细胞显示双重标记，但这些仅位于外毛细胞区域(图6 C-E). 这一发现通过双标记细胞核的共焦分析得到了验证（数据未显示）。正如预期的那样，我们发现Prox1免疫反应略微滞后于RNA表达。原位杂交检测到E16耳蜗基底部RNA的稳健表达（见箭头图2B、C)但在Prox1免疫反应刚刚检测到的更多的心尖部转弯处，其表达要弱得多(图2E). Prox1免疫反应位于p27的一个子集基普1阳性细胞(图7D).

在E18，整个耳蜗的支持细胞和毛细胞之间的形态学差异很明显。毛细胞核始终未标记Prox1抗体，而外层毛细胞下面的支持细胞表达高水平的蛋白质(图8). 有趣的是，内部毛细胞下面的支持细胞并不表达Prox1（星号，图8 B-D)区分这两个相邻的支持细胞群。为了直接确定Prox1是否在支持细胞中表达，我们用Prox1和S100A1抗体共同标记E17胚胎的切片。图9显示了此标签的示例。S100A1抗体标记Deiters细胞、内毛细胞和内指骨细胞（红色）。Prox1免疫反应位于Deiters细胞（与S100A1共标记）和柱状细胞（未标记S100A1；图9D，箭头)但不是内毛细胞和内指骨细胞(图9D，箭头). Prox1也不存在于外毛细胞、Hensen细胞和边缘细胞中。

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E18小鼠胚胎耳蜗切片显示肌球蛋白VIIA（绿色）和Prox1（红色）标记。（A） 低倍显微镜显示整个耳蜗。（B-D）A.Prox1中箭头所示区域的高倍视图标记了Deiters细胞和柱细胞的细胞核，但不标记内指骨细胞（星号）。比例尺=100μm

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胚胎第17天小鼠耳蜗顶部切片的共焦显微照片，标记为S100A1（红色）和Prox1（绿色）。（A；B；C）分别为Prox1、合并和S100A1标签。（D） B的高倍视图。箭头指向内毛细胞的S100A1标记，而箭头指向柱状细胞核，Prox1为阳性，S100A1为阴性。H： Hensen细胞，DC：Deiters细胞，PC：柱状细胞，IHC：内毛细胞，OHC：外毛细胞，IPC：内指骨细胞，B：边缘细胞。比例尺=10μm

产后发育

出生后，Prox1继续在Deiters’和柱状细胞核中表达。此时，不同的支持细胞很容易根据它们相对于内外毛细胞和基底膜的位置进行区分(图10). 在出生后第0天用肌球蛋白VIIA和Prox1抗体进行共标记（P0）表明，在此阶段表达这些标记的细胞之间没有重叠。两个柱状细胞和三个Deiters细胞表达Prox1，而内指骨细胞、边界细胞和Hensen细胞不表达。因此，Prox1免疫反应清楚地区分了Corti器官中不同类别的支持细胞。螺旋神经节的免疫染色在这个年龄仍然可见(图10A). 软骨和上皮管腔表面的染色被认为是背景，因为许多抗体也有相同的模式。

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出生后第0天小鼠耳蜗切片显示肌球蛋白VIIA（绿色）和Prox1（红色）标记。（A） 低倍显微镜显示整个耳蜗。（B，C）A中方框所示区域的高倍视图。Prox1标记的是Deiters细胞和柱细胞的细胞核，而不是毛细胞。SG=螺旋神经节。比例尺=100μm

Prox1在出生到P20之间的支持细胞核中表达下调。在P3的瑞士韦伯斯特小鼠中，与外柱细胞和第三排Deiters细胞相比，Corti器官的基底区内柱细胞和第一排和第二排Deiter细胞中的Prox1核标记减少(图11A). 在发育程度低于基底端的中间区域，Prox1标记仅在内柱细胞核中减少(图11B). 在顶端区域，最不成熟的区域，所有行的支持细胞核都有明显的标记(图11C). 在P5，Corti器官的基底区显示出与P3相似的标记(图11D)；然而，在中间和顶端区域，Prox1免疫反应在支持细胞亚群中明显降低，尤其是在第一排和第二排Deiters细胞和外柱细胞中(图11E). 中间区域和顶端区域之间的一个有趣的区别是，在顶端，更多的内柱细胞核比中间区域保留强烈的Prox1标记(图11F).

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来自P3（A-C）、P5（D-F）和P10（G-H）耳蜗基底（A、D、G）、中间（B、E、H）和顶端（C、F、I）区域的Corti片完整安装器官的共焦图像。所有面板在上皮的支持细胞核层显示Prox1免疫标记。Z系列堆栈中的大约10个1μm切片被投影到最明亮的点，以捕捉每张图像中的支持细胞核。IPC（内柱细胞）、OPC（外柱细胞），DC-1、DC-2和DC-3（第一到第三排Deiters细胞）。E中的箭头指向第一排和第二排Deiters细胞以及外柱细胞中缺乏Prox1免疫反应的区域。F中的箭头指向IPC核标签。比例尺=15μm。

到P10，大约听力开始(埃利特，1976年;克劳斯和奥尔巴赫-克劳斯，1981年)，基底区未检测到Prox1表达(图11G)，并且在中部和顶部区域高度衰减，仅在外柱细胞和第三排Deiters细胞核中检测到(图11H，I). 在P20时Corti器官的任何区域或成年小鼠中都无法检测到信号（数据未显示）。我们发现，在出生后早期发育阶段（P0-P5），瑞士韦伯斯特和CBA小鼠品系中Prox1的表达模式相似。然而，尽管在瑞士韦氏小鼠中，Prox1标记被P20从Corti器官中丢失，但在8周时仍保留在CBA小鼠的中部和顶部区域、外柱细胞和第三排外Deiters细胞中（数据未显示）。

讨论

脊椎动物和无脊椎动物中保存着许多重要的神经发育调节因子(Chitnis，1999年). 在内耳中，几个关键转录因子和信号分子首先在果蝇属神经发生在毛细胞发育中起着关键作用(伯明翰等人，1999年;Kageyama和Ohtsuka，1999年;Zheng等人，2000年;Zine等人，2001年;布莱恩特等人，2002年). 这个探头1基因果蝇Prospero发散同源域转录因子，在脊椎动物发育中的内耳中表达，但其在小鼠耳蜗中的详细表达尚不清楚。在本报告中，我们描述了Prox1在发育中的小鼠内耳中的表达。

Prox1在E11处的耳囊中表达，我们推测这是正在发育的前庭结构。自E12起，发育中前庭系统感觉上皮中的大多数细胞尚未退出细胞周期(鲁本，1967年)Prox1很可能在分裂细胞中表达。我们发现Prox1在前庭结构中的表达持续到E16.5。此后，Prox1在前庭系统中不再表达。在前庭系统中，Prox1在毛细胞和支持细胞的前体中表达，但在毛细胞开始表达肌球蛋白VIIA后，它在毛细胞中下调。这种下调并不像我们在耳蜗中看到的那样迅速，因此在前庭结构中很容易看到Prox1和肌球蛋白VIIA双重标记的细胞。值得注意的是，当大多数细胞仍在循环时，Prox1在前庭结构的早期发育中处于激活状态，而在听觉上皮细胞中，我们仅在细胞已经退出细胞周期后检测到Prox1。

我们已经进行了几项观察，表明Prox1基因与小鼠Corti器官的发育有关。我们发现Prox1在胚胎第14.5天首先在Corti的发育器官中表达。Prox1最初在LER中表达，LER是产生Deiters’、柱子和外毛细胞的前感觉区；然而，随着外毛细胞分化，它们会迅速下调Prox1的表达。在这个表达的初始阶段之后，Prox1继续在两种类型的支持细胞中表达，即Deiters细胞和支柱细胞。随着支持细胞的进一步分化，Prox1在这些细胞的细胞核中的免疫标记下调，例如通过P20，Corti器官的细胞核中没有保留Prox1。Prox1在这些细胞中的表达缺失与Corti隧道的开放同时发生，这种情况发生在出生后第7天到第10天的小鼠身上，从底部到顶点进展。我们还发现，Prox1在感觉神经节中表达，至少从胚胎第14天到产后第二周，并可能持续到成年。

Prox1在发育中的小鼠内耳中的表达与鸡和鱼的内耳中表达的比较突出了脊椎动物发育过程中的一些有趣的相似之处。在雏鸡胚胎中，Prox1在稳态声神经节中表达(Stone等人，2003年)，就像老鼠一样。在小鸡中，Prox1在发育中的听觉感觉上皮中的表达早于在小鼠中的表达，因为用Prox1抗体和有丝分裂标记物共同标记胚胎小鸡感觉上皮揭示了仍具有有丝分裂活性的前体细胞中的Prox1免疫反应性(Stone等人，2003年;Stone等人，2004年). 相比之下，在小鼠Corti器官中，Prox1在p27后至少一天表达基普1在ZNPC细胞有丝分裂末期上调(Chen和Segil，1999年). 在小鼠前庭系统中，Prox1在感觉斑中的细胞周期退出之前早期表达。在小鸡和小鼠的毛细胞分化过程中，Prox1在毛细胞中表达下调，并且仍在支持细胞的一个亚类中表达。而在小鼠中，Prox1在Deiters细胞和支柱细胞中表达，而在小鸡中，在孵化后的第一天，Prox1仅在神经边缘的支持细胞中表达。

Prox1表达的另一个有趣特征是，它是Deiters和柱细胞分化的早期标记。已知其他几种支持细胞特异性蛋白在胚胎发育期间在小鼠内耳中表达。S100A1、p75（NGFR）和Fgfr3均在Corti发育器官的各种支持细胞中表达。S100A1几乎在E14.5的ZNPC的所有细胞中表达（数据未显示）；在发育的后期，S100A1仅限于指骨细胞和Deiters细胞，尽管内部毛细胞也被S100A1抗体标记(Woods等人，2004年;Sage等人，2005年). 神经营养素共受体p75（NGFR）由E15的发育柱和Deiters细胞表达(Mueller等人，2002年)并在胚胎后期局限于柱细胞(Pirvola等人，1994年;Schecterson和Bothwell，1994年;Knipper等人，1996年;Knipper等人，1999年). Fgfr3也在发育中的柱细胞和Deiters细胞中表达(Pirvola，1998年;Pickles，2001年;Mueller等人，2002年)对支柱细胞的发展至关重要(Colvin等人，1996年). 最早的支柱细胞标记似乎是Sprouty 1，它在Corti发育器官E14.5的两个细胞宽区域表达，并通过P5在支柱细胞中继续表达(Shim等人，2005年). Sprouty 2是该家族的另一个成员，在E14.5时在发育中的上皮细胞的更广泛区域中表达，但在E16.5时在柱细胞、Deiters细胞和Claudius细胞中的表达受到限制(Shim等人，2005年). 在Corti器官发育期间，Notch信号通路的成分也在支持细胞中表达。具体来说，Notch1和Hes5在E15处Corti器官的大多数（如果不是全部）细胞中表达，但到E18时，Hes5和Notch1的表达都局限于柱细胞和Deiters细胞(Lanford等人，1999年;Zine等人，2000年;Zine等人，2001年). 这种表达模式与我们观察到的Prox1表达最为相似，表明这些途径之间可能存在联系。

Prox1在内耳发育中的作用是什么？

前置器1/普洛斯佩罗可以作为转录激活物(Lengler等人，2001年;Cui等人，2004年)或者作为镇静剂(Kauffmann等人，1996年;库克等人，2003年). Prox1的功能在镜头开发中最容易理解。Prox1在早期晶状体基板中表达，在伸长的晶状体纤维细胞中上调(Tomarev等人，1996年;Duncan等人，2002年). 在Prox1缺陷小鼠中，晶状体纤维细胞不会伸长，部分原因是晶体蛋白表达减少(Wigle等人，1999年). Prox1激活几种不同的晶体蛋白启动子，并与另一种晶状体转录因子Maf协同作用，激活ß1和\223»2晶体蛋白的转录(Lengler等人，2001年;Duncan等人，2002年;Cui等人，2004年). 在果蝇属眼睛，普洛斯佩罗在R7光感受器和假定的非神经元透镜样锥细胞中表达(库克等人，2003年). 在感光器中，普罗斯佩罗通过抑制R8特异性视紫红质调节R7与R8命运的功能(库克等人，2003年). 虽然普洛斯佩罗在锥细胞中尚不清楚，最近的证据表明晶体蛋白的启动子是由果蝇属给老鼠吃(Blanco等人，2005年)，可能就是这样普洛斯佩罗Prox1在晶状体特异性基因的调控中具有保守功能。

晶状体上皮细胞分化为晶状体纤维细胞的标志是细胞形状的急剧变化。内耳中表达Prox1的支持细胞是支柱细胞和Deiters细胞。这两种细胞类型在分化过程中都经历了显著的细胞形状变化(Spicer和Schulte，1993年;Ito等人，1995年). 这对于科尔蒂隧道沿线的支柱单元尤为明显，为该结构提供了刚性支撑。这些细胞的细胞核在分化过程中彼此分开，形成隧道三角形结构的底部。Prox1的一个可能功能可能是调节柱细胞的延伸形态，就像调节晶状体纤维的伸长一样。

或者，Prox1在头发/支持细胞谱系中的表达可能反映其在神经系统其他区域的功能。在脊椎动物中枢神经系统中，Prox1也被证明参与了几个发育阶段。在视网膜中，Prox1是一类特殊中间神经元（水平细胞）发育所必需的(Dyer等人，2003年). 在腹侧前脑中，Prox1和Mash1在不再表达神经干细胞标记物后，在祖细胞亚类中瞬时表达(Torii等人，1999年). 因此，Prox1在内耳中的功能可能与干/祖细胞的分化状态有关。鸡基底乳头支持细胞亚群中Prox1表达的保留表明，与哺乳动物的上皮不同，该上皮保留了一些未成熟的前体/祖细胞样细胞。这表明一些支持细胞处于早期分化状态，这可能反映了多能性，包括通过细胞分裂产生毛细胞和支持细胞的能力(Corwin和Cotanche，1988年;Ryals和Rubel，1988年)通过直接转分化产生新的毛细胞(Roberson等人，1996年,2004). 小鸡毛细胞再生过程中Prox1表达的动态与这种可能性一致(Stone等人，2004年).

Prox1在内耳和耳蜗中表达的比较普洛斯佩罗在发育中的苍蝇外部感觉器官谱系中，也暗示了感觉细胞发育中的一些共同功能(图12). 苍蝇的外部感觉器官是由感觉器官前体（SOP）的两次连续细胞分裂产生的。SOP的第一部分生成II-a单元和II-b单元(Freeman和Doe，2001年). 这些细胞再次分裂，从II-a产生窝状细胞和鬃毛细胞，从II-b产生鞘状细胞和神经元细胞。普洛斯佩罗最初在SOP中表达，然后分离到II-b细胞，在II-b产生的神经元中瞬时表达，并在胶质/鞘细胞中持续存在(Freeman和Doe，2001年). 我们的研究提出了Prox1在Corti器官中的类似表达模式。Prox1在LER中的外毛细胞及其相关支持细胞的前体中表达，但在GER中的内毛细胞或指骨细胞前体中似乎不表达。一旦毛细胞和支持细胞彼此明确分化，Prox1在Deiters和支柱细胞中继续表达。虽然SOP和内耳之间的表达模式显示出有趣的相似性，但这两个系统之间的一个明显区别是Prox1的表达与Corti器官中的细胞分裂没有直接联系普洛斯佩罗在SOP中。

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显示果蝇prospero（灰色）表达与外部感觉器官细胞发育之间关系的图表（顶部），Prox1（灰色）和发育中的耳蜗细胞（底部）。SOP=感觉器官前体；SEP=内耳假想的感觉上皮前体；GER=大上皮嵴；LER=较小的上皮嵴。

普洛斯佩罗在胚胎和成年SOP谱系中都需要，以产生产生神经元/胶质细胞的II-b细胞。普洛斯佩罗突变体失去了产生神经元/胶质细胞谱系的能力，反而产生了鬃毛和窝状细胞。有时神经元由普洛斯佩罗-SOP缺乏，但从未观察到胶质鞘细胞。同样，实验性过度表达普洛斯佩罗在SOP谱系中导致神经胶质鞘细胞的过度产生(曼宁和多伊，1999年). 因此，普洛斯佩罗在感觉器官发育的几个连续阶段似乎很重要，但可能与本研究最相关的是II-b谱系非神经元细胞的关键需求。通过类推果蝇属我们可以预测，内耳Prox1的缺失将导致Deiters和柱状细胞无法与LER分化，并可能导致来自GER、内毛细胞和指骨细胞的细胞过度生产。未来的工作将需要确定Prox1是否起到类似的作用。

补充材料

补充图1

图S1。该图说明了Prox1抗血清的特异性。图A显示E14晶状体中的Prox1染色。B组显示E18处Corti器官中的Prox1染色（红色），C组显示Prox1着色通过与抗血清所针对的肽（50μg/ml）孵育而完全消除。肌球蛋白VIIA抗体（绿色）染色不受肽添加的影响。

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鸣谢

作者感谢Edwin Rubel博士和Virginia Merrill Bloedel听力研究中心的支持。我们要感谢Dale Cunningham在组织学方面的帮助，感谢Stephanie Smith、Jialin Shang在技术方面的帮助以及Glen MacDonald在显微镜和成像方面的帮助。我们感谢以下人士慷慨提供试剂，Stanislav Tomerev博士提供Prox1 cDNA克隆和原始Prox1抗血清，Stefan Heller博士提供肌球蛋白VIIA抗血清，Jane Johnson博士提供数学1-GFP小鼠。我们感谢Thomas Reh博士批判性地阅读了手稿，并在此工作过程中进行了无休止的讨论。

由NIH DC005953（OBMcD）、DC003944（ECO）、DC00696（JSS）、DC006437（CH）、NIDCD P30 DC004661、NICHHD P30 HD002274、NASA:NAG-2-1415（JSS。

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