一种新的指环蛋白复合物对后期干预至关重要蛋白质向酵母液泡的运输

质粒构建

如前所述，执行标准的重组DNA技术描述(亚蒂斯等。1982年)通过使用来自Boehringer Mannheim生化公司（印第安纳波利斯）或新英格兰Bioloabs（马萨诸塞州贝弗利）。携带整合质粒pSRY18T-406这个第18版^总悬浮液-1（C）₈₂₆S） 等位基因通过插入千磅I–Pvu公司二pJSR9片段到千磅我和Sma公司I站点第RS406页(西科尔斯基和希特，1989年). 质粒pVAM3.426(2μVAM3型)通过将英国标准时间商业智能–Nsi公司p351R1的I片段(瓦达et（等）阿尔。, 1997)并入pRS426(西科尔斯基和希特，1989年). 质粒pJR18-5（2μ视频处理18)通过将千磅I–囊我将pJSR6片段化为pPHY16。质粒pSEY8-VPS11（2μ虚拟专用交换机11)由建造将Bgl公司II–欣dIII片段包括这个虚拟专用交换机11基因导入pSEY8。框架内基因融合这个大肠杆菌trpE和视频处理18基因被构建通过将Xba公司I–生态RV碎片视频处理18变成钝的Xba公司I–欣dIII型pATH2的位点(Dieckmann和Tzagoloff，1985年)，生成pKK18-FUS。框架内trpE-VPS11型基因融合是通过融合产生的这个生态RI–Xba公司I片段虚拟专用交换机11到这个邻氨基苯甲酸合成酶pATH3中的基因(Dieckmann和Tzagoloff，1985年),生成pTrpE-VPS11。质粒pVPS16-36（2μ第16页),pLB33-162（2μ视频处理33)，pJSR6型(欧洲标准化委员会VPS18),第LB33–21页(欧洲标准化委员会VPS33)，pJSR9[欧洲标准化委员会第18版^总悬浮液-1（C）₈₂₆S） ]已经前面描述过(班塔牌手表等。, 1990;罗宾逊et（等）阿尔。, 1991;Horazdovsky和Emr，1993年). 质粒pDB192(2μSTE6标准)是David Bedwell慷慨的礼物（阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学）。

酵母和细菌方法

标准酵母和大肠杆菌遗传技术如前所述执行(米勒，1972年;谢尔曼et（等）阿尔。, 1979). 用锂进行酵母转化醋酸盐法(伊藤等。, 1983)使用单链DNA作为承运人(Schiestl和Gietz，1989年).大肠杆菌根据以下方法进行转换哈纳汉（1983）.染色体第18版^总悬浮液-1（C）₈₂₆S） 使用“pop-in/pop-out”等位基因替换技术罗斯斯坦（1991）质粒pSRY18T-406[第18页^总悬浮液-1（C）₈₂₆S） ，URA3公司]用线性化余额我和变形金刚进入SEY6210细胞。乌拉⁺改造者，窝藏URA3公司基因两侧有视频处理18和第18版^tsf公司-1基因如果构建正确集成在视频处理18轨迹，被划到用5-氟代甲酸（PCR，盖恩斯维尔，佛罗里达州）进行选择质粒切除。对产生的菌落进行测试第18版^总悬浮液表型鉴定菌株第18版^总悬浮液-1（C）₈₂₆S） 等位基因。收件人破坏政治公众人物4SRY18T-1中的基因，质粒第1页：：LEU2(安默勒等。, 1986)被消化了巴姆HI并转化为SRY18T-1。对政治公众人物4在Leu被确认⁺由蛋白酶A（PrA）蛋白及其活性的损失，产生菌株SRY18T-4(第18版^总悬浮液-1人4Δ). 这个应变SRY18T-4(第18版^总悬浮液-1; 材料一)由SRY18T-1生成(第18版^总悬浮液-1,材料α） 与总公司由描述的基因赫斯科维茨和延森（1991）.

荧光和电子显微镜

细胞标记和免疫沉淀

如前所述标记酵母细胞(Rieder公司等。, 1996). 细胞生长到中对数期补充氨基酸的SD培养基。整个细胞被标记为Expres公司³⁵S（新英格兰核电站，马萨诸塞州波士顿），第2-5页外径₆₀₀U/ml，在含有氨基酸的SD培养基中，100μg/mlα₂-巨球蛋白和500μg/ml牛血清白蛋白稳定分泌的蛋白质。追捕是通过添加蛋氨酸、半胱氨酸、酵母提取物和葡萄糖（最终浓度分别为5 mM、1 mM、0.2%和4%）。球形体由发酵酶-100T（Seikagaku Kogyo，东京）如前所述拆除细胞壁(Rieder公司et（等）阿尔。, 1996). 球形体³⁵S标记如上，除了标记介质和蔡斯溶液包括山梨醇（1M、 最终浓度）。脉冲追踪反应被添加能量毒剂叠氮化钠和氟化钠，每种毒剂最后浓度为20 mM。

将三氯乙酸（TCA）添加到最终浓度为8-10%，并进行免疫沉淀如前所述(切雷吉诺等。1995年)，除尿素裂解缓冲液（50 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH 7.2，6 M尿素，1%十二烷基硫酸钠）用于再悬浮在玻璃珠溶解和蛋白质溶解之前干燥TCA颗粒。进行顺序免疫沉淀的样品被解离在50分钟内将第一抗体加热至70°C 10至15分钟μl尿素裂解缓冲液，在1ml吐温-20缓冲液中稀释，以及经受第二次免疫沉淀。SDS-PAGE、CPS前用内糖苷酶H处理免疫沉淀物(Cowles公司et（等）阿尔。, 1997)破坏不同糖基化形式的CPS分为单个pro-CPS和m-CPS带(施波尔曼等。,1991).

针对Vps18p和Vps11p的多克隆抗血清TrpE-Vps18和TrpE-Vps11融合蛋白XL1-蓝色大肠杆菌含有pKK18-FUS或pTrpE-Vps11的细胞，分别是。纯化融合蛋白并用于免疫新西兰白兔（如上所述）(Horazdovsky和Emr，1993). 抗CPY、ALP、Vps33p、Vps16p、Vps 10p、，Pep12p和CPS之前已经描述过(罗宾逊et（等）阿尔。, 1988;Klinsky和Emr，1989年;班塔等。, 1990;Horazdovsky和Emr，1993年;马库松等。, 1994;贝切勒等。, 1996;Cowles公司等。, 1997). 抗血清认可Kex2p、Ste6p和API是Robert的慷慨礼物Fuller（密歇根大学，密歇根州安娜堡），David Bedwell（阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学）和丹·克林斯基（大学加利福尼亚州戴维斯。

微分离心实验

³⁵如前所述制备S-标记的球形体并重新悬浮在冰镇裂解缓冲液中[200 mM山梨醇，50 mM醋酸钾，1 mM EDTA，20 mMN个-（2-羟乙基）哌嗪-N个′-（2-乙磺酸酸性），用含有蛋白酶抑制剂（20）的KOH]调节pH至6.8μg/ml苯甲基磺酰氟，5μg/ml抗血小板，1μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮蛋白胨、1μg/ml pepstatin、10μg/mlα₂-巨球蛋白），缓冲液T除外[三羟甲基氨基甲烷，pH 6.8和1 mM EDTA]用于图​图2A：。2A.细胞悬液在Dounce均质器中均质～在冰镇玻璃组织匀浆器中进行10次粗裂解物在300×克持续5分钟至去除未溶解的球形体。用于差速离心实验中，以13000×克持续15分钟以生成P13颗粒；剩下的上清液部分（S13）以100000×克持续45分钟以生成P100颗粒和S100上清液部分。研究蛋白质与颗粒细胞组分，清除的裂解物被调整为6 M尿素、1 M氯化钠、1%Triton X-100和0.1 M纳₂一氧化碳_三pH值为11。在冰上放置15分钟后，样品以100000×克持续45分钟添加TCA和进行免疫沉淀处理。

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图2

第18页^tsf公司细胞聚集38°C下不同流行区的ALP和CPS前体。（A） 由第18版^总悬浮液用Expres标记（SRY18T-1）细胞20分钟³⁵S和在26°C或38°C下追逐40分钟，然后在低张状态下进行溶血缓冲区。300×离心后克，的裂解物依次离心产生13000×克颗粒（P13），100000×克颗粒（P100）和100000×克上清液（S100）分数。ALP和CPS水解酶从每一种中免疫沉淀分数，通过SDS-PAGE进行解析，并通过荧光成像进行可视化。（B）第18版^总悬浮液（SRY18T-1）球状体³⁵S标记20分钟，追逐40分钟38°C，然后在低渗缓冲液中进行溶解。离心后300 ×克，裂解物被装载在Accudenz梯度。离心至平衡后，梯度收集组分，并将标记的CPS分布前体物通过免疫沉淀和SDS-PAGE测定。收件人定位液泡膜，未标记成熟的分布通过Western blotting和ECL分析测定空泡ALP。

密度梯度分析

对于Accudenz密度梯度，Accudenz（Accurate Chemical and已制备纽约州韦斯特伯里科学公司的溶液（以百分比表示，wt/vol）在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。阶跃梯度包括1.25毫升37%的Accudenz，1.5毫升30%、27%、23%和20%的步长Accudenz和17%、13%和9%的1ml步长。15至25岁外径₆₀₀第U个，共U个³⁵S标记的球形体被裂解如上所述，通过在300 ×克持续5分钟。将产生的裂解物加载到然后在Beckman SW41转子中离心170000×克在4°C下持续16至18小时。分数从顶部收集，并用TCA公司。The distribution of³⁵分析S标记蛋白免疫沉淀法、SDS-PAGE和荧光法。未标记的ALP是通过Western blot和ECL分析检测，如下所述巴斯特等。(1997)使用ALP特异性单克隆抗体（分子探针）。浮选试验如上所述完成，除了样品与Accudenz溶液（40%）混合最终浓度），并在密度梯度的底部加载。使用分子动力学定量蛋白质回收PhosphorImager（加利福尼亚州森尼维尔）或密度测定法（NIH Image软件）。

第18版^总悬浮液细胞不同程度地积累ALP和CPS前房隔室

p2CPY的细胞内滞留表明空泡前体在运输中间体中积累第18版^总悬浮液电池温度为38°C。检查亚细胞新合成的液泡水解酶在细胞内的分布第18版^总悬浮液在26°C或38°C，并进行差速离心。球形体³⁵S标记15分钟，追赶45分钟，然后裂解。之后以300×克要删除未破碎的细胞，将裂解液依次离心产生13,000 ×克颗粒（P13），100000×克颗粒（P100）和100000×克上清液（S100）分数。当野生型细胞裂解物在这些条件下分馏时条件（如图​图8），8)，P13主要包含大膜结构，如液泡膜、质膜、内质网、线粒体和细胞核，但P100组分含有高尔基体膜和运输囊泡(马库松等。,1994). 含有合成蛋白同源物Pep12p的内膜分布在P13和P100颗粒之间(贝切勒et（等）阿尔。, 1996). 细胞质中或细胞内的可溶性蛋白质在S100中发现渗透敏感细胞器的管腔分数。

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图8

C类Vps的亚细胞定位蛋白质。（A） 野生型球形体（SEY6210）被标记为Expres公司³⁵S持续30分钟，追逐60分钟，然后裂解低渗缓冲液。300×离心后克，对裂解产物进行顺序离心生成13000×克颗粒（第13页），100000×克颗粒（P100）和100000×克上清液（S100）部分。Vps18p、Vps11p、Vps 16p、，通过定量测定每个组分中的Vps33p免疫沉淀、SDS-PAGE和荧光图谱。（B） 分布这些组分中的几个细胞器标记蛋白也免疫沉淀法测定：mALP（液泡）、Pep12p（内胚体隔间）、Kex2p（晚期高尔基体）和葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PDH，细胞质）。（C） 细胞Accudenz梯度分馏裂解物。将野生型球形体（SEY6210）标记30分钟Expres公司³⁵S并在低张溶栓前追赶60分钟缓冲区。在300×克并且然后加载到Accudenz坡度的顶部。离心至收集平衡、梯度分数和Vps18p、Vps11p、ALP、，和Pep12p通过免疫沉淀回收，并通过SDS-PAGE电泳。

新合成的ALP和CPS在馏分中的分布生成自第18版^总悬浮液细胞裂解物通过免疫沉淀和SDS-PAGE（图​（图2A）。2A） ●●●●。在第18版^总悬浮液细胞在26°C时，ALP在P13部分，与液泡的正确定位一致。在S100组分中发现了成熟形式的CPS，表明完整膜CPS前体已加工成可溶性成熟型在溶酶体敏感液泡内。在第18版^总悬浮液细胞在38°C时，ALP在其P100组分中的前体形式，表明它是在非电针室中积聚。相反，CPS前体主要在P13级分中发现。

确认CPS前体第18版^总悬浮液细胞在38°C时，在一个流行的隔间中积聚其处理不足，平衡密度梯度分析第18版^总悬浮液进行细胞裂解（图​（图2B）。2B） ●●●●。安³⁵标有S的第18版^总悬浮液细胞裂解物，如上所述，在38°C下制备，在300×克并加载在Accudenz密度梯度的顶部。离心至平衡后收集馏分新合成的CPS的分布由以下公式确定免疫沉淀和SDS-PAGE分析。这个³⁵标有S的CPS以其前体形式存在于梯度。相反，Western blot分析显示液泡膜，定义为未标记的成熟ALP在38°C孵育前交付至液泡，局限于梯度的轻分数。成熟的类似分布在野生型细胞中观察到空泡型ALP（见图​图8C），8C） ，表明液泡的分馏特征第18版^总悬浮液细胞在38°C期间没有变化孵化。因此，这些亚细胞分离实验表明那个第18版^总悬浮液细胞积聚ALP和CPS不同流行区的前体。

第18页^tsf公司细胞在内吞途径中表现出缺陷

某些细胞表面受体、配体和其他血浆将要降解的膜组件交付给通过内吞途径产生液泡，与生物合成途径汇合流行性内胚乳样室途径(Singer和Riezman，1990;维达等。, 1993). 检查直接后果内吞途径中Vps18p功能的丧失，第18版^tsf公司细胞进行了以下能力测试在38°C时将内吞标记物内化并传递到液泡。

通过以下方法检查细胞膜内吞和液泡形态用亲脂性苯乙烯染料FM4-64对细胞进行染色。这个至关重要荧光染料最初会污染质膜，然后在一段时间内内化并传递到液泡膜，能量和温度依赖方式(Vida和Emr，1995年).野生型和第18版^总悬浮液细胞预先孵育，用FM4–64染色，并在26°C或38°C的YPD中追逐（图​（图3A）。三A） ●●●●。在野生型细胞和第18版^总悬浮液细胞在26°C、FM4-64下快速生长输送到形状不规则且明亮的液泡中荧光隔间。相反，第18版^总悬浮液38°C下染色的细胞表现出明显的点状染色整个细胞质和减少的液泡染色。这个FM4–64从质膜的清除率在第18页^tsf公司电池温度为38°C。小污渍观察到的隔间第18版^总悬浮液38°C时的电池可能代表内吞中间产物，类似点状染色在野生型细胞中短暂观察到该模式用FM4–64标记(Vida和Emr，1995年). 此外，点状染色第18版^总悬浮液当将细胞恢复到26°C。荧光灯似乎不太可能点状结构代表破碎的空泡隔室，因为1） 液泡在第18版^总悬浮液细胞在38°C下持续数小时（图​（图3，三，参见图​图44和​和5），5)，没有观察到液泡分离缺陷；和2）当液泡在里面第18版^总悬浮液细胞用FM4–64染色在38°C孵育前26°C，点状细胞质染色未观察到。这些结果与膜从内吞中间产物流向液泡第18页^tsf公司电池温度为38°C。

通过脉冲追踪实验进一步分析细胞内交通监测Ste6p向液泡的输送。Ste6p，ABC运输车分泌一-因子交配信息素通过内吞作用从质膜内化并输送至用于降解的液泡(伯克维尔等。, 1994;科林和Hollenberg，1994年). 为了研究Ste6p的降解动力学，第18版^总悬浮液和携带pDB192的野生型细胞(2μSTE6标准)在26°C下生长，并在38°C下培养5年min之前³⁵S标记15分钟38°C下追踪时间，免疫沉淀Ste6p，并通过SDS-PAGE（图​（图3B）。三B） ●●●●。Ste6p的半衰期增加了三到五倍于第18版^总悬浮液野生型上的突变体控件。在26°C时，Ste6p的稳定性与第18版^总悬浮液和野生型细胞。早期研究表明提示Ste6p可能有多种降解途径(Kolling和Hollenberg，1994年)，这可以解释为什么Ste6p不是完全稳定第18版^总悬浮液电池温度为38°C。因为C类虚拟专用交换机空突变体在内吞作用的初始内化步骤(Dulic和Riezman，1989,1990)，这些结果表明第18版^总悬浮液细胞在细胞内转运过程中积累Ste6p和FM4-64而不是有效地将它们输送到液泡中。

第18版^总悬浮液电池在交付过程中出现缺陷液泡的自噬体

细胞溶质组分向酵母液泡的整体运输在营养缺乏条件下，自噬增强。期间自噬，细胞质成分被隔离在双层膜中与液泡膜融合的自噬体，导致单膜自噬体进入空泡腔(武繁等。, 1992;爸爸等。, 1994). 在野生型细胞的液泡，自噬体迅速形成退化；然而，缺乏活性液泡蛋白酶的细胞显示自噬体在空泡内广泛堆积(武繁等。, 1992;爸爸等。, 1994).

检查是否需要Vps18p功能来交付蛋白酶缺乏菌株液泡的自噬体VPS18第4页Δ（TVY1）和第18版^总悬浮液第四人民党Δ（SRY18-9）在缺氮培养基中培养（SD-N）诱导自噬。在26℃下孵育2.5h后，第18页^总悬浮液第四人民党Δ细胞有许多空泡内的自噬体（图​（图4A），4A） 表明细胞质自噬体与液泡正确对接和融合。类似地，自噬体也聚集在视频处理18第四人民党Δ电池温度为26°C或38°C。相反，第18版^tsf公司第四人民党38°C时的Δ电池细胞质内累积的自噬小室；此外，空泡中没有自噬体（图​（图4B）。4B） ●●●●。大多数细胞质室被膜包围碎片和电子半透明环，如中的箭头所示图​图4B，4B、 表明自噬体膜尤其对样品制备过程中的干扰敏感。

与电子显微镜观察到的自噬缺陷一致，脉冲追踪分析显示第18版^总悬浮液细胞液泡蛋白API的成熟存在严重缺陷38°C时。与大多数新合成的液泡水解酶不同，API似乎通过以下途径从细胞质运输到液泡腔自噬过程（哈丁等。, 1996;斯科特et（等）阿尔。, 1996;施伦贝格等。, 1997). 因此，这些结果表明，对接和/或自噬中间产物与液泡的融合。

第18版^tsf公司细胞积聚小泡和非许可区放大的膜室簇温度

C类虚拟专用交换机空突变体在形态上缺乏可识别的液泡，相反积聚小水泡和异常膜结构簇（图​（图5H；5H；班塔等。, 1988;伍尔福德等。, 1990;普雷斯顿等。, 1991). 收件人研究直接由Vps18p失活，第18版^总悬浮液细胞生长于26°C，在26°C或38°C下培养2.5小时，由电子显微镜（图​（图5）。5). 26°C时，第18版^总悬浮液细胞与野生型细胞基本上无法区分（图​（图5A）。5A） ●●●●。相反，在38°C下培养2.5小时后在液泡附近观察到膜室的积聚第18版^总悬浮液单元格（图​（图5，5，B–G）。许多堆积的结构由多泡体组成使人联想到内体室(海伦尼乌斯等。,1983;希克等。, 1997). 此外，形状不规则具有电子半透明含量和观察到类似于自噬体的双膜室。在野生型细胞或在第18页^总悬浮液26°C下的突变细胞。此外，第18版^总悬浮液细胞在38°C时累积40至50nm膜泡，其水平约为在野生型细胞中观察到。电子密度的空泡仍然存在在中完好无损第18版^tsf公司尽管它们通常比野生型略大且更球形液泡。小泡和其他膜包裹的积聚内部隔间第18版^总悬浮液38°C时的电池建议对接可能需要Vps18p功能和/或多种运输中间产物的融合。

C类之间的遗传相互作用VPS公司基因和液泡蛋白转运所需的其他后作用基因

四种C类的常见表型虚拟专用交换机空突变体表明C类VPS公司基因产物可能共同调节蛋白质转运到液泡。探索C类之间潜在的遗传相互作用VPS公司基因，抑制研究在第18版^总悬浮液应变和a虚拟专用数据库33突变株其表达部分功能性Vps33p(第33页至第4页;班塔等。, 1990). 这个第18版^总悬浮液和vps33–4版用2μ-based转化突变株含有C类的质粒VPS公司基因和CPY进行了脉冲追踪分析（总结见表​表2）。2). A～15倍Vps16p的过度生产抑制了严重的CPY加工缺陷在中观察到第18页^总悬浮液36°C下的电池（图​（图6A）。6A） ●●●●。第18版^总悬浮液细胞窝藏一个空的载体只成熟了新载体的一小部分合成CPY（<5%；图​图6A，6A、 车道2）；相反，第18版^总悬浮液包含多副本的单元格视频处理16质粒成熟率超过70%合成的CPY，与向液泡的正确运输一致（图​（图6A，6A、 车道3）。Vps16p的过度生产也抑制了CPY观察到的加工缺陷vps33–4版30°C时的电池（图​（图6B，6B、 车道2和4）。相比之下第18页Δ和虚拟专用数据库33Δ细胞未被抑制通过Vps16p的过度生产（表​（表2），2)，表示超过Vps16p不能绕过对Vps18或Vps33蛋白质的要求。这些C类显示的结果和常见表型集虚拟专用交换机零突变体表明Vps18p、Vps16p和Vps33p在功能上相互作用以促进空泡蛋白的运输。

观察到的多个运输缺陷第18版^总悬浮液38°C下的电池（图​（图1、，1,​,2,2,​,3,三,​,4,4,​,5)5)表明Vps18p功能较晚参与蛋白质向液泡的转运。因此潜在的遗传相互作用视频处理18和其他被认为介导蛋白质传递到液泡的后期步骤探索。一个强有力的互动候选者是VAM3型,因为它编码一种在液泡膜中发现的syntaxin同源物(瓦达等。, 1997). 的过度表达VAM3型抑制CPY错配表型第18版^tsf公司突变细胞：80%以上的放射性标记CPY被发现为36°C下的成熟物种（图​（图6A，6A、 车道4）。生产过剩内体合成蛋白同源物Pep12p第18版^总悬浮液细胞无明显影响（表​（表2）。2). 因此，这些数据表明Vam3p和C类Vps蛋白可能在共同转运中发挥作用踩在液泡上。

VPS18和VPS11基因产物的鉴定

为了研究视频处理18和虚拟专用交换机11基因产物生化方面，针对TrpE-Vps18p和TrpE-Vps11p融合蛋白。Vps18p特异性抗血清识别100kDa蛋白质³⁵S标记的野生型细胞裂解物，与Vps18p预测的107 kDa分子量一致未与隔离第18版Δ细胞裂解物。多克隆针对Vps11p的抗血清可识别约115kDa的蛋白质，类似于Vps11p预测的118 kDa的分子量，而不是在中检测到vps11版Δ单元。在携带视频处理18或虚拟专用交换机11基于多拷贝2μ的基因质粒，相应基因产物增加约15倍观察。Vps18p和Vps11p的丰度仅略有下降超过了45分钟的追逐。Vps18p和Vps11p似乎都构成<总细胞蛋白的0.01%。Vps18p和Vps11p都缺乏通过SDS-PAGE可识别的信号序列及其流动性未受衣霉素或内糖苷酶H治疗的影响，表明这些蛋白质不会进入分泌途径。因此，这些数据表明视频处理18和虚拟专用交换机11编码相对罕见的细胞质蛋白。

异寡聚体蛋白中C类VPS蛋白的相互作用复杂

C类的共同表型特征虚拟专用交换机空突变体和观察视频处理18,视频处理16、和视频处理33遗传相互作用（图​（图6）6)表明C类Vps蛋白可能在一个共同的步骤，可能是普通蛋白质复合物的一部分。要确定C类Vps蛋白是否存在物理相互作用、化学相互作用使用交联剂进行交联实验数字信号处理器。³⁵S标记的球形体被渗透溶解用DSP孵育30分钟。交联猝灭后反应后，将提取物依次进行免疫沉淀和SDS-PAGE。DSP含有二硫键两个功能反应基团之间；因此，个人交联复合物的组分可以在处理后分解使用还原剂。

在图中​图7A7A（通道1-3）、DSP和模拟处理的细胞提取物经过免疫沉淀Vps18p特异性抗血清。产生的免疫沉淀物是用2-巯基乙醇处理以裂解交联剂二硫化物并随后使用这两种方法进行再收款Vps11p-和Vps18p-特异性抗血清。Vps11p和Vps18p均为与Vps18p特异性抗血清共免疫沉淀（图​（图7A，7A、 车道2). 首先使用Vps11p特异性抗血清的交互实验，然后用Vps11p和Vps18p特异性抗血清也揭示了两者之间的物理联系Vps11p和Vps18p（图​（图7A，7A、 车道5）。Vps11p与Vps18p依赖于交联剂DSP的治疗（图​（图7A，7A、 车道1和4）。此外，两种抗血清均未显示交叉反应性（图​（图7A，7A、 车道3和6）。这些结果表明Vps18p和Vps11p在异低聚体蛋白复合物中结合。

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图7

C类Vps蛋白在异寡聚体蛋白复合物。（A） WT产生的球形体（野生型，SEY6210），第18版-Δ1（JSR18Δ1），以及第11页-Δ2（第6211页e（电子）)菌株被标记为Expres公司³⁵S作用30分钟，追逐30分钟，然后渗透溶解。裂解物用交联剂DSP（+X-linker）处理或模拟处理（−X-linker）。交联提取物经过变性非还原条件下的免疫沉淀Vps18p特异性抗血清（1–3道）或Vps11p特异性抗体（4-6车道；第一Ab）。免疫沉淀物减少了1%2-巯基乙醇（+还原）并再次沉淀Vps18p-和Vps11p-特异性抗血清（第二抗体）。（B）WT产生的球形体（野生型，SEY6210），虚拟专用数据库33-Δ2（LBY317），以及第16版-Δ2（BHY113）菌株³⁵S标记，渗透溶解，用DSP处理如上所述。交联和模拟处理提取物为使用Vps11p特异性进行序贯免疫沉淀抗血清（第一抗体），然后用变性但不还原的Vps18p特异性抗血清（第二抗体）条件。（C） 1-4车道，³⁵S放射性标记WT（野生型，SEY6210）球原生质体渗透溶解并用DSP处理如上所述。交联提取物经过Vps11p特异性抗血清免疫沉淀（第一抗体）。这个然后用还原剂或非还原缓冲区（分别为+或−还原），然后用所示抗血清（第二抗体）再次沉淀。5号车道，³⁵标有S的vps11版-Δ2（6211瑞典克朗e（电子）)和第18页-Δ1（JSR18Δ1）裂解物在用DSP和按照上述顺序进行免疫沉淀。总共例，分析前最终免疫沉淀物减少SDS-PAGE电泳。

确定其他蛋白质是否可以交联到Vps18p和Vps11p，除两种免疫沉淀之间的交联剂没有减少。什么时候？DSP处理过的裂解物接受顺序免疫沉淀使用Vps11p特异性抗血清，然后使用Vps18p特异性抗体，分离出至少六种蛋白质：Vps18p和Vps11p作为四种不太丰富的蛋白质，范围从75 kDa到140 kDa（图​（图7B，7B、 车道2）。与交联相关的两种蛋白质Vps18/Vps11蛋白复合物的表观分子量与Vps16p和Vps33p（分别为75 kDa和90 kDa）。收件人检查Vps16p和Vps33p是否与Vps11/Vps18蛋白复合物，³⁵S标记细胞提取物野生型，虚拟专用数据库33Δ和第16版Δ应变为用DSP治疗，并进行序贯免疫沉淀Vps11p-和Vps18p-特异性抗血清。The protein composition of the交联Vps18/Vps11蛋白复合物在虚拟专用数据库33Δ和第16版Δ应变：来自虚拟专用数据库33Δ裂解产物缺乏75-kDa蛋白，而复合物从第16版Δ裂解物缺乏75-kDa和90-kDa蛋白质（图​（图7B，7B、 车道3和4）。

为了确认75-kDa和90-kDa蛋白的身份Vps33p和Vps16p分别是交联的Vps18/Vps11蛋白复合物是从³⁵S标记的野生型细胞用Vps11p特异性抗血清裂解的产物用Vps18p-、Vps33p-或Vps16p-特异性重新沉淀抗血清。如图所示​图7C7C（2-4车道）、Vps18p、Vps33p和用DSP处理的细胞提取物中的Vps11p免疫沉淀Vps16p，表明Vps33p和Vps16p是交联的Vps18/Vps11蛋白复合物。因为Vps33p在第16版Δcells，Vps33p和Vps16p从交联复合物第16版Δ裂解物（图​（图7B，7B、 车道4）表明Vps16p可能介导Vps33p与Vps18/Vps11蛋白复合物。确定观察到的Vps11p和Vps18p之间的相互作用发生在前后细胞溶解，³⁵标有S的vps11版Δ和第18版在DSP之前，对Δ细胞进行裂解，然后进行组合治疗。发现交联的Vps11/Vps18蛋白在这些条件下不会形成复合物（图​（图7C，7C、 车道5）。

Vps11p、Vps18p和Vps16p与真空膜共分馏和一种独特的致密亚细胞组分

确定C类Vps蛋白的潜在位点功能、亚细胞分馏研究定位这些蛋白质。野生型球形体³⁵S-标记30分钟，追逐60分钟，渗透溶解。在300×克，的裂解物以13000×克和100,000 ×克生成P13、P100和S100分数。对每一组分进行免疫沉淀和SDS-PAGE分析。Vps18p、Vps11p和Vps16p在这些条件下共分馏条件（图​（图9A）：9A） ：蛋白质分布在P13之间（～50%）和P100（～40%）馏分，只有一小部分（<10%）位于S100部分。相比之下，Vps33p主要是表现为可溶性蛋白：在P13和P100组分，剩余90%的Vps33p存在于S100中分数。几种细胞器标记蛋白的分布是也已确定（见图​图9B）。9B） ●●●●。液泡碱性磷酸酶基本恢复从P13组分中，晚期高尔基体蛋白Kex2p主要是在P100分数中发现。如前所述(贝切勒et（等）阿尔。, 1996)，内胚体合成蛋白Pep12p定位于P13和P100分数。颗粒部分均未受到污染细胞溶质酶葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PDH），表明几乎没有全细胞污染或膜聚集发生。

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图9

C类Vps蛋白是可沉积的蛋白质复合物。野生型（SEY6210）球状体用Expres标记30分钟³⁵S并追赶60分钟在低渗缓冲液中溶解之前。在300度的净空旋转后×克，用试剂处理裂解产物指示15分钟，然后以100000×克持续45分钟以产生上清液（S100）和沉淀（P100）分数。Vps18p和Vps11p从每一种中免疫沉淀分数，通过SDS-PAGE进行解析，并通过荧光成像进行可视化。

为了进一步了解C类Vps蛋白，我们进行了平衡密度梯度分析野生型细胞裂解物。安³⁵S标记细胞在300×克然后被加载Accudenz密度梯度的顶部。离心至平衡，收集馏分，以及C类Vps蛋白和细胞器标记物Pep12p和mALP通过免疫沉淀和SDS-PAGE测定。Vps18p和Vps11p共分馏并在轻区和致密区之间分裂梯度。约40%的Vps18p和Vps11p与成熟蛋白共定位空泡性ALP，而剩下的60%的Vps18p和Vps11p是发现在更密集的梯度区域（图​（图8C）。8C） ●●●●。Vps16p与Vps18p共分馏和Vps11p。C类Vps蛋白的部分发现于梯度区域未与含有Pep12p的区域共定位内膜（图​（图8C）8C） 或使用晚期高尔基标记Vps10p。虽然质膜、线粒体和内质网也迁移到类似Accudenz梯度的更密集区域(歌手克鲁格等。, 1993)C类Vp的角色空泡蛋白分选中的蛋白质不太可能定位于这些细胞器。

检测C类Vps蛋白是否与细胞膜，来自上述Accudenz梯度的样品（图​（图8C，8C、 组分1-5和8-12）合并并进行浮选分析。Accudenz被添加到40%，样品装载在Accudenz密度的底部梯度。梯度离心至平衡细胞膜从致密负载部分迁移到由于其固有的浮力，梯度的密度较小密度（Zinser和Dawn，1995）。结果与之类似如图所示​图8C：8C： 顶部发现的Vps18p和Vps11p池梯度（分数1-5）从载荷分数浮动到ALP梯度的低密度区域，但Vps18p和Vps11p来自梯度的稠密区域（分数8–12）在载荷分数中。此外，P13的单独浮选分析和S13细胞组分。Vps18p和Vps11p的池以13000×克与ALP一起浮动，但剩余的S13 Vps18p和Vps11p池仍留在稠密的Accudenz载荷分数。与早期的观察相比(霍拉兹多夫斯基和Emr，1993年)，我们还发现部分Vps16p与液泡膜。观察到的膜的这种差异Vps16p的相关性似乎主要是由于裂解缓冲液，因为对照实验表明以前使用的基于三（羟甲基）氨甲烷的裂解缓冲液破坏C类Vps蛋白与膜，以及它们之间的相互作用。因此差速离心和密度梯度数据表明Vps18p、Vps11p和Vps16p的重要部分与液泡膜。Vps18p、Vps11p和Vps16p的剩余部分似乎与1）不属于在这些条件下与膜相关或2）不明密度膜分数。

C类Vps蛋白质是一种新型蛋白质复合物的组成部分

与C类相关的常见表型集虚拟专用交换机变种人认为C类VPS公司基因产品在空泡蛋白分选中可能在同一步骤发挥作用通路(班塔等。, 1988;罗宾逊等。,1988;雷蒙德等。, 1992). Vps18p的发现，Vps11p、Vps16p和Vps33p可以化学交联（图​（图7）7)表明这些蛋白质在体内物理相互作用。这些相互作用的生物学意义由事实上，Vps16p的过度生产抑制了第18页和视频处理33（图​（图6）6)但没有绕过对Vps18或Vps33蛋白质的要求。相对丰度交联蛋白复合物中的Vps16p和Vps33p低于Vps18p和Vps11p（图​（图7）。7). 虽然进一步的分析是需要检查天然C类Vps蛋白的化学计量比这些数据表明，Vps16p和Vps33p可能与Vps18/Vps11蛋白复合物处于亚化学计量水平，因此可能具有监管功能。Vps33p未能Vps18p和Vps11p交联第16版Δ突变细胞（图​（图7B），7B） 表明，尽管Vps33蛋白水平正常Vps16p可以调节Vps33p和Vps18/Vps11蛋白复合物。

大多数Vps18p、Vps11p和Vps16p似乎与相互作用于体内的蛋白质复合体中，作为三种蛋白质亚细胞分馏过程中相互共分馏实验（图​（图8）。8). 相比之下，只有Vps33p的一小部分细胞内似乎与Vps18/Vps11/Vps16蛋白相关稳态条件下的复杂。小于Vps33p的10%与Vps18p、Vps11p和Vps16p共分馏（图​（图8），8)，建议Vps33p只能与Vps18/Vps11/Vps16进行瞬态交互蛋白质复合物。亚细胞分离实验也揭示了大量的Vps18p、Vps11p、Vps16p和一小部分Vps33p与膜相关，但仍在100,000 ×克在有洗涤剂的情况下（图​（图9）。9).这些结果表明，C类Vps蛋白是蛋白质复合物大到足以在100000×克; 然而，我们不能排除C类Vps蛋白与细胞骨架元件或抗洗涤剂溶解的膜域，如观察到小窝相关蛋白（参见帕顿，1996年;更努力和Simons，1997年).

密度梯度分析表明，Vps18p、Vps11p和Vps16p与成熟空泡性ALP共定位（图​（图8C）。8C） ●●●●。部分Vps11p和Vps18p与空泡性ALP的共定位是一致的根据之前的观察，Vps11/Pep5蛋白和Vps18/Pep3-转化酶融合蛋白在液泡膜中富集准备(伍尔福德等。, 1990;普雷斯顿et（等）阿尔。, 1991). 剩余～60%的Vps18p、Vps11p和Vps16p局限于梯度密集区（图​（图8C）8C） 没有与含有Pep12p的内涵体膜或与高尔基。这些致密部分可能含有一个可沉积的水池与膜无关的C类Vps蛋白复合物。或者，Vps18p、Vps11p和Vps16p的这一部分可以相互作用具有非常致密的膜组件；可能性包括运输囊泡，是液泡或内胚层膜的致密亚结构域，或晚期运输中间产物，如“成熟”内体隔室。

C类Vps蛋白复合物介导蛋白质的后期步骤运输至真空室

在Vps18p，Vps11p、Vps33p和Vps16p表明这些蛋白质的功能共同执行公共传输步骤。要检查C类Vps蛋白的直接作用第18版等位基因功能对温度敏感(第18版^总悬浮液)曾经用于检查Vps18p功能丧失的直接后果蛋白质转运和液泡形态。

当切换到非允许温度时，第18版^总悬浮液细胞在至少四种不同的蛋白质中表现出快速缺陷液泡的运输途径（图​（图1、，1,​,2,2,​,3,三,​,4).4). 新合成的液泡水解酶通过at从高尔基晚期转移到液泡至少两条不同的路径(巴斯特等。, 1997;Cowles公司等。, 1997).第18版^tsf公司展示的细胞所有被测液泡水解酶的即时加工缺陷（包括CPY、PrA、PrB、CPS和ALP），表示Vps18p在ALP和CPY/CPS生物合成转运途径中的直接作用到液泡。此外，亚细胞分离研究显示阻断的ALP和CPS前体在流行隔室第18版^总悬浮液单元格位于38°C，表明ALP和CPS以不同的方式转运到液泡运输每种都需要Vps18p功能的中间体他们的货物运往真空罐。此外，第18版^总悬浮液细胞在38°C时出现内吞标记物传递缺陷，API和自噬体到液泡。

事实上，Vps18p的失活迅速导致生物合成、内吞和自噬运输到液泡表明Vps18p函数是运输反应所必需的每一条路径。虽然我们不能排除这种可能性第18版^总悬浮液细胞在单个输送其他需要的不稳定成分的运输路径液泡的运输途径，这种解释似乎不太可能是其他几种条件等位基因VPS公司基因（即。，PEP12、VPS4、，和VPS41系列)不要展示这样的多效性输运缺陷(巴斯特等。, 1997;Cowles公司等。, 1997). 相反，多重运输缺陷在中感应第18页^tsf公司当温度升至38°C时，电池似乎与C类Vps蛋白最为一致在通向液泡的多种运输途径中发挥作用。

超微结构分析显示膜显著堆积液泡附近的隔室第18版^总悬浮液单元格位于非许可温度，表明Vps18p可能介导运输中间体与液泡的对接/融合（图​（图44和​和5）。5). 许多累积的隔室由多个小泡组成使人联想到内体室的小体(海伦尼乌斯et（等）阿尔。, 1983;希克等。, 1997). 频率和异常结构的空泡周围位置与累积内吞标记的荧光染色模式FM4–64英寸第18版^总悬浮液细胞在38°C时，表明这些隔室中至少有一些可能对应于内吞中间体（图​（图3A三A和​和5）。5). 此外，第18版^总悬浮液细胞积聚40-50nm的膜囊泡，200至400纳米的单膜室，以及类似于自噬体的双层膜室（图​（图44和​和5）。5). 这些隔间可能代表来自通往液泡的多条路径，通常只有在野生型细胞中短暂存在。中液泡的形态第18版^tsf公司细胞基本上保持不变，甚至在38°C下长时间培养后（图​（图3，三,​,4,4,​,5).5). 此外，没有在中观察到空泡遗传缺陷第18版^总悬浮液电池温度为38°C。这些结果表明Vps18p不直接参与液泡的维持完整性。相反，我们对空泡蛋白转运和形态学第18版^总悬浮液细胞表明C类空泡形态缺陷虚拟专用交换机空突变体是由于液泡定位错误造成的次要后果细胞器稳定性所需的成分。

C类Vps蛋白质的特性

Vps33p与Sec1蛋白家族成员同源被认为可以调节小泡的对接靶细胞器（下文将进一步讨论）。相反，氨基Vps18p、Vps11p和Vps16p的酸序列和潜在同源物对其功能提供很少直接线索；然而，这些蛋白质确实有几个有趣的特点。例如，Vps18p、Vps11p、，和Vps16p具有预计采用α螺旋的区域线圈构象（COILS 2.1；卢帕斯等。, 1991)因此可能有助于蛋白质与蛋白质的相互作用(卢帕斯，1996年).此外，Vps18p和Vps11p都包含C端子H2 RING锌指结构域，预测每个结构域配位两个锌原子。发现了环指锌结合域及其变体在80多种具有不同功能的蛋白质中（参见边框和弗里蒙特，1996;绍林等。, 1996). 其中几个蛋白质是膜相关多蛋白复合物的组成成分；因此，环指结构域可能与蛋白质和可能是蛋白质与脂质的相互作用。例如，小鼠43 kDa突触后蛋白，调节乙酰胆碱的聚集突触后膜上的受体(彭和弗罗纳，1985年;弗罗纳等。, 1990)，需要一个完整的H2环指锌结合域的功能(苏格兰等。,1993). 此外，人类EEA1的RING域有助于体外培养中EEA1与内膜的外周联系单元格(斯滕马克等。, 1996).

环指结构域的完整性对于生物Vps18p的功能，作为第一个保守半胱氨酸的突变指环域（C₈₂₆S） 渲染Vps18p功能对温度敏感（图​（图1、，1,​,2,2,​,3,三,​,4,4,​,5;5;罗宾逊et（等）阿尔。, 1991). Vps18p与Vps11p仅由Vps18p环指结构域介导，如Vps11p突变的Vps18蛋白仍然可以相互交联在里面第18页^总悬浮液非允许温度下的细胞（我们的未发表的结果）。相反，Vps18p中的RING锌指结构域Vps11p可能调节复合物或调节与对接所需的其他蛋白质的相互作用液泡融合。

有趣的是，Vps18p与D。黑腹食肉动物dor蛋白（BLAST p值，7×e（电子）⁻²⁸)，一种含有1002个氨基酸的蛋白质C端H2环指域(舍斯托帕尔等。, 1997).这个多尔该基因座首次在具有deep基因的突变果蝇中发现橙色眼睛(斯塔克，1918年). 大多数病变位于多尔是致命，诱发黑色素瘤和其他一些发育性肿瘤幼虫的缺陷（参见Lindsley和Zimm，1992年). 生存多尔突变果蝇表现出色素沉积缺陷在眼睛、乳晕、脂肪体和马尔斐夫小管内(眼泪，1991;Lindsley和Zimm，1992年). 因为色素颗粒似乎是改良溶酶体室(伯克哈特等。, 1993;尺寸等。1995年;奥尔洛，1995年)dor可能是Vps18p的功能同源物，因此可能介导多个货物分子到溶酶体，包括所需的成分用于色素积累。Vps18p、Vps11p和Vps16p也共享与推测的显著同源性秀丽隐杆线虫功能未知且表达多种哺乳动物的蛋白质序列标签。因此，这些蛋白质及其蛋白质向液泡/溶酶体转运的功能是保守的整个真核生物。

我们非常感谢Michael McCaffery和Tammie McQuistan电子显微镜杰出的电子显微镜工作核心B由Marilyn Farquhar领导（项目拨款CA58689）。我们感谢Karl Koehrer和Peggy Mustol的抗体生产和KarlKoehrer对最初的第18版^总悬浮液液泡蛋白转运研究。David Bedwell、Robert Fuller和感谢Dan Klonsky慷慨提供质粒和抗血清。我们感谢Emr实验室成员的有益讨论和批判性阅读这份手稿，尤其是塔玛拉·达索，克里斯托弗·伯德（Christopher Burd）、艾琳·盖诺（Erin Gaynor）和贝弗利·温德兰（Beverley Wendland）。这项工作是由国家研究院资助的GM-32703和CA-58689是霍华德·休斯的调查员医学院。