癌症研究。作者手稿；可在PMC 2009年8月15日获得。
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NIHMSID公司：尼姆斯56191
BMI-1促进尤因肉瘤的致瘤性CDKN2A型-压制
,1,4 ,1,4 ,1 ,1 ,2 ,1 ,1 ,三 ,2,三和*,1,2,三
Long Hung（长悬挂）
1洛杉矶儿童医院儿科血液肿瘤科
Hiro Shimada先生
三南加州大学凯克医学院病理学系
蒂莫西·特里奇
2南加州大学凯克医学院儿科
三南加州大学凯克医学院病理学系
伊丽莎白·R·劳勒
1洛杉矶儿童医院儿科血液肿瘤科
2南加州大学凯克医学院儿科
三南加州大学凯克医学院病理学系
1洛杉矶儿童医院儿科血液肿瘤科
2南加州大学凯克医学院儿科
三南加州大学凯克医学院病理学系
4这些作者对这项工作贡献均等
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补充数据。
GUID:0532D11E-ED92-4340-81A6-8430B263653A
补充表格。
GUID:3A371059-0F8B-4AD0-AA37-2843B30C7B2D
摘要
多梳组基因的解除调控BMI-1型与许多人类癌症的发病机制有关。在这项研究中，我们研究了尤因肉瘤家族肿瘤（ESFT）是否表达BMI-1，以及它是否在这类高度侵袭性骨和软组织肿瘤中作为癌基因发挥作用。我们的数据表明，ESFT细胞高度表达BMI-1，尽管它不会显著影响增殖或生存，但BMI-1积极促进锚定非依赖性生长在体外和致瘤性体内此外，我们发现BMI-1型促进p16野生型和p16阴性细胞系的致瘤性，表明BMI-1在ESFT中的致癌作用机制至少部分独立于CDKN2A型镇压。BMI-1敲除后ESFT细胞的表达谱研究表明，BMI-1调节数百个下游靶基因的表达，尤其包括参与分化和发育以及细胞：细胞和细胞：基质粘附的基因。功能获得和丧失分析证实，BMI-1抑制粘附相关基底膜蛋白巢蛋白1的表达。此外，当BMI-1促进ESFT粘附时，nidogen 1抑制细胞粘附在体外这些数据共同支持了BMI-1型ESFT的发病机制，并表明其在这些肿瘤中的致癌功能部分是通过调节粘附途径介导的。
关键词：BMI-1，尤因氏，致瘤性，p16
简介
尤因肉瘤家族（ESFT）的成员以嵌合融合癌基因的表达为特征，最常见的是EWS-飞行1（参考文献(1)). EWS-FLI1转化NIH-3T3成纤维细胞及其在ESFT细胞中的敲除显著抑制致瘤性(2). 相反，EWS-FLI1在原代人成纤维细胞中诱导p53依赖性细胞周期阻滞，p16的丢失是原代小鼠成纤维细胞转化所必需的（参考文献(1)). 因此，适当抑制先天性肿瘤抑制途径对于EWS-FLI1介导的恶性转化是必要的。不幸的是，到目前为止，对原发性ESFT样本的评估对这种失活机制的了解甚少体内只有25%的ESFT病例表现出p53突变或p16缺失INK4a公司/ARF基因座，尽管这些患者的预后较差，但他们明显代表了少数病例(三).
多梳群家族蛋白在维持干细胞自我更新和多潜能以及控制细胞分化和发育中起着核心作用(4-6). 多梳蛋白组装成大的复合物，称为PRC1和PRC2，通过调节染色质结构来抑制转录，其在癌症中的表达经常被解除(7-9). PRC1基因体重指数-1首先被确定为与c-myc公司在淋巴瘤小鼠模型中(10). 研究体重指数-1敲除小鼠后来证明，BMI-1调节造血、神经和神经嵴干细胞的自我更新（参考文献(9)). 从机制上讲，BMI-1主要通过转录抑制Cdkn2a公司(11). 这个CDKN2A型位点编码第16页INK4a公司和第14页自动射频，通过调节RB和p53通路促进细胞周期调节和凋亡的基因。在体细胞干细胞中，BMI-1在功能上抑制这两种途径，从而支持自我更新和永生。细胞分化过程中BMI-1表达的下调与这种抑制的释放有关。
除了c-myc公司(10,12),体重指数-1与白血病相关易位E2a-Pbx1型(13)和Hoxa9-Meis1型(14)在小鼠白血病发生中，它也与鼻咽癌的起源有关(15)、神经母细胞瘤(16,17)和髓母细胞瘤(18,19). 此外，EWS-FLI1相关蛋白TLS-ERG可以使内源性上调的原始人类造血干细胞永生化BMI-1型表达式(20). 最后，白血病、神经母细胞瘤和乳腺癌干细胞的自我更新和致瘤性与BMI-1型功能(14,17,21). 因此，BMI-1型在许多类型的人类癌症中作为癌基因表达并发挥作用。重要的是，尽管直接转录抑制CDKN2A型基因座有助于肿瘤活动BMI-1型在蜂窝模型中(12)，最近的研究表明，存在BMI-1介导的肿瘤促进的其他机制，并且这些机制在功能上独立于CDKN2A型压制(19,22-24).
在本研究中，我们调查了BMI-1型在ESFT中作为癌基因发挥作用。我们的研究结果证实，ESFT细胞高度表达BMI-1，并促进凤尾鱼的非依赖性生长在体外和肿瘤形成体内此外，我们的数据还表明BMI-1型ESFT中介导的致瘤性至少部分独立于CDKN2A型-镇压等等BMI-1型调节参与细胞分化和发育以及细胞粘附的途径。这些数据尤其支持以下假设：BMI-1型表达是ESFT发病机制的核心，细胞粘附途径的调节有助于BMI-1介导的肿瘤家族的致瘤性。
材料和方法
细胞系和肿瘤标本
从Timothy Triche博士（加利福尼亚州洛杉矶）和Heinrich Kovar博士（奥地利维也纳）获得的ESFT细胞系按所述进行培养(25,26). MRC5、Tera-2和MCF-7细胞从美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA）获得，H9人胚胎干细胞从Wicell（Madison，WI）获得。主要肿瘤RNA和组织切片取自洛杉矶儿童医院（CHLA），其他RNA样本和ESFT组织微阵列取自俄亥俄州哥伦布市的合作人类组织网络（CHTN）。根据CHLA临床调查委员会的批准，所有原始组织样本均匿名采集。
定量实时逆转录酶PCR（Q-RT-PCR）
cDNA由DNA酶I处理的RNA（iScript；Biorad，Hercules，CA）生成，Q-RT-PCR使用经验证的Taqman™基因表达分析（Applied Biosystems，Foster City，CA）进行。在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系统上进行了三次检测，平均Ct值相对于肌动蛋白和/或GAPDH公司在同一个样本中。从至少3个重复实验中收集表达数据。
Western Blot和Imuno组织化学
使用以下一级抗体在1:1000稀释液中进行全细胞裂解物的Western blot：BMI-1（Cat 05−637）（Millipore，Billerica，MA）；PARP（Cat 9542）、磷酸化RB（Cat 9969）、总RB（Cat9969）和p21（Cat 2946）（马萨诸塞州丹佛市细胞信号）；p16（Cat sc-468）、p14ARF（Cat sc-8613）和ACTIN（Cat sc-1616）（加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）。组织切片和TMA用抗BMI-1抗体染色（1:5000；Millipore，Billerica，MA）。COG生物病理学中心（俄亥俄州哥伦布市）使用Aperio ImageScope扫描仪和软件（加利福尼亚州维斯塔市Aperio）对TMA进行数字扫描并获取图像。
基因敲除和过度表达
击倒BMI-1，细胞系转染50 nMBMI-1型-靶向（siBMI1-A:5'-CCGUUAAUUUCCAUG-3'或siBMI1-B:5'-GCGUAACCAAUCUC-3'）或阴性对照（siNS）siRNA寡核苷酸（Ambion，Austin，TX）。击倒NID1号机组通过转染100 nM预先验证的siRNA寡核苷酸实现（Ambion，Austin，TX）。用于稳定BMI-1型将敲除、siBMI1-A和siBMI1-B DNA寡核苷酸序列克隆到pSuper-retro-puro短发夹载体主干（shBMI1-B和shBMI1-A）（Oligoengine，西雅图，华盛顿州）。非克隆序列（5'-ACGCATGCATGCTTGCTTT-3'）被类似地克隆为阴性对照(27). 对于功能增益研究，全长人类BMI-1型从TC-71细胞中扩增cDNA，进行序列验证并克隆到pBabe-Puro中。通过将293FT包装细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）与适当的逆转录病毒构建物以及包装质粒pHit 60（MLV gag-pol）和pHit 456（VSV信封）（由CHLA的C.Lutzko博士提供）进行三次转染，产生逆转录病毒上清液。48小时后收集病毒上清液，用于转导ESFT细胞，然后在2 ug/ml嘌呤霉素中进行选择。
细胞生长、粘附和致瘤性评估
将转染/转导的细胞接种在一式三份的孔中，并使用ViCell XR细胞计数器（Beckman Coulter，Fullerton，CA）测定总细胞计数和细胞活力。细胞周期和凋亡的流式细胞术研究按照膜联蛋白V检测和DNA含量的标准方案完成(28)使用FACScan仪器（Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖）。为了研究凤尾鱼非依赖性生长，将转导的细胞作为单细胞悬浮液，置于添加有20%FBS、2 ug/ml嘌呤霉素、2mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100mg/ml链霉素的Iscove培养基中的0.35%诺布尔琼脂（DIFCO，底特律）中。细胞层被夹在饲养层之间，饲养层由0.7%的Noble琼脂组成，在Iscove培养基中添加10%FBS、2 ug/ml嘌呤霉素、2mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100mg/ml链霉素。体外按说明进行细胞粘附试验(29). 简言之，5×104细胞/孔被镀在96孔板中，然后用PBS清洗并每隔30分钟固定一次。贴壁细胞用0.2%结晶紫染色，然后用水冲洗几次。用2%SDS提取结晶紫，并使用GeniosPro读板器（Tecan，San Diego，CA）测量每个孔的吸光度（570nm）。体内研究是在机构动物护理和使用委员会的保证下进行的。NOD-SCID小鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯·里弗实验室）皮下注射5×106用卡尺测量肿瘤细胞和肿瘤体积。当肿瘤达到任何尺寸≥1.5 cm时，处死小鼠。
基因组实时PCR检测p16状态
如前所述进行基因组实时PCR(30)和计算CDKN2A型外显子1a基因拷贝数测定GAPDH公司每个样品中的副本编号(31).
微阵列分析技术
在siRNA-转染48小时后，从A4573细胞中提取RNA，并对DNase I进行处理和纯化（RNeasy Minikit，Qiagen，Valencia，CA）。使用GeneChip®Whole Transcript（WT）Sense Target Labeling Assay Manual（Affymetrix，Santa Clara）在CHLA基因组核心中制备样本，并按照制造商的说明与HuEx1.0微阵列进行杂交。使用Affymetrix Expression Console软件中的迭代探针对数强度误差估计（iterPLIER）对细胞强度（CEL）文件数据进行量化规范化和汇总。使用LIMMA软件包（微阵列数据线性模型）确定每个转录本的线性模型拟合(32)以及对照组和对照组之间差异表达的基因BMI-1型根据转录水平信号强度的统计显著差异（p<0.01）和≥1.5倍的变化来鉴定敲除细胞。Metacore公司1（GeneGo，Inc.，MI）分析工具用于识别功能基因本体类别。
结果
BMI-1在尤因肿瘤中表达
对原发性肿瘤和ESFT细胞系产生的表达微阵列数据进行分析BMI-1型表达。如图所示(),BMI-1型是可变的，但在所有样本中都可以检测到。通过对一组独立的原发性肿瘤和细胞系队列进行Q-RT-PCR分析，这些数据得到了证实(). 类似地评估由原代人成纤维细胞（MRC5）、骨髓源性间充质基质细胞（MSC）和人胚胎干细胞（hESC）组成的未转化对照细胞。为了确保同等的细胞外环境刺激，在对数生长期收集所有细胞，除人胚胎干细胞外，在收获前在相同的培养基（含10%胎牛血清的RPMI）中培养24小时。蛋白质印迹()和免疫组织化学分析()证实BMI-1蛋白分别在ESFT细胞系和原发肿瘤中表达。67例ESFT肿瘤活检的组织学评估显示，49例（73%）BMI-1在肿瘤细胞中广泛而稳定地表达，而内皮细胞和浸润淋巴细胞的蛋白阴性(案例一和案例二）。在18例（27%）患者中，仅检测到罕见和/或极弱染色的BMI-1阳性肿瘤细胞(案例III）。
Ewing肿瘤（ESFT）表达BMI-1A.）使用Affymetrix U133A GeneChips™的基因表达谱检测BMI-1型(Pcgf-4；探针ID 202265_at）。虚线和错误条分别表示中间表达式级别和分位数范围。
B.）20个原代ESFT和6个ESFT细胞系的定量RT-PCR证实了可检测但可变的BMI-1型在ESFT中。非恶性H9人类胚胎干细胞（hESC）、四种原代人骨髓间充质干细胞培养物（MSC1-MSC4）和MRC5肺胚胎成纤维细胞中的表达均较低。表达水平重复三次，并相对于GAPDH公司和肌动蛋白在同一个样本中。
C）Western blot分析检测ESFT细胞系中的BMI-1蛋白，而正常成纤维细胞（MRC5）和MSC中的表达很低甚至无法检测到。ESFT和非恶性细胞系中蛋白质表达的差异性与（B）所示的转录表达相关。
D.）67例ESFT活检标本的免疫组织化学分析显示，49例肿瘤细胞中BMI-1呈高度阳性（如病例I和病例II）。与肿瘤细胞不同，病例I中的内皮细胞（箭头）和病例II中的浸润淋巴细胞（圆圈）为阴性。在18例（如病例III）中，BMI-1弱表达或仅由罕见细胞表达。
总之，通过RNA和蛋白质研究，我们发现绝大多数ESFT细胞高度表达BMI-1。我们目前正在研究高与。原发性ESFT中低水平BMI-1表达。
BMI-1敲除不会诱导ESFT细胞死亡或CDKN2A型表达
以前的研究表明，BMI-1促进正常人成纤维细胞的增殖(33)多种人类肿瘤细胞系中BMI-1的缺失导致细胞死亡(34). 为了确定BMI-1是否促进ESFT细胞的存活和/或增殖，我们评估了BMI-1型在标准培养条件下生长的ESFT细胞上的表达。使用了两种不同的siRNA序列，两种序列都被有效抑制BMI-1型ESFT和MCF7乳腺癌细胞(). 与MCF7细胞相比，其中BMI-1型发现敲除显著抑制增殖和存活，BMI-1型敲除对ESFT细胞的生长没有影响(和补充数据图1). 为了证实这些发现，我们还发现，尽管过度表达BMI-1型促进MRC5成纤维细胞增殖，对ESFT细胞增殖无影响（数据未显示）。
BMI-1敲除不影响ESFT细胞增殖或死亡A.）定量RT-PCR确认击倒BMI-1型将siRNA寡核苷酸（siBMI1A和siBMI1B）转染后的细胞与模拟或对照（siNS）转染细胞进行比较。ESFT细胞系：A4573、StaET8.2、TC71和MCF7：阳性对照，乳腺癌细胞系。转染后48小时从细胞中获取RNA，基因表达标准化为GAPDH公司同一样本中的表达水平。条形图表示平均值，误差条形图表示3个重复实验的标准偏差。
B.）siRNA-介导的击倒BMI-1型显著抑制MCF7的生长，但不抑制ESFT细胞的生长。连续4天每天对转染siRNA寡核苷酸的细胞进行计数，并绘制活细胞数。BMI-1型将每个时间点的敲除（siBMI1）计数与对照（siNS）转染细胞进行比较。平均计数用代表3个重复实验标准偏差的误差条绘制。显示了siBMI1B的数据。siBMI1A序列获得了等效结果（未显示）。
C.）定量RT-PCR分析表明BMI-1敲除对CDKN2A型在无血清培养中表达。在RNA分离之前，在无血清条件下培养稳定转导的A4573细胞（shBMI1和shNS对照）48小时。直方图表示重复实验的平均和标准偏差（误差条），基因表达相对于同一样本中的GAPDH表达。
D.）拆除BMI-1型在无血清条件下生长的细胞中，对ESFT细胞增殖或死亡没有影响。A4573细胞用BMI-1型发夹结构（shBMI1）并在无血清条件下生长48小时，细胞死亡（左侧面板；附件-V/碘化丙啶（PI）染色细胞的FACS分析）或细胞增殖（右侧面板；固定的PI染色细胞的FACS分析）没有变化。
因为据报道BMI-1通过抑制CDKN2A型以及其蛋白产物p16和p14ARF，我们推断BMI-1调节对ESFT细胞增殖和死亡缺乏影响可能是CDKN2A型细胞系中的缺失。使用Q-RT-PCR和western blot的组合，我们发现A4573、StaET8.2和StaET7.2表达CDKN2A型转录本和A4573和StaET8.2都表达p16蛋白(补充数据图2A&B). 基因组实时PCR(30)揭示了TC71、TC32和TC252细胞都具有纯合缺失CDKN2A，StatET8.2和StatET7.2是该位点的野生型，A4573被半合子删除(补充数据图2C&D). 因此，无论p16状态如何，BMI-1敲除都不会抑制ESFT细胞的生长。接下来，我们开始确定BMI-1是否抑制CDKN2A型p16+ESFT细胞中的转录表达。出乎意料的是，我们发现虽然BMI-1抑制了CDKN2A/p公司16在人MSC和Tera2胚胎癌细胞中，ESFT细胞系中未观察到显著或一致的作用(补充数据图3A、B、C). 由CDKN2A型ESFT未检测到p14ARF基因座的表达水平（未显示）。BMI-1型-p21-RB通路的依赖性抑制最近被认为与胚胎神经干细胞自我更新的控制有关(35). 为了确定BMI-1是否靶向ESFT细胞中的p21而不是p16，我们还评估了CDKN1A公司表达和p21蛋白水平BMI-1型功能的获得和丧失。p21蛋白水平不受BMI-1型在所有6个ESFT细胞系中进行敲除试验，同时CDKN1A公司在A4573细胞中上调，在StaET8.2细胞中下调（数据未显示）。在任何ESFT细胞系中，pRB磷酸化均未发生变化BMI-1型击倒(补充数据图3D). 这些数据共同表明，BMI-1也没有显著调节CDKN2A型或CDKN1A公司ESFT中的表达和BMI-1未能促进ESFT增殖和/或生存并不是CDKN2A型/p16损失。
BMI-1介导的p16抑制机制已被证明涉及直接结合CDKN2A型启动子和依赖于功能性视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）的存在(36). 当在标准培养条件下生长时，ESFT细胞显示出高磷酸化（非活性）pRB，而血清提取导致pRB磷酸化降低，同时伴随着pRB总表达的降低(补充数据图3E). 为了确定BMI-1敲除是否能够在pRB相对更活跃的条件下影响ESFT生长的变化，我们在无血清条件下重复了细胞生长分析。与我们早期的研究结果一致，我们观察到BMI-1敲除对CDKN2A型表达水平、细胞增殖或细胞死亡(和数据未显示）。
BMI-1促进尤因肿瘤细胞的非锚定生长和致瘤性
虽然BMI-1的丢失并没有改变ESFT的增殖或死亡，但我们观察到，敲除显著改变了A4573细胞的形态学特征在体外虽然这些细胞通常以三维集群的形式生长BMI-1型可重复地导致转化为粘附细胞单层生长(). 因此，我们推断BMI-1型可能有助于凤尾鱼独立群体的形成。评估ESFT细胞的非锚定生长在体外受到更改的影响BMI-1型我们对转基因细胞进行软琼脂分析，以表达BMI-1水平的改变。如图所示，敲低BMI-1抑制了集落的形成()而BMI-1的过度表达导致宏观菌落的形成更快，宏观菌落数量增加(). 通过使用第二个shRNA序列证明等效效应，证实了BMI-1敲除效应的特异性(补充数据图4).
BMI-1促进独立于ESFT细胞的锚定A.）A4573细胞在标准培养条件下生长的相位对比图。siRNA-介导的击倒BMI-1型（siBMI1）使A4573细胞变平，而脂质体处理和对照转染（siNS）细胞继续以三维簇的形式生长。
B.）BMI-1（shBMI1B）的稳定敲除损害软琼脂中ESFT细胞的集落形成。图像显示的是对照细胞（shNS）培养基耗尽当天各自3个细胞系的宏观菌落。每口井代表每种情况下的6口重复井。第二个BMI-1靶向shRNA构建也获得了类似的结果（参见补充数据图4).
与对照、空载体转导细胞（pBp-V）相比，转导过表达BMI-1（pBp-BMI1）的ESFT细胞宏观集落形成时间缩短，软琼脂中的集落数增加。图像显示的是pBp-BMI1培养基分别耗尽3个细胞系的当天的宏观菌落。每口井代表每种情况下的6口重复井。
确定BMI-1是否促进ESFT菌落形成在体外与…相关体内致瘤性，我们评估了NOD-SCID小鼠异种移植瘤的形成。如图所示，TC71肿瘤细胞的植入率与BMI-1表达水平直接相关(). shBMI1细胞发生可测量肿瘤的中位时间为16天，而shNS细胞仅为13天（p<0.05）。相反，BMI-1过表达细胞在10.5天内形成肿瘤，而空载体转导细胞在15天内形成瘤（p=0.005）。同样，虽然A4573 shNS对照细胞形成肿瘤的中位时间为15天，但5只shBMI1受体小鼠中只有1只发生肿瘤，直到植入后37天才出现（数据未显示）。为了证实异种移植物不是由逃脱基因改造的细胞形成的BMI-1型在切除的肿瘤中得到证实().
BMI-1促进ESFT致瘤性体内A.）注射表达BMI-1（shBMI1）水平降低的TC71细胞的NOD-SCID小鼠移植延迟，移植速度减慢体内与注射对照（shNS）转基因细胞的小鼠相比，其生长情况（双尾配对t检验p<0.001）。
与空载体（pBp-V）转导细胞相比，注射过表达BMI-1（pBp-Bmi1）的TC71细胞的NOD-SCID小鼠的肿瘤细胞植入时间缩短，肿瘤生长增强。（双尾配对t检验p=0.01）。
C.）从肿瘤异种移植物收获的RNA的Q-RT-PCR分析证实了BMI-1型.
BMI-1敲除对发育和细胞粘附途径产生显著影响
已确定BMI-1在缺乏CDKN2A型我们启动了研究，以确定BMI-1作用的新效应器。为了实现这一点，我们在急性敲除BMI-1后对A4573细胞进行了表达谱分析，发现近900个已知基因受到显著影响（p<0.01），其中245个基因至少改变了2倍(补充表1A)（GEO加入待定）。对这些BMI-1应答基因的基因本体命名进行评估后发现，有几个通路明显过度表达，特别是涉及细胞发育以及粘附和侵袭的通路(). 此外，虽然这些过度表达的途径中的许多基因是由BMI-1型击倒（例如。切口1、WNT5A、TIMP2、TIMP3)，其他则下调（例如。COL5A2、COL1A2、ICAM2)证明尽管BMI-1被认为是一种转录阻遏物，但抑制其表达并不完全导致基因诱导和间接地由BMI-1调控，无论是上调还是下调，都可能促进其作为癌基因的功能。
表1
BMI-1敲除对A4573 ESFT细胞基因本体生物学过程的影响
| # | GO生物过程 | Douglas等人（p值） | 与Wiederschain等人的重叠。 |
|---|
| 1 | 发育：一般神经发生 | 3.2E-07日 | * |
| 2 | 蛋白质水解：结缔组织降解 | 9.9E-05年 | * |
| 三 | 细胞粘附：细胞-基质相互作用 | 1.0E-04版 | * |
| 4 | 生殖：孕酮信号 | 2.5E-04型 | 纳秒 |
| 5 | 细胞粘附：淀粉样蛋白 | 2.6E-04页 | * |
| 6 | 信号转导：WNT信号 | 4.2E-04号 | 纳秒 |
| 7 | 细胞骨架：细胞骨架重排的调控 | 5.5E-04号机组 | 纳秒 |
| 8 | 蛋白质水解：ECM重塑 | 2.3电子03 | * |
| 9 | 发育：骨骼肌发育 | 2.3电子03 | * |
| 10 | 细胞粘附：整合素介导的细胞基质粘附 | 2.6E-03型 | 纳秒 |
| 11 | 信号转导：神经肽信号通路 | 3.1E-03段 | 纳秒 |
| 12 | 信号转导：NOTCH信号 | 第4.5页至第03页 | * |
为了确定最有可能介导致瘤性的下游基因，我们将我们的数据与之前发表的关于BMI-1型DAOY髓母细胞瘤细胞的敲除(19). 本研究的原始数据来自NCBI GEO数据库（序列号{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE7578”，“term_id”：“7578”}}GSE7578标准)并使用与ESFT数据分析相同的方法进行处理（如方法所述）。两个独立基因列表的比较表明，在A4573和DAOY细胞中，101个基因的表达普遍受到BMI-1敲除的显著影响(补充表1B). 重要的是，虽然A4573细胞表达p16，但DAOY为p16空，进一步支持将这些BMI-1靶点指定为p16非依赖性(37). 此外，在shRNA转导和抗生素选择后对DAOY细胞进行了研究，而在急性siRNA介导的敲除后对A4573细胞进行了分析。因此，对基因表达的共同影响不能归因于实验设计的结果。相反，这101个基因可能代表真正的BMI-1靶点。还观察到两个模型系统之间过度代表的生物过程存在高度重叠，具有相同的发育和细胞粘附基因(). 为了确保基因集之间的重叠不是偶然的结果，我们计算了在超几何分布下获得观察到的重叠数的概率，并确认重叠程度具有高度统计意义（p<0.001）。
鉴于细胞粘附相关基因的显著过度表达，我们评估了BMI-1调节对A4573细胞粘附的影响在体外如图所示，在这些细胞中，BMI-1过度表达促进了粘附，而BMI-1敲除则抑制了粘附(). 为了验证通过微阵列分析确定的粘附基因善意的我们对BMI-1的靶点进行Q-RT-PCR和western blot，以评估NID1号机组和VEZT公司以及它们各自的蛋白产物nidogen 1和vezatin。而在ESFT细胞系中，BMI-1的敲除持续且可重复地改变了这两个基因的表达()只有nidogen 1的表达在蛋白表达水平上发生改变(). Nidogen 1是一种细胞粘附蛋白，是基底膜的组成部分(38). 为了确定巢蛋白1水平是否影响ESFT细胞粘附，我们研究了NID1号机组击倒。如图所示(),NID1号机组敲除加速了ESFT细胞粘附，表明抑制nidogen 1可能在BMI-1介导的粘附和致瘤性中起重要作用。现在需要进行更广泛的研究来测试这种可能性。
BMI-1加速ESFT细胞粘附在体外A.）将A4573细胞镀在96孔板中，并监测其粘附情况。如图所示，与对照细胞（shNS）相比，BMI-1稳定敲除的细胞（shBMI1）的粘附性降低（上面板），而与空载体细胞（pBp-V）相比，过度表达BMI-1的细胞（pB-BMI1。数据显示，在重复实验的至少7个重复孔中，粘附细胞以30分钟的间隔吸收结晶紫的平均吸光度。
定量RT-PCR验证了通过微阵列分析确定的两个细胞粘附基因确实对BMI-1有反应。请注意，尽管这两个基因的基本水平不同BMI-1型导致显著上调NID1号机组和下调VEZT公司在所有三种ESFT细胞系中。
C）Western blot证实BMI-1敲除（siBMI1A，siBMI1B）后A4573细胞中nidogen 1蛋白上调，BMI-1过度表达（pBp-BMI1）时下调。
D.）用siNID1或siNS对照寡核苷酸转染A4573细胞，并在48小时后通过定量RT-PCR确认敲除（左面板）。将转染细胞置于96孔板中，并按（A）所述测量粘附力。如图所示NID1号机组加速粘附。
讨论
我们发现，ESFT细胞高度表达BMI-1，并促进凤尾鱼的非依赖性生长和体内致瘤性。重要的是，我们的研究表明，BMI-1的这些致瘤特性是独立于CDKN2A型抑制表明存在BMI-1致癌活性的新机制。事实上，与正常间充质干细胞相比，改变BMI-1的表达水平对CDKN2A型或p16在ESFT中的表达。虽然这可能是在体外培养时，非功能性视网膜母细胞瘤家族蛋白也可能阻止BMI-1介导的CDKN2A型在这些细胞中(36). 尽管以前的报告显示pRB在ESFT中很少发生突变(25,39)最近的研究表明pRB功能可能被EWS-FLI1本身在功能上失活(40). 现在需要进一步研究以确定pRB失活是否有助于ESFT中BMI-1与p16调节的分离。
尽管ESFT的组织发生仍然是一个谜，但最近的研究表明体干细胞是起源细胞（综述于(41)). 鉴于大多数体干细胞表达高水平的BMI-1，并且在分化过程中表达减少(42)，我们在ESFT细胞中观察到的高水平BMI-1表达可能是其细胞起源的固有特征。另外，EWS-FLI1融合癌基因的表达可能能够在某些细胞类型中诱导BMI-1，正如最近在NIH-3T3细胞中所显示的那样(43). 现在需要适合细胞类型和分化状态的实验模型来测试ESFT启动过程中存在的这些情况。EWS-FLI1介导的原代成纤维细胞转化需要p16-RB和/或p53通路失活(44,45). 我们推测BMI-1介导的抑制CDKN2A型可能导致原发性ESFT细胞对EWS-FLI1产生细胞耐受性，这种肿瘤抑制途径的表观遗传失活可以解释原发性ESFT中次级基因突变发生率相对较低的原因(三). 为了支持这一点，我们发现BMI-1型一般来说，原发性肿瘤中的水平高于ESFT细胞系()提示p16和/或p53的突变在细胞系中更常见(25,46)可能至少部分补偿BMI-1表达。以前有文献证明，肺肿瘤中p16缺失与低BMI-1表达相关(47). 我们现在正在测试BMI-1的表达与原发性ESFT中p16和/或p53状态之间是否存在关系，以及高表达的肿瘤之间的临床表现或结果是否存在差异与。低水平的BMI-1。
我们已经证明，改变BMI-1型表达影响p16阴性和p16阳性细胞形成凤尾鱼非依赖性集落的能力在体外和肿瘤体内试验。为了证实我们的发现，最近发表的几份报告表明，与其他致癌病变（如突变的表皮生长因子受体（EGFR）或H-RAS）相结合，BMI-1可以转化这两种肿瘤CDKN2A型野生型和CDKN2A型空单元格(22,23). 此外，p16缺失的DAOY髓母细胞瘤细胞中BMI-1的敲除显著阻碍肿瘤的形成体内(19,37). 因此，尽管BMI-1的初步研究暗示了p16的抑制墨水4a/第14页自动射频–编码CDKN2A型基因座是致癌作用的主要机制(11,12)，我们实验室和其他实验室的最新数据证明了p16非依赖性机制的关键作用。
为了确定BMI-1潜在的新下游靶点，我们对ESFT细胞进行了以下基因表达谱分析BMI-1型敲除BMI-1应答基因并将其与受类似影响的基因进行比较BMI-1型人髓母细胞瘤细胞的敲除(19). 尽管在两种肿瘤类型中，BMI-1共同调节了一个重要的基因亚群，但其他基因仅在其中一种模型系统中发生了独特的改变。这意味着，虽然某些生物途径在不同的肿瘤类型之间是共享的，但在不同细胞来源的肿瘤中，可能至少有一些BMI-1下游效应器不同。然而，我们的研究结果表明，存在着重大的共同点。特别是ESFT和髓母细胞瘤细胞之间的直接比较(19)揭示了细胞粘附和细胞外重塑过程的改变在这两种肿瘤类型中高度过度表达和常见。在目前的研究中，我们已经证实，在ESFT细胞中，BMI-1抑制基底膜蛋白巢蛋白1的表达。Nidogen 1在细胞外基质中的层粘连蛋白、胶原蛋白和蛋白多糖之间起连接作用，并与细胞表面整合素结合(38). 有趣的是，最近有报道称NID1号机组在结肠癌中经常沉默，提示nidogen 1可能作为肿瘤抑制基因发挥作用，防止侵袭和转移(48). 为了支持这种可能性，我们发现NID1号机组促进ESFT细胞的粘附在体外，概括了BMI-1过度表达的影响。因此，我们假设BMI-1敲除通过调节巢蛋白1和/或其他粘附相关蛋白对细胞粘附的影响可能是延迟体内我们在BMI-1水平降低的ESFT细胞中观察到的肿瘤植入。与这一假设相一致，延迟植入和改变粘附途径也被证明是体重指数-1–小鼠胶质瘤细胞缺陷(22). 因此，累积的证据表明，黏附分子（如nidogen 1）的调节可能与ESFT中BMI-1的致癌功能以及其他肿瘤类型有关。
最后，多梳基因，包括BMI-1，在抑制分化和控制正常发展中发挥中心作用(5). 我们的研究发现，发育途径受到以下因素的显著影响BMI-1型ESFT细胞的敲除表明BMI-1的胚胎功能在这些未分化的肿瘤细胞中被重新描述。特别值得注意的是，WNT和NOTCH途径基因都受到BMI-1敲除的高度影响，因为这两种发育途径以前都与ESFT生长和致瘤性有关(49,50). 有趣的是，我们的数据还表明，在受影响的发育过程中，BMI-1缺失对参与神经发育的基因有最深远的影响，BMI-1敲除导致神经标记物表达增加(和补充表1). 这些发现证实了最近关于体重指数-1小鼠胶质瘤表型和神经分化能力的丧失(22). 围绕ESFT的众多临床谜团之一是观察到它们从高度未分化的肿瘤到具有明显神经特征的肿瘤。很容易推测，特定肿瘤的表型是（a）由最初获得EWS-ETS易位的母细胞中的BMI-1表达水平预先决定的，或（b）肿瘤微环境及其对BMI-1的下游影响的结果。需要进行更广泛的研究来评估这些假设。
总之，我们已经证明BMI-1型在ESFT中作为癌基因发挥作用，并促进肿瘤发生CDKN2A型-独立方式，影响参与细胞粘附、分化和发育的途径。鉴于其在调节正常干细胞多个发育过程中的核心作用，我们预计没有任何单个基因会对BMI-1的致癌作用唯一负责。然而，我们的研究结果支持这样一个假设，即黏附途径的调节对BMI-1介导的肿瘤促进至关重要。未来旨在了解这种关系的研究可能会为治疗干预提供有吸引力的新靶点，这可能是多种人类癌症常见的解除调控和过度表达BMI-1的治疗干预。
致谢
作者感谢Heinrich Kovar、Darwin Prockop、Carolyn Lutzko、Gerard Evan和Robert Ilaria提供的细胞和试剂。我们还感谢Triche&Lawlor实验室的成员进行了有益的讨论，感谢Betty Schaub和基因组学、动物、FACS和载体核心的成员提供了技术援助。肿瘤样本由CHLA病理科和俄亥俄州哥伦布市儿童肿瘤组织生物资源库提供。我们非常感谢这些设施的工作人员所做的努力。
这项工作的部分资金来自V基金会和Margaret E.Early Medical research Trust（ERL）、NIH grants U01 CA88199和U01 CA115757（TJT）的研究拨款。DD和JHH由加利福尼亚再生医学研究所培训拨款（CHLA T2-00005，USC T1-00004）支持，JvD由NIH培训拨款T32 CA 09659支持。感谢我的兄弟乔伊、癌症防治和TJ Martell基金会的支持。
工具书类
1Kovar H.背景很重要：尤文肉瘤中的母鸡或鸡蛋问题。塞明癌症生物学。2005;15:189–96.[公共医学][谷歌学者] 2Hu-Lieskovan S、Heidel JD、Bartlett DW、Davis ME、Triche TJ。通过靶向非病毒传递小干扰RNA抑制转移性尤因肉瘤小鼠模型中的肿瘤生长，从而对EWS-FLI1进行序列特异性敲除。癌症研究。2005;65:8984–92.[公共医学][谷歌学者] 3黄海阳，伊利PB，赵Z，等。具有p53突变或p16/p14ARF纯合缺失的尤文肉瘤：与化疗反应不良相关的高致死性亚群。临床肿瘤学杂志。2005;23:548–58.[公共医学][谷歌学者] 4Tolhuis B、Muijrers I、de Wit E等。黑腹果蝇PRC1和PRC2多梳染色质结合的全基因组分析。自然遗传学。2006;38:694–9.[公共医学][谷歌学者] 5Lee TI、Jenner RG、Boyer LA等。Polycomb对人类胚胎干细胞发育调节因子的控制。单元格。2006;125:301–13. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Bracken AP、Dietrich N、Pasini D、Hansen KH、Helin K。Polycomb靶基因的全基因组定位揭示了它们在细胞命运转变中的作用。基因发育。2006;20:1123–36. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Valk-Lingbeek ME、Bruggeman SW、van Lohuizen M.干细胞与癌症；多梳连接。单元格。2004年；118:409–18.[公共医学][谷歌学者] 8Molofsky AV，Pardal R，Morrison SJ。多种机制调节干细胞自我更新。当前Opin细胞生物学。2004年；16:700–7.[公共医学][谷歌学者] 9Gil J，Bernard D，Peters G.多梳组蛋白在干细胞自我更新和癌症中的作用。DNA细胞生物学。2005;24:117–25.[公共医学][谷歌学者] 10Haupt Y，Alexander WS，Barri G，Klinken SP，Adams JM。E mu-myc转基因小鼠中通过逆转录病毒加速淋巴腺病牵涉到的新锌指基因作为myc合作者。单元格。1991;65：753–63。[公共医学][谷歌学者] 11Jacobs JJ、Kieboom K、Marino S、DePinho RA、van Lohuizen M。癌基因和多梳组基因bmi-1通过ink4a位点调节细胞增殖和衰老。自然。1999;397:164–8.[公共医学][谷歌学者] 12Jacobs JJ、Scheijen B、Voncken JW、Kieboom K、Berns A、van Lohuizen M.Bmi-1通过INK4a/ARF抑制c-Myc诱导的凋亡，在肿瘤发生中与c-Myc合作。基因发育。1999;13:2678–90. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Smith KS、Chanda SK、Lingbeek M等。INK4A-ARF的Bmi-1调节是E2a-Pbx1转化造血祖细胞的下游需求。分子细胞。2003;12:393–400.[公共医学][谷歌学者] 14Lessard J，Sauvageau G.Bmi-1确定正常和白血病干细胞的增殖能力。自然。2003;423:255–60.[公共医学][谷歌学者] 15Song LB，Zeng MS，Liao WT，et al.Bmi-1是一种新的鼻咽癌进展的分子标记物，可使原代人鼻咽上皮细胞永垂不朽。癌症研究。2006;66:6225–32.[公共医学][谷歌学者] 16Nowak K、Kerl K、Fehr D等。BMI1是E2F-1的靶基因，在原发性神经母细胞瘤中强烈表达。核酸研究。2006;34:1745–54. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Cui H，Hu B，Li T，等。Bmi-1对神经母细胞瘤细胞的致瘤性至关重要。《美国病理学杂志》。2007;170:1370–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Leung C、Lingbeek M、Shakhova O等。Bmi1对小脑发育至关重要，在人类髓母细胞瘤中过度表达。自然。2004年；428:337–41.[公共医学][谷歌学者] 19Wiederschain D，Chen L，Johnson B等。多梳同源物Bmi-1和Mel-18对髓母细胞瘤发病机制的贡献。分子细胞生物学。2007;27:4968–79. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Warner JK、Wang JC、Takenaka K等。正常人类造血细胞白血病转化中协同遗传事件的直接证据。白血病。2005;19:1794–805.[公共医学][谷歌学者] 21Liu S，Dontu G，Mantle ID，等。刺猬信号和Bmi-1调节正常和恶性人类乳腺干细胞的自我更新。癌症研究。2006;66:6063–71. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Bruggeman SW、Hulsman D、Tanger E等。Bmi1在胶质瘤小鼠模型中以ink4a/arf非依赖性方式控制肿瘤的发展。癌细胞。2007;12:328–41.[公共医学][谷歌学者] 23Datta S、Hoenerhoff MJ、Bommi P等。Bmi-1与H-Ras合作，通过多种生长调节途径的失调转化人类乳腺上皮细胞。癌症研究。2007;67:10286–95. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24郭伟杰，曾明生，亚达夫A，等。Mel-18通过抑制乳腺癌细胞中Bmi-1的表达和下调Akt活性发挥抑癌作用。癌症研究。2007;67:5083–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Kovar H、Jug G、Aryee DN等。在参与RB依赖性细胞周期调节级联的基因中，p16抑癌基因在Ewing肿瘤家族中经常丢失。致癌物。1997;15:2225–32.[公共医学][谷歌学者] 26Lawlor ER，Scheel C，Irving J，Sorensen PH.锚定非依赖性多细胞球体作为尤文肿瘤生长信号的体外模型。致癌物。2002;21：307–18。[公共医学][谷歌学者] 27Baek JH、Mahon PC、Oh J等。OS-9与低氧诱导因子1alpha和脯氨酸羟化酶相互作用，促进HIF-1α的氧依赖性降解。分子细胞。2005;17:503–12.[公共医学][谷歌学者] 28van Engeland M，Nieland LJ，Ramaekers FC，Schutte B，Reutelingsperger CP。Annexin V亲和力测定：基于磷脂酰丝氨酸暴露的细胞凋亡检测系统综述。细胞测定。1998年；31:1–9.[公共医学][谷歌学者] 29Weeraratna AT，Jiang Y，Hostetter G等。Wnt5a信号传导直接影响转移性黑色素瘤的细胞运动和侵袭。癌细胞。2002;1:279–88.[公共医学][谷歌学者] 30Labuhn M，Jones G，Speel EJ，等。定量实时PCR在105例人类原发性胶质瘤中未显示p14（ARF）的选择性靶向性，但同时显示p16（INK4A）和p14（ARF）的失活。致癌物。2001;20:1103–9.[公共医学][谷歌学者] 31Berggren P、Kumar R、Sakano S等。实时定量PCR检测膀胱癌CDKN2A（p16（INK4a））/ARF（p14（ARF））基因纯合缺失。临床癌症研究。2003;9:235–42.[公共医学][谷歌学者] 32Smyth GK公司。用于评估微阵列实验中差异表达的线性模型和经验贝叶斯方法。统计应用基因分子生物学。2004年；三第3条[公共医学][谷歌学者] 33Guo WJ，Datta S，Band V，Dimri GP.Mel-18，一种多梳组蛋白，通过转录抑制Bmi-1和c-Myc癌蛋白调节细胞增殖和衰老。分子生物学细胞。2007;18:536–46. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Liu L，Andrews LG，Tollefsbol TO。人类多梳组蛋白BMI1的缺失促进肿瘤特异性细胞死亡。致癌物。2006;25:4370–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Fasano CA、Dimos JT、Ivanova NB、Lowry N、Lemischka IR、Temple S.shRNA敲除Bmi-1揭示了p21-Rb通路在NSC发育过程中自我更新中的关键作用。细胞干细胞。2007;1[公共医学][谷歌学者] 36Kotake Y、Cao R、Viatour P、Sage J、Zhang Y、Xiong Y。H3K27三甲基化和Polycomb阻遏复合物结合p16INK4alpha抑癌基因并使其沉默需要pRB家族蛋白。基因发育。2007;21:49–54. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Fruhwald MC、O'Dorisio MS、Dai Z等。先前未识别的靶基因的异常启动子甲基化是髓母细胞瘤中常见的异常现象——对肿瘤生物学和潜在临床实用性的影响。致癌物。2001;20:5033–42.[公共医学][谷歌学者] 38Kohling R、Nischt R、Vasudevan A等。Nidogen和巢蛋白相关基底膜蛋白和神经元可塑性。神经变性疾病。2006;三:56–61.[公共医学][谷歌学者] 39Maitra A，Roberts H，Weinberg AG，Geradts J.尤因家族肿瘤中抑癌蛋白的异常表达。病理学实验室医学档案。2001;125:1207–12.[公共医学][谷歌学者] 40Hu HM、Zielinska-Kwiatkowska A、Munro K等。EWS/FLI1抑制尤因肉瘤细胞中视网膜母细胞瘤蛋白功能和衰老。矫形研究杂志。2008[公共医学][谷歌学者] 41梅尔泽PS.尤因肉瘤是干细胞肿瘤吗？细胞干细胞。2007;1:13–5.[公共医学][谷歌学者] 42Hosen N、Yamane T、Muijtjens M、Pham K、Clarke MF、Weissman IL.Bmi-1绿色荧光蛋白敲除小鼠揭示了正常和白血病造血细胞中Bmi-1表达的动态调节。干细胞。2007;25:1635–44.[公共医学][谷歌学者] 43Zwerner JP、Joo J、Warner KL等。EWS/FLI1致癌转录因子解除GLI1的调控。致癌物。2007[公共医学][谷歌学者] 44Deneen B，Denny CT。p16通路的缺失可稳定EWS/FLI1的表达，并补充EWS/FLI介导的转化。致癌物。2001;20:6731–41.[公共医学][谷歌学者] 45Lessnick SL，Dachwag CS，Golub TR。尤因肉瘤癌蛋白EWS/FLI在原代人类成纤维细胞中诱导p53依赖性生长停滞。癌细胞。2002;1:393–401.[公共医学][谷歌学者] 46Kovar H，Auinger A，Jug G等。尤文肿瘤中罕见p53突变的窄谱和MDM2扩增缺失。致癌物。1993;8:2683–90.[公共医学][谷歌学者] 47Vonlanthen S、Heighway J、Altermatt HJ等。bmi-1癌蛋白在非小细胞肺癌中的差异表达与INK4A-ARF基因座的表达相关。英国癌症杂志。2001;84：1372–6。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 48Ulazzi L、Sabboni S、Miotto E等。Nidogen 1和2基因启动子在人类胃肠道癌中异常甲基化。摩尔癌症。2007;6:17. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Baliko F、Bright T、Poon R、Cohen B、Egan SE、Alman BA。抑制notch信号诱导尤文肉瘤的神经分化。《美国病理学杂志》。2007;170:1686–94. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50Uren A、Wolf V、Sun YF、Azari A、Rubin JS、Toretsky JA。尤因肉瘤中的Wnt/Frizzled信号。小儿血癌。2004年；43:243–9.[公共医学][谷歌学者] 
