CTLA-4阻断增加IFNγ产生CD4⁺国际博协^你好细胞改变癌症患者中效应T细胞与调节T细胞的比例

外周血CD4 T细胞的FOXP3表达不受CTLA-4阻断的持续影响。

由于ICOS已被证明由调节性T细胞和活化的CD4效应细胞表达，我们检测了ICOS^你好用于表达转录因子FOXP3的细胞，FOXP3与调节性T细胞功能密切相关(25). 如所示图2A类、FOXP3⁺正常健康献血者CD4 T细胞总数的≈5%(图2A类). 正常健康献血者血液中约2%的CD4 T细胞表达高水平的ICOS，其中约23%表达FOXP3(图2A类). 仅≈CD4的4%⁺国际博协^低的正常健康供体的T细胞表达FOXP3。在未经治疗的癌症患者的血液中，FOXP3的总频率⁺CD4总T细胞中的细胞数量不尽相同，但往往更高（21±17%，n个=10），并在两个ICOS之间分配^你好和ICOS^低的隔间(图2A类).

类似地，CD4⁺国际博协^你好抗CTLA-4抗体治疗患者的T细胞同时含有FOXP3⁺和FOXP3⁻亚群。患者1的数据如所示图2B类.FOXP3在CD4中的表达⁺国际博协^你好患者1的T细胞从治疗前的20%增加到治疗后第3周的33%，但在第7周下降到12%。因此，正常健康献血者、未经治疗的膀胱癌患者和抗CTLA-4治疗的患者的血液中含有大量表达高水平ICOS而非FOXP3的CD4 T细胞，因此不太可能成为调节性T细胞。

FOXP3频率的变化⁺CD4总T细胞中的细胞反映了ICOS中FOXP3表达的变化^你好和ICOS^低的细胞经抗CTLA-4治疗后。对于患者1，FOXP3的表达占总CD4 T细胞（CD4⁺福克斯3⁺)从治疗前的4%增加到治疗后第3周的9%，但在第7周下降到6%(图2C类). 如所示图2D类这表明，所有六名接受治疗的患者的结果表明，抗CTLA-4治疗对FOXP3表达的影响不一致。患者1、3和5在第一次给药抗体后FOXP3表达频率增加，第二次给药后降低。患者2和4在第一次注射抗体后FOXP3表达降低，并且在第二次注射抗体之后FOXP3的表达仍然较低，至少患者4（患者2在第7周没有抽血）。因此，在每剂量抗体3 mg/kg的剂量下，CTLA-4阻断并没有持续改变治疗患者外周血CD4 T细胞的FOXP3表达。

CD4细胞⁺国际博协^你好抗CTLA-4治疗患者外周血中的T细胞含有识别肿瘤抗原NY-ESO-1的IFNγ产生效应细胞。

因为我们的数据显示，CD4的大部分⁺国际博协^你好T细胞缺乏FOXP3表达，因此不太可能是调节性T细胞，我们检测了CTLA-4阻断对循环CD4和CD4功能的影响⁺国际博协^你好T细胞。对健康献血者、未经治疗的膀胱癌患者（包括患者治疗前的样本）和接受抗CTLA-4抗体治疗的患者（治疗后第3周和第7周的样本）的外周血中的CD4 T细胞进行培养在体外用抗CD3加IL-2治疗3天。所有CD4 T细胞增殖均良好(图S2). 然而，如中所示图3A类，来自抗CTLA-4治疗（治疗后）患者的CD4 T细胞产生的IFNγ大约是来自未治疗患者或健康捐赠者的T细胞的五倍(P（P）< 0.05). 抗CTLA-4治疗后CD4 T细胞产生IL-10的量没有显著变化(图3A类)，也没有注意到IL-4的产生发生变化（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图3。

CD4和CD4增加IFNγ的产生⁺国际博协^你好T细胞与CD4对肿瘤抗原NY-ESO-1的识别⁺国际博协^你好T细胞。(A类)抗CTLA-4治疗患者外周血CD4 T细胞产生的IFNγ增加。(B类)外周血CD4 T细胞中相对于CD3-εmRNA表达的IFNγ、IL-10、IL-4、IL-2和FOXP3 mRNA水平的折叠诱导。(C类)CD4增加IFNγ生成⁺国际博协^你好抗CTLA-4治疗患者外周血T细胞。(D类)RT-PCR和凝胶电泳检测肿瘤抗原NY-ESO-1 mRNA。通道1显示在阳性对照细胞系SK-Mel 37中检测到NY-ESO-1 mRNA，该细胞系NY-ESO-1高表达；通道2显示阴性对照细胞SK-Mel 23中NY-ESO-1 mRNA缺失；通道3、5和7分别显示患者1、3和5的肿瘤组织中无NY-ESO-1表达；和通道4、6和8分别显示患者2、4和6的肿瘤组织中NY-ESO-1的表达。所有样品中都存在B-actin。(E类)CD4细胞⁺国际博协^你好患者6治疗前血样和患者2、4和6治疗后血样的T细胞在识别APC时产生IFNγ，这些APC是由重叠的NY-ESO-1肿瘤抗原肽（包括整个蛋白质（所有肽））脉冲产生的，但对不含肽（无肽）的APC没有反应。

如所示图3B类，未培养CD4 T细胞分析体外从治疗后第7周开始，抗CTLA-4治疗患者的血样IFNγmRNA水平较高(P（P）<0.05）和较低水平的FOXP3 mRNA(P（P）<0.05）比未经治疗的患者的CD4 T细胞。IL-4、（数据未显示）、IL-10或IL-2 mRNA水平无明显变化(图3B类). 通过比较IFNγ和IL-10 mRNA水平推断出的平均Th1/Th2细胞因子比率从未经治疗（治疗前）膀胱癌患者血液中CD4 T细胞的≈1:1增加到经抗CTLA-4抗体治疗（治疗后）患者外周血中的CD4 T淋巴细胞的≈3:1，这表明抗CTLA-4治疗使CD4效应细胞向更像Th1的方向倾斜。细胞因子谱的这些变化与CD4 T细胞功能分化相关的转录因子水平的变化一致。T-bet水平，一种负责调节IFNγ产生和Th1谱系的转录因子(26)显著增加(P（P）<0.05），而GATA-3是一种与IL-10和其他Th2细胞因子的产生相关的转录因子(27)，未受影响(图S3).

CD4细胞⁺国际博协^你好和CD4⁺国际博协^低的T细胞，从健康献血者、未经治疗的膀胱癌患者（包括患者治疗前的样本）和接受抗CTLA-4抗体治疗的患者（治疗后第3周和第7周的样本）的外周血中未培养的CD4 T细胞中分类用抗CD3加IL-2刺激后检测细胞因子的产生在体外.CD4⁺国际博协^低的治疗患者的T细胞产生的IFNγ没有显著高于CD4⁺国际博协^低的来自未经治疗的患者或健康供体的细胞。然而，CD4⁺国际博协^你好所有接受治疗的患者的T细胞产生的IFNγ多于CD4⁺国际博协^你好来自未经治疗的患者或健康捐赠者的T细胞(图3C类) (P（P）<0.05），而IL-4（数据未显示）和IL-10的产生始终保持较低水平。这些数据表明，CTLA-4阻断的一个主要作用是CD4的诱导⁺国际博协^你好产生IFNγ的效应T细胞。

接下来，我们试图确定CD4是否⁺国际博协^你好T细胞包含一群能够识别肿瘤抗原的细胞。我们使用RT-PCR对患者肿瘤进行分型，以检测NY-ESO-1的表达，这是一种高度免疫原性的肿瘤检测抗原，已知在许多膀胱癌中表达(28). 肿瘤不表达NY-ESO-1抗原的患者外周血样本中未发现NY-ES-1-反应性T细胞（数据未显示）。然而，发现三名患者（患者2、4和6）表达NY-ESO-1(图3D类). CD4细胞⁺国际博协^你好所有三名患者治疗后血样中的T细胞对NY-ESO-1肽抗原脉冲的抗原呈递细胞（APC）产生IFNγ，重叠肽池代表NY-ESO-1的整个序列，但不代表未脉冲的APC。CD4细胞⁺国际博协^你好从两名患者（患者2和患者4）的血液中获得的T细胞仅在抗CTLA-4治疗后产生IFNγ，以应对NY-ESO-1，而第三名患者，即患者6，具有NY-ESO-1反应性CD4⁺国际博协^你好治疗前的T细胞(图3E类). 因此，在一些患者中，CD4⁺国际博协^你好在治疗前可能存在识别肿瘤抗原的效应T细胞，而在其他情况下，CTLA-4阻断允许这些细胞扩张。

肿瘤组织中CTLA-4阻断的免疫学后果：CTLA-4封闭后肿瘤组织中CD4 T细胞ICOS表达更高。

接下来，我们试图确定抗CTLA-4治疗对肿瘤组织中T细胞的影响。如所示图4A左边和居中对于具有代表性的患者，CD4的频率⁺国际博协^你好非恶性尿路上皮组织（13%）和未经治疗的癌组织（16%）的T细胞均高于外周血（比较图4A类和图1 A类和B类). 这种差异可能反映了组织或肿瘤特异性抗原对浸润效应或调节性CD4 T细胞的激活。更重要的是，CD4的频率⁺国际博协^你好与未经治疗患者的肿瘤组织相比，所有6名抗CTLA-4治疗患者的膀胱组织中的T细胞都要高得多（平均45±12%vs.15±8%）(图4 A正确和B类) (n个= 6,P（P）< 0.05). 因此，CTLA-4阻断导致CD4的系统性增加⁺国际博协^你好治疗患者组织和外周血中的T细胞。

在单独的窗口中打开

图4。

抗CTLA-4治疗对肿瘤组织的影响。(A类)抗CTLA-4治疗后肿瘤浸润性CD4 T细胞上ICOS表达增加。所示数据来自代表性样品。(左侧)未经治疗的膀胱癌患者的非恶性尿路上皮组织。(居中)未经治疗的膀胱癌患者的尿路上皮癌组织。(赖特)用抗CTLA-4抗体治疗的膀胱癌患者的尿路上皮癌组织。(B类)CD4百分比图⁺国际博协^你好来自单个组织样本（包括非恶性组织样本）的T细胞(n个=4），未经治疗的肿瘤组织(n个=10）和抗CTLA-4治疗的肿瘤组织(n个= 6). (C类)CD4百分比图⁺福克斯3⁺来自单个组织样本（包括非恶性组织样本）的T细胞(n个=4），未经治疗的肿瘤组织(n个=10）和抗CTLA-4治疗的肿瘤组织(n个= 6). (D类)CD3-ε、IFNγ、IL-10、IL-4、IL-2、T-bet、GATA-3和FOXP3 mRNA水平相对于未治疗和抗CTLA-4治疗患者的非恶性尿路上皮组织和膀胱癌组织的手术样本中GAPDH mRNA表达的倍数诱导。

CTLA-4阻断后肿瘤组织CD4 T细胞中FOXP3表达降低。

接下来，我们研究了CTLA-4阻断剂对肿瘤组织CD4 T细胞表达FOXP3的影响。在膀胱癌患者的尿路上皮癌组织中，CD4的频率⁺福克斯3⁺T细胞变化不定，但显著升高（平均67±25%，n个=10），而非恶性尿路上皮组织（平均8±5%，n个= 4) (图4C类和图S4). 然而，在所有病例中，CD4的频率都较低⁺福克斯3⁺抗CTLA-4处理组织中膀胱癌组织中的T细胞（平均7±4%，n个= 6,P（P）<0.05）与未经治疗的肿瘤组织相比(图4C类). 因此，尽管抗CTLA-4对来自外周血的CD4 T细胞中FOXP3表达的影响是可变的，但在肿瘤组织中，抗CTLA4治疗后其频率持续下降。

CTLA-4阻断后肿瘤组织中IFNγ表达增加。

我们分析了组织中相关细胞因子和转录因子的mRNA表达，以评估抗CTLA-4抗体对肿瘤组织的功能影响。如所示图4D类，抗CTLA-4治疗患者的肿瘤组织始终比未治疗患者的肿瘤组织具有更高水平的IFNγ、IL-2和T-bet，以及更低水平的FOXP3mRNA(P（P）< 0.05). IL-4、IL-10和GATA-3 mRNA水平在接受治疗或未接受治疗的患者的肿瘤组织中没有统计学意义上的改变。肿瘤内Th1与Th2细胞因子的平均比率从未经治疗的样本中的0.1增加到抗CTLA-4治疗患者的1.0。与循环外周血CD4 T细胞相比，肿瘤内Th1与Th2细胞因子比率的升高幅度更大。这些数据支持这样的观点，即抗CTLA-4治疗会导致全身循环和肿瘤中Th1效应细胞的增加，并且在肿瘤内的影响更显著，正如预期的那样，在肿瘤排斥反应期间免疫参与的主要部位。

流式细胞术和细胞培养。

根据标准程序对细胞进行染色并获取，如SI材料和方法.

实时PCR。

组织和CD4 T细胞的总RNA样本按照支持信息（SI）.

RT-PCR分析检测NY-ESO-1 mRNA。

使用来自肿瘤组织的4μg mRNA进行逆转录，使用200 ng cDNA和NY-ESO-1基因特异性寡核苷酸引物进行PCR，如前所述(28).

ELISPOT检测T细胞对NY-ESO-1肿瘤抗原的反应。

CD4细胞⁺国际博协^你好如上所述，从未培养的CD4 T细胞中分离T细胞。ELISPOT测定按先前所述进行(30)，中列出了一些小修改SI文本.

我们感谢Jim Allison博士、Lloyd Old、Patrick Hwu、Laszlo Radvanyi、Eric Wieder和Yong-Jun Liu的支持和帮助。这项工作得到了得克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心的物理学家-科学家计划奖和机构研究拨款、美国临床肿瘤学学会的职业发展奖、Gillson Longenbaugh基金会奖、Carl C.Anderson，Sr.&Marie Jo Anderson慈善基金会奖的部分支持，以及癌症研究所颁发的临床研究员奖（发给P.S.）。Bristol-Myers Squibb赞助并资助了膀胱癌患者新佐剂依匹单抗的临床试验。