乳腺微环境改变神经干细胞的分化储备

移植时嵌合性乳房突起的形成。

文化WAP-Cre公司/罗莎26RNSC和野生型FVB/N MEC以1:1的比例（50000个NSC和50000个MEC）结合，并直接接种到3周龄Nu/Nu雌性小鼠的去上皮乳腺脂肪垫中。注射后，乳腺导管发育持续了6-8周，此时允许一些宿主完成足月妊娠（需要激活和重组报告转基因）。1周后将幼犬取出，允许腺体完全退化。随后，取下再生乳腺并用X-gal将其作为整体进行染色，以检测LacZ活性。为了激活报告基因，报告基因和WAP-Cre公司基因必须在同一细胞中Cre–lox公司重组。只有NSC携带这两种转基因，因此只有NSC的后代可能是LacZ⁺.怀孕后Cre公司重组，来自罗莎26启动子是组成性的，可以作为一个线性标记来确定NSC子代的位置和细胞命运。

蓝色LacZ的出现⁺再生乳腺内的细胞表明在乳腺外生长中存在神经衍生的后代。来自新鲜分离的胚胎神经干细胞的培养细胞与MEC混合后，在75%的注射脂肪垫中产生乳腺外生长（15/20）；其中93.3%为LacZ⁺(14/15). 从成人大脑中分离和培养的神经干细胞与乳腺细胞混合后，在70%的接种垫（7/10）中产生了乳腺生长，所有这些垫（100%）都含有LacZ⁺上皮(表1). 这些结果表明，NSCs能够与新形成的乳腺上皮生长锥中的MECs相互作用，与乳腺细胞一起增殖，并在再生乳腺上皮树的形成过程中贡献MEC子代。在大多数情况下，LacZ⁺神经细胞子代分布于整个上皮外生长(图2A类)表明神经细胞和乳腺细胞之间的相互作用发生在乳腺生长锥形成的早期，并在整个乳腺导管系统的形成过程中持续进行。来自原始嵌合体的二次移植也产生了副生长，其中含有LacZ⁺MEC分布于再生乳腺导管（14/20）(表1).

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图2。

NSC衍生的细胞以嵌合生长方式存在。(A类)泌乳后16天宿主小鼠的X-gal染色全乳脂肪垫显示LacZ⁺细胞在整个嵌合生长过程中都有表现。(B类)二次移植中嵌合体的再生表明LacZ⁺细胞能够复制并促进再生乳房的所有部分生长。插图是整个坐骑的组织切片，显示只有上皮细胞是LacZ⁺英寸(A类)和(B类). (C类)中腺体的组织切片A类演示LacZ的分布⁺上皮细胞。注意周围的基质仍然是LacZ⁻. (天)中腺体的组织切片B类平滑肌肌动蛋白（棕色）反应，肌上皮标记物。箭头表示LacZ⁺肌上皮细胞。放大倍数：20×英寸A类和B类插图中为100×。（比例尺：C类，15微米；天，10微米）

NSC子代显示乳房特征。

LacZ公司⁺阳性染色组中的细胞（即NSC衍生细胞）定位在一起，并且沿着乳腺导管和侧支在非染色上皮细胞之间间歇性混合(图2 A类和B类). 这种模式表明神经细胞在导管形态发生过程中与MEC协同增殖，其方式与完整WAP相似-Cre公司/罗莎26R乳腺发育。NSC衍生细胞（LacZ⁺)表现为管腔上皮细胞(图2C类)导管管腔衬里和位于基底的肌上皮细胞(图2C类，箭头）。后者通过β-半乳糖苷酶和平滑肌肌动蛋白的共表达得到证实(图2 天和​和3三A类). 从五个独立嵌合体突起获得的连续切片中，我们估计嵌合体中约5-7%的乳腺细胞LacZ染色呈阳性，表明其来源于NSC。仅WAP-Cre公司-存活于退化期的活化乳腺细胞可被鉴定为NSC后代。妊娠和哺乳期间，NSC衍生细胞分化为分泌型MEC，如β-半乳糖苷酶和乳蛋白β-酪蛋白的免疫共定位所示(图3B类)在泌乳组织中。此外，在第二代移植中存活的NSC衍生细胞后代能够分化为表达雌激素受体（ER）-α的管腔乳腺细胞(图3C类)和孕酮受体（PR）表达的MEC(图3天). 这些数据表明，NSC子代能够沿不同谱系分化为乳腺细胞，包括腔上皮细胞和肌上皮细胞。LacZ的多能性⁺NSC衍生的乳腺细胞与先前报道的妊娠识别MECs（PI-MEC）的多潜能特性相对应，这些MECs是从腮腺WAP的完整乳腺中分离出来并具有特征的-Cre公司/罗莎26R雌性小鼠。在次级生长中，PI-MEC复制并保持其多能能力。类似地，NSC衍生的LacZ⁺次级生长中的MEC能够产生ER⁺和公关⁺妊娠宿主的腔子代和肌上皮子代。

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图3。

NSC衍生后代可能表达肌上皮或管腔上皮细胞标记物。(A类)嵌合生长中平滑肌肌动蛋白（SMA，红色）和β-半乳糖苷酶（绿色）的结肠化。箭头表示同时表达SMA和β-半乳糖苷酶的肌上皮细胞。(B类)在妊娠宿主的乳腺嵌合体中同时表达酪蛋白（红色）和β-半乳糖苷酶的NSC子代。箭头表示同时表达酪蛋白和β-半乳糖苷酶的细胞。(C类和天)第二代移植切片显示β-半乳糖苷酶阳性（绿色）NSC衍生子代表达(C类)ERα（红色）和(天)PR（红色）。箭头指示共同表达β-半乳糖苷酶和感兴趣的核类固醇受体的选择细胞。（比例尺：20μm）

嵌合生长的细胞周期分析。

许多报告证实，细胞-细胞融合可以解释在各种实验模型中观察到的干细胞可塑性。因此，我们启动了几项分析，以在我们的模型中测试这种可能性。对导致注射细胞产生再生乳房的生物和形态发生事件的描述是恰当的。将细胞混合并立即接种到新鲜清除的3周龄雌性乳腺脂肪垫中。未使用佐剂或生长培养基。这些细胞沿着针道散布，在接下来的几天里，它们重组并形成一个上皮复合体，能够通过形成末端芽支持周围脂肪的生长和渗透(4). 然后，乳腺分支导管系统的形成从起始点开始呈放射状进行，直到脂肪垫被填满，或直到前进芽内发生生长衰老。这一过程通常在6-7周内完成。

在怀孕期间，腺泡和小叶形式的分泌发育发生在导管系统的分支点。还可能出现进一步的管道开发。乳腺导管和接种脂肪垫中的充分分泌发育导致产生25–40×10⁶机械工程师(5). 分泌发育期间，WAP-Cre公司大量表达，导致激活罗莎26R基因，但只有在两个转基因都存在的细胞中（在不同的染色体上）。因为LacZ⁺上皮细胞普遍存在于哺乳和退化后的整个乳腺导管外生长，似乎有理由得出这样的结论：NSC及其子代与在导管发育过程中增殖的MEC混合，随后在WAP过程中重组其报告转基因-Cre公司妊娠和哺乳期的表达。在断奶时，这些细胞中的一些存活下来并代表LacZ⁺退化腺体中的数量。

为了确定NSC和MEC在混合并注射到清除的脂肪垫后是否发生早期融合，进行了碘化丙啶染色和细胞周期分析。对分离的NSC和MEC群体的DNA含量以及由它们产生的几个独立嵌合体乳腺突起制备的单细胞悬浮液进行分析。为了进行比较，还从完整的青春期后乳腺制作了单细胞悬浮液，并进行了平行分析。图4显示了四个测试组中每一组20000个细胞的相对倍性直方图。如果NSC和MEC之间发生融合，无论是在混合后立即在试管中还是在联合注射到清除的受体脂肪垫后的任何时候，嵌合生长的细胞周期曲线将通过显示4N峰下的增加面积来反映这一点（如果两个2N细胞融合）或增加高倍性细胞的数量（如果2N细胞与4N细胞融合或两个4N细胞结合）。没有观察到这些影响。嵌合体突起的2N和4N峰显示出与天然乳腺相似的区域，强烈表明至少20000个细胞中未发生可检测到的融合，这些细胞共同代表了整个嵌合体乳腺中发生的情况。此外，在嵌合生长物中没有观察到更高倍性的细胞，这与乳腺生长物广泛增殖期间的正常DNA复制和染色体分离一致。

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图4。

通过碘化丙啶染色和流式细胞仪细胞周期分析评估单个细胞内的DNA含量。绘制细胞总荧光（FL2区域）的直方图x个-轴与上的单元数年-axis显示了来自两个起始群体（NSC和MEC）的20000个细胞中每个细胞的DNA含量，以及由完整的宿主乳腺和NSC/MEC注射的嵌合生长物制备的单细胞悬浮液。相对G₀/克₁（2N）和G₂/M（4N）峰突出，2N峰和4N峰之间的谷导致S期细胞频率较低。

LacZ中的NSC标记⁺细胞。

在功能性嵌合腺内，偶有LacZ⁺发现表达NSC标记的细胞。在管腔或基底上位置发现巢蛋白阳性细胞，并表达巢蛋白和β-半乳糖苷酶(图5A类)这表明一批神经源性细胞继续表达NSC标记。类似地，一些LacZ⁺另外一个NSC标记Sox2的细胞也呈阳性染色(图5B类). 我们发现嵌合腺内6.34%的细胞表达nestin，1.06%的乳腺细胞表达Sox2。所有Sox2⁺细胞nestin阳性。我们还在一些表达β-半乳糖苷酶的细胞中发现Oct4，一种与干细胞维持相关的转录因子(图5C类). LacZ公司⁺表达nestin或Sox2的细胞也存在于第二代移植产物中(图5天)表明LacZ扩增后NSC特异性基因持续表达⁺次级生长中的种群。在野生型乳腺中，我们发现巢蛋白在整个细胞群中的表达率为1.08%，但任何野生型细胞都不表达Sox2。

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图5。

嵌合体内的LacZ+细胞偶尔表达NSC标记。探讨退化嵌合体乳腺的横切面(A类)巢蛋白（红色，箭头）和β-半乳糖苷酶（绿色）(B类)Sox2（粉红色，箭头），或(C类)Oct4（红色，箭头）和β-半乳糖苷酶（绿色）。(天)第二代移植的交叉切片显示神经标记巢蛋白（红色，箭头）和Sox2双标记（粉红色，箭头）的持久性。所有切片均用DAPI（蓝色）染色以进行核可视化。（比例尺：A类，10微米；B–D类，20微米）

MEC准备。

在添加了10%胎牛血清、胰岛素（1.0μg/ml）和表皮生长因子（10 ng/ml）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中的塑料培养瓶中，4-7天后从原代乳腺培养物中收集MEC。在收集上皮细胞之前，通过差异胰蛋白酶化使成纤维细胞减少。

NSC隔离。

我们遵循基于选择性扩增的既定方案，从胚胎和成年小鼠大脑中分离和扩增神经干细胞。解剖后，将磨碎的组织置于培养基中，培养基支持干细胞的扩增，但不支持其他细胞的扩增。该培养基不含血清和血清替代物，只含有三种蛋白质：载脂蛋白（用于铁转运）、作为促生存信号的胰岛素和作为神经干细胞有丝分裂原的碱性成纤维细胞生长因子(2).

胎儿培养物通常大约每5天传代一次。第一次传代后（去除了大部分残留污染物），培养物由95%的NSC组成。克隆和实时谱系分析证实了它们的自我更新特性和多潜能(2,14). 成人培养物由多能干细胞和胶质限制性祖细胞组成，但它们的形态不同，并且由于它们是在克隆条件下培养的，因此很容易区分。

胎儿培养物来自E13.5小鼠胚胎皮层，而成年培养物来自2至3个月大的小鼠脑室下区。解剖后，这两种干细胞来源的培养条件相同。

从植入小鼠的乳房脂肪垫中回收神经干细胞。

植入后，允许乳腺导管生长、妊娠、哺乳和退化（≈14周）。然后解剖乳腺脂肪垫组织，并在含有FGF2（20ng/ml）的N2培养基中研制。将分离的细胞在低氧条件（5%）下在无血清DMEM/F12培养基中接种5天，该培养基具有补充有FGF2的N2（20ng/ml）。除非另有说明，否则我们所有的培养实验都使用了FGF2。培养基中还包括Notch配体Dll4的可溶性形式（R&D Systems；最终浓度，200 ng/ml）和JAK激酶抑制剂（Calbiochem；最后浓度，200 nmol），以支持NSC存活(14).

细胞和组织移植。

之前已经详细描述了用于清除3周龄宿主小鼠脂肪垫上乳腺上皮的手术技术以及随后的组织碎片或细胞悬浮液移植(15,16). 简而言之，将小鼠麻醉，并在插入移植片段或细胞悬浮液之前立即执行清除程序。用配备30号针头的Hamilton注射器将细胞悬液注入10μl体积。植入后4-6周，将植入的雌性与雄性放置在一起，以开始妊娠和分泌发育。

乳腺组织的X-Gal和免疫细胞化学染色。

如前所述，将整个腹股沟腺的整个支架固定并染色(13). 简言之，将腺体铺开在玻璃载玻片上，在多聚甲醛（4.0%）中固定1-2小时，在4°C的磷酸盐缓冲盐水中0.01%Nonidet P-40中渗透过夜，然后按照前面所述处理X-gal。为了进行组织学检查，将X-gal染色的整个支架包埋在石蜡中，在6.0μm处切片，并用Nuclear Fast Red复染。在去石蜡切片上进行免疫细胞化学。使用的主要抗体是针对总纯化的小鼠酪蛋白、平滑肌肌动蛋白、巢蛋白、Sox2、ERα、PR和β-半乳糖苷酶。当通过在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中加热切片（在微波中）3分钟，然后冷却30分钟来研究ERα和PR时，进行抗原检索。通过Alexa 488、Alexa 647和Alexa 568结合种特异性抗体（Invitrogen）进行二次检测。使用ProLong Gold防褪色试剂和DAPI（Invitrogen）覆盖玻片。使用已知的阳性和阴性组织对照物，以确定染色的特异性。使用蔡司NLO共焦显微镜采集荧光图像。

国家癌症研究所癌症研究中心的内部研究项目支持此处介绍的研究的所有方面，但神经干细胞的分离和繁殖除外。