视网膜神经节细胞树突谷氨酸能输入的空间分布

质粒和基因枪子弹的制备

表达质粒pPSD95-GFP是Morgan Sheng博士（麻省理工学院，马萨诸塞州剑桥）的一份礼物。它允许表达全长PSD95和GFP的融合蛋白，以便PSD95的C末端通过3个甘氨酸残基（在克隆过程中引入）连接到GFP的N末端（有关详细信息，请参阅Arnold和Clapham，1999年). 质粒pHcRed-N1购自Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）。使用Helios基因枪系统（BioRad，Hercules，CA）通过粒子介导的基因转移转染视网膜神经节细胞。DNA与金微载体（平均直径1.6μm）的比率为1.5μg质粒/1 mg金。通过在90-120磅/平方英寸的压力下用加压氦气将金子弹推进组织，转染神经节细胞。一般来说，每厘米标记30-100个神经节细胞（和移位的无长突细胞）²视网膜损伤。

孵育视网膜神经节细胞的膜片钳记录

为了测试孵化视网膜的完整性，从一些组织进行了全细胞斑贴灯记录。记录技术是传统的(小泉等人，2004年;小泉等人，2007年). 当用移液管溶液（mM）填充时，直径为1-2μm的贴片移液管的电阻约为10-15MΩ：87 K葡萄糖酸盐、7 KCl、5 HEPES、0.4 CaCl2、0.4 MgCl2、5 EGTA和2 ATP-Na2（用KOH将pH调节至7.4）。使用DigiData 1322A接口类型和pCLAMP8软件（Axon Instruments）在10 kHz下对信号进行采样。液结电位测量为17 mV（Vm=Vp-17 mV），并在记录后进行校正。随后的分析是通过Igor Pro（WaveMetrics，俄勒冈州奥斯韦戈湖，美国）中的定制程序进行的。使用Visionworks（Vision Research Graphics，新罕布什尔州达勒姆）在校准的CRT显示器（日本索尼公司Dell-P780）上生成光刺激，并通过位于记录室下方的镜子向上反射。显微镜物镜（Olympus Optical，东京，日本；20x，N.A.0.4）将刺激集中在视网膜上。

神经节细胞类型的鉴定

在这项研究中，我们重点研究了一系列六种类型的神经节细胞。它们在形态和生理行为上跨越了极端。独立实验室对它们的生理学及其形态伴随物进行的许多研究取得了一致意见(Amthor等人，1989年a;Amthor等人，1989年b;他和马斯兰，1998年;Roska和Werblin，2001年;Rockhill等人，2002年;Roska等人，2006年).

这个局部边缘检测器（LED）在兔子的神经节细胞中，感受野最小，直径通常<150μm。细胞对漫射光或覆盖整个感受野的模式刺激几乎没有反应。它们对限制在感受野中心的对比度反应最好，而不穿越感受野的边界。为了保持其较小的感受野，LED是兔视网膜中最小的神经节细胞，具有直径约150-200μm的树突树突(Rockhill等人，2002年). 细胞在40-50%的内网状层处相对狭小地单层，在开和关时接受输入。它们的树突状树干含有4-7个主枝和许多小树枝(莱维克，1967年;Amthor等人，1989年a;Zeck等人，2005年;Roska等人，2006年).

Rockhill等人命名的双层细胞G3可能是Blue-ON，尽管这一鉴定尚未在生理学上得到证实。这是本系列中唯一一个没有通过记录和随后的解剖鉴定直接确认兔子生理特性的细胞。在其他哺乳动物中，这些细胞具有空间简单（圆形）的感受野。它的显著特点是，当短波长落在感受野上时，细胞会产生兴奋反应，而长波长则会抑制这种反应。兔子体内记录到一个蓝色ON细胞(考德威尔和道，1978年)这里鉴定的双层细胞具有其他物种蓝色ON细胞的形态(Dacey，1993年;Calkins等人，1998年;马士兰，2001年).

名为G5的电池显示瞬态OFF响应(Roska等人，2006年). 其树枝状乔木直径约250μm，在内部丛状层的20%处分层。它的特点是在ipl内的分层异常狭窄（参见图2 F). 这个细胞可能对应于(Roska等人，2006年).

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图2

PSD95-GFP在视网膜神经节细胞中的表达

(A类)表达PSD95-GFP的快瞬变（α）神经节细胞的主要树突。左侧可见躯体。树突的一部分被剪掉（斜棒），以便同时显示近端和远端部分。比例尺，50μm。(B-D公司)面板A中方框区域的放大视图。PSD95-GFP标记的突触区域显示为高像素强度的点。请注意，与同一树突的内侧（C）和远端（D）部分相比，近端树突几乎完全没有点状突起。(E类)G5单元的PSD95-GFP点（关闭）。以0.4μm步长拍摄的10个共焦图像平面通过树状结构的最大强度投影。有关此单元格的完整图像堆栈的视图，请参阅补充材料S1（单元格20041031-3）。(F类)同一单元格的垂直投影以显示分层深度。细胞核内层（INL）和神经节细胞层（GCL）用核染料TOPRO（蓝色）进行可视化。E&F的比例尺，50μm。

这个打开—OFF定向选择电池（G7英寸Rockhill等人，2002年)对闪烁的刺激作出开-关反应，并对多种刺激运动速度作出定向反应。它是一个大细胞，具有独特的双层树突树干，是许多解剖学和生理学研究的焦点(巴洛和莱维克，1965年;Amthor等人，1984年;Yang和Masland，1992年;Roska和Werblin，2001年;Fried等人，2002年;Roska等人，2006年).

频率较低的ON DS电池（G10英寸Rockhill等人，2002年)对闪光刺激产生ON响应，对非常缓慢的刺激运动产生响应。其ON方向选择特性已通过记录证明(Oyster等人，1980年;Amthor等人，1989年a;他和马斯兰，1998年).

这个Brisk瞬态电池，（G11英寸Rockhill等人，2002年)具有ON和OFF变体，具有较大的感受野和非线性电生理反应，类似于猫的Y（α）细胞(克莱兰德和莱维克，1974年;考德威尔和道，1978年;Amthor等人，1989年b;Roska等人，2006年). 它以短暂的高频脉冲响应光的开始或偏移。这是兔子最大的神经节细胞，树突树干直径可达1毫米(Peichl等人，1987年).

免疫染色、图像采集和分析

用PSD95-GFP表达质粒转染后4天，取视网膜，在4%多聚甲醛中固定30分钟。将一些视网膜留在Millicell滤镜上，并作为整体支架立即用于免疫染色；对56个神经节细胞进行Kif3a或RIBEYE的复染，对3个GluR2/3和5个GABAA受体进行复染。在这种情况下，将组织与一级抗体在4°C下孵育一周。从Chemicon（加利福尼亚州Temecula，目录#AB1506，批号22061130，该抗体不区分同种型GluR2和GluR3）获得兔抗大鼠谷氨酸受体GluR2/3羧基末端肽（EGYNVYGIESSKI）的多克隆抗体，并以4μg/ml的剂量使用。针对GluR2/3的抗体在Western blots中进行了特异性测试，在小鼠脑提取物中标记了～110 kD的单一条带，而肝脏提取物中没有该条带，这与该蛋白在神经组织中的已知表达一致。小鼠单克隆抗GABA A受体α1-链（Chemicon，目录#MAB339，批号#19050429，克隆BD24，针对纯化的牛脑GABA受体）以4μg/ml的浓度使用。该抗体在海马组织的Western blot中识别出51 kD带(Rissman等人，2003年). 当在垂直切片中进行测试时，它在整个IPL中给出了点状标记，这与早期研究中观察到的该亚单位的模式一致(Sassoè-Pognetto等人，1995年). 抗CtBP2（RIBEYE）C末端结构域（氨基酸361-445）的兔多克隆抗体购自BD Biosciences（加利福尼亚州圣何塞，目录号612044，批号39302），使用浓度为2μg/ml。突触带成分RIBEYE被证明是一种融合蛋白，形成一个独特的a结构域和一个与转录抑制因子CtBP2相同的B结构域(Schmitz等人，2000年). 抗CtBP2抗体将视网膜提取物中的RIBEYE识别为～120和～110 kD的双谱带，并在免疫电子显微镜下标记突触带(汤姆·迪克等人，2005年). 抗突触带成分Kif3a的小鼠单克隆抗体（驱动蛋白II，针对从海胆卵中纯化的驱动蛋白Ⅱ产生）购自Covance（加利福尼亚州里士满，目录号MMS-198P，批号147333001），用量为20μg/ml。抗Kif3a抗体已在早期的研究中进行了表征，发现其在大鼠视网膜提取物中识别出约80 kD条带的紧密双链；在垂直切片中，它标记了IPL中的点状结构和OPL中更大的、通常是马蹄形的轮廓，这与突触带标记一致，而在免疫前血清中没有看到这种标记。这种抗体也被用于在免疫电子显微镜中标记突触带(Muresan等人，1999年). 抗Kif3a和抗RIBEYE抗体都被用来识别包括兔子在内的几种哺乳动物视网膜中的突触带(希尔德布兰德和索里亚诺，2002年;Jeon等人，2002年;Hirano等人，2007年;Xu等人，2008). 所有抗体在用于共同定位研究之前，在兔视网膜的垂直琼脂糖切片（50μm）上进行测试。

使用与罗丹明偶联的二级抗体进行免疫染色。CtBP2的单一免疫标记图6与FITC偶联的二级抗体（所有二级抗体均来自宾夕法尼亚州西格罗夫的Jackson Immunoresearch Laboratories）。偶尔，使用TOPRO3（Invitrogen）或DAPI（Sigma）对细胞核进行复染。该组织被安装在Vectashield（Vector Laboratories，Burlingame，CA），并在安装后第二天进行成像。在配备氪/氩和一氧化碳的BioRad Radiance共焦系统上进行图像采集₂并安装在蔡司Axioscope II上。

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图6

内丛状层突触带的分布

（A-C）在20%、50%和80%深度通过IPL的光学部分。红色RIBEYE染色。所有面板的比例尺，20μm。（D）通过兔子视网膜的垂直截面，对突触带标记物RIBEEYE进行染色（绿色）。提供DIC图像用于定位。OPL中的大型结构是与杆端和锥端相关的带状结构。IPL中较小的点状标记对应于双极轴突终末上的带状物。请注意，IPL中没有明显的带状密度梯度。比例尺，50μm。（E）每毫米突触带数²作为IPL深度的函数（0%最接近INL，100%最接近GCL）。

为了在单个神经节细胞上对PSD95-GFP点状突起进行成像，在从INL/IPL边界到IPL/GCL边界的63倍处进行了穿透焦点z堆栈。z维的步长与标称x/y像素分辨率（通常为0.4μm）相匹配。对于靠近视觉条纹的小神经节细胞，一个图像堆栈通常就足够了。对于大型细胞（如Brisk Transient或外围DS细胞），以相同的放大倍数拍摄附近区域的多个图像堆栈，并使用Photoshop 7.0（加利福尼亚州圣何塞Adobe Systems，Inc.）进行蒙太奇。没有对这些图像堆栈进行其他数字图像处理。

免疫组化后，在低倍镜下进行z轴扫描，并选择单个树突进行高分辨率成像（63x物镜，光学变焦设置为2-4倍）。使用与Li等人描述的方法类似的方法分析了两个通道中标记的结构的关联程度（例如，绿色的PSD95-GFP点，以及用洋红的抗Kif 3a或抗RIBEYE染色的突触带）(Li等人，2002年)使用Matlab（The Mathworks，Lowell，MA）。分析的部分树突状乔木总数为14个（PSD95和Kif3a或RIBEYE为6个，PSD95、GluR2/3为3个，PSD 95和GABAA受体为5个）。

从INL边界（0%深度）到GCL边界（100%深度），通过IPL在光学截面上计数突触带。对图像进行中值滤波、阈值分割，并使用用户编写的Matlab例程计算单个色带的数量。

为了定量分析树突结构，使用了Neurolucida软件包（Microbrightfield，Williston，VT）从共焦图像堆栈中追踪单个神经节细胞。通过在图像堆栈中上下移动，在三维中追踪树突树，使树突保持在焦点上。这是可能的，因为除了明亮的PSD95-GFP点外，还可以辨别出暗淡的背景标签，这可能是由于运输中的PSD95-GFP造成的。通过在数字化细胞图上放置标记物，记录PSD95点状突起的定位，也记录在神经清醒症中。

以前的一些工作人员报告了突触接触的标称密度，将附近树突状膜的表观面积作为基线，即puncta/μm²对于某些目的，例如生物物理建模，原则上这可能具有优势。然而，就视网膜表面的采样（即细胞输入和输出的镶嵌）而言，不同点的树突状区域只是一个混淆变量。此外，这种测量几乎不可能用光学显微镜精确地进行：对于非常薄的物体，例如树突，存在厚度和亮度的主要混淆。这尤其危险，因为许多标记方法为树状树的不同部分提供了不均匀的亮度。更糟糕的是，枝晶“面积”的估算取决于实际测量数量的平方，即枝晶半径。这放大了本已很大的测量误差。相比之下，测量树枝长度简单可靠。这是一个更稳健的数量，在这里用作参考基础。

PSD95-GFP的表达表明视网膜神经节细胞上兴奋性突触的位置

用编码PSD95-GFP的质粒对视网膜神经节细胞进行基因枪杀。由此产生的图像包含了分布在树状乔木周围的明亮的荧光点。还观察到一种更微弱的背景标记，可能是由运输中的PSD95-GFP引起的。这与早期研究中的观察结果一致(Ebihara等人，2003年)并有助于识别树枝晶本身（参见图2A). 细胞间的标记模式一致。PSD95-GFP穿孔总数和密度(表1)与其他研究人员使用不同方法得出的兴奋性突触的估计值类似(McGuire等人，1986年;Freed and Sterling，1988年;科恩和斯特林，1991年;韦伯等人，1991年;韦伯和斯坦福，1994年;Jacoby等人，1996年;Ghosh和Grünert，1999年;Owczarzak和Pourcho，1999年;Jacoby等人，2000年;Lin等人，2002年;Dacheux等人，2003年;Famiglietti，2005年). PSD95-GFP在一次枝晶和那些枝晶中几乎不存在(图2 A和B)从胞体垂直穿过IPL，或连接双层层细胞的开-关轴（数据未显示）。在IPL树突乔木最终层中分层的树突乔树部分，PSD95-GFP点状物数量众多(图2 C-E). （初级树突中没有点状突起正在通过也可作为证据，证明PSD95-GFP可能存在某种非特异性沉淀或聚集。对于其他一些蛋白质，确实会发生蛋白质的非特异性聚集，但通常会产生相反的分布，即最靠近体细胞中蛋白质合成位点的树突，数据未显示。）

在突触前和突触后两侧，发现PSD95-GFP点与已知的突触结构紧密并列。神经节细胞接收来自双极细胞的大部分兴奋性输入，其区别在于存在突触带。我们用抗突触带成分Kif3a（驱动蛋白II，Muresan等人，1999年)或RIBEEYE（CtBP2，Schmitz等人，2000年). 几乎所有PSD95-GFP点都与突触带紧密并列(图3 A). 这些点状突触代表兴奋性输入发生的区域，但不一定代表单个兴奋性突触。在许多情况下，PSD95-GFP点子仅与单个突触前色带相关（如箭头所示图3 A). 但在极少数情况下，PSD95-GFP点状物明显与两条或多条色带（图3 A). 在图3 A，显示同一细胞的两个长树突。在图中显示的34个PSD95-GFP点中，21个似乎代表单个突触。在12例中，PSD95-GFP点状物（通常是较大的点状物之一）与两条或多条色带相关。只有一个点子与任何丝带都没有关联。电子显微镜观察到神经节细胞上的带状突触附近成对（“双突触”）(Famiglietti，2005年). 因此，突触后密度代表突触受体区域，而不是识别单个突触。

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图3

PSD95-GFP点与突触前和突触后标记物共定位

(A类)神经节细胞的两个树突（标记为PSD95-GFP，绿色），在组织中也用抗突触带成分RIBEYE（洋红）的抗体免疫，显示突触前（RIBEYE）和突触后（PSD95-GFP）成分的精确并置。箭头表示PSD95-GFP标记的突触区与单个突触带相对；箭头表示接触两条或更多丝带的更宽的突触区。从高功率图像堆栈中重建20个图像平面的体积。面板A-C的比例尺，10μm。(B类)用PSD95-GFP（绿色）和抗GluR2/3（品红色）标记的ON/OFF DS细胞的部分OFF心轴的体积重建。由于这两个标记都是突触后的，所以信号在一些突触部位完全重叠（箭头）。一些PSD95点没有与GluR2/3共定位，这表明在这些位点使用了不同的受体亚单位。（C）用PSD95-GFP（绿色）和抗GABAA受体（品红色）标记的ON/OFF DS细胞的部分OFF-arbor进行体积重建。（D）标记有PSD95（绿色）和Kif3a（洋红色）的神经节细胞树突树突（部分）的单图像平面。比例尺，20μm。(E&F公司)绿色通道中的PSD95-GFP和品红色通道中的Kif3a之间的相关性（E），以及品红色通道旋转90°时PSD95-GFP和Kif3a（F）之间的相关性，以确定随机重叠的影响（参见方法）。在这些图中，中心像素表示PSD95-GFP点的质心。周围的图像显示了品红（Kif3a）通道（E）中周围像素的像素强度，并且品红通道旋转了90°（F）。颜色代码从深蓝色（最低强度）到红色（最高强度）。(G公司)不同的神经节细胞，用PSD95-GFP（绿色）标记，并用GluR2/3（品红色）抗体进行复染。比例尺，20μm。(H&I公司)PSD95-GFP和GluR2/3（F）之间的相关性，以及PSD95-GFP和GluR2/3与品红色通道旋转90°之间的相关性。(J型)不同的神经节细胞，用PSD95-GFP标记，并用抗GABA-A受体抗体（品红色）复染。比例尺，20μm。(确定（&L）)两个通道的空间相关性。请注意，PSD95-GFP和GABA-a之间没有明显的相关峰。

我们通过平均PSD95-GFP（绿色）和Kif3a（洋红）通道中围绕每个PSD95/GFP点心的21×21像素方格中的像素强度，定量评估了PSD95-GFP与Kif3a标记在DS-cell上的共同定位。所得图量化了Kif3A点状物在PSD95-GFP点状体附近发生的趋势(Li等人，2002年). 这两个标记有很强的共现趋势；作为对照，当两个通道中的一个旋转90度时，它消失了(图3 E-F). 因此，突触带与PSD95-GFP点有明显的联系。

AMPA受体是双极细胞向神经节细胞进行突触传递的基础(Lukasiewicz等人，1997年)，几乎所有神经节细胞都表达GluR2或GluR3或两者，但不一定在所有突触上都表达。大多数神经节细胞也表达其他AMPA受体亚型(Jeong等人，2006年;Jakobs等人，2007年). 如所示图3 B和G该细胞（on-OFF DS细胞）上的许多但不是全部PSD95-GFP点与GluR2/3免疫反应共同定位。从中也可以明显看出图3标记的树突和突触结构并非均匀分布，而是在米勒细胞的未标记轮廓周围成束分布（如箭头所示图3 G). 这为我们的分析提出了一个潜在的问题，因为定位在同一分支中的结构可能会被错误地发现只是因为它们必须彼此靠近而被共同定位。为了测试这种可能性，我们用GABAR-A对表达PSD95-GFP的细胞进行了双重标记，GABAR-A是一种即使不是所有神经节细胞也应该在大多数神经节细胞上表达的受体，但预计不会与PSD95共同定位。如所示图3 C和J，细胞树突呈束状排列，GABAR-A也呈明亮阳性。在相关图中(图3 K)没有明显的峰值，表明这两个标记之间缺乏相关性。总之，这些实验表明，PSD95-GFP的表达（至少在数量和时间上）是确定视网膜神经节细胞上兴奋性突触位置的可靠方法。

神经节细胞的功能多样性并不伴随特殊的局部兴奋性输入模式

我们收集了用PSD95-GFP注射的56个神经节细胞基因0.4μm步长的共聚焦堆栈。对图像堆栈进行归档，并检查其是否适合数字化。我们的标准是：（1）三名独立观察者（两名作者和另一名经验丰富的视网膜解剖学家）对细胞类型的一致性；（2）树突树干与其他细胞的重叠最小；（3）没有退化迹象；（4）最佳成像条件，即非常平坦的安装和强烈的对比度。在原始样本中，25个细胞符合这些标准，10个细胞在Neurouscuida软件包中进行了数字化(表1). 定量分析得出的主要结论可以通过检查更大系列的细胞进行目测验证。作为未来研究的资源，我们已经制作了这10个细胞的高分辨率图像堆栈（见补充材料S1）。

我们选择了一系列跨越广泛生理和结构特性的细胞类型（在方法中进行了更详细的描述）进行研究。简言之，它们是：局部边缘检测器（LED），是兔子所有神经节细胞中最小的，对空间对比度有高度非线性的反应；G3细胞，一个小的双层神经元；G5细胞是一个OFF细胞，在IPL的第2层有一个明显平坦的树干，并在刺激偏移处触发短暂的尖峰脉冲；备受研究的ON-OFF方向选择性细胞；数量较少的ON定向选择细胞；和Brisk Transient细胞，在生理学上类似于猫的Y细胞，解剖上称为α细胞，是大多数视网膜中最大的神经节细胞。

兴奋性突触分布的一个显著特征是，不同类型的细胞之间的差异很小；在图案上，在间距的规律上，甚至在绝对密度上(表1和图4). 这些细胞跨越兔子的整个感受野大小范围，包括具有相对简单感受野特征的细胞和对光的反应包含复杂非线性的细胞。然而，兴奋性输入的密度变化不到2倍，从0.15 punta/线性μm树枝晶到0.28 punta/μm。尽管在细胞生理学、树突状总长度的数量级范围以及树突状分支的模式上存在巨大差异，但情况确实如此（图​（图44和​和55).

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图4

突触输入区均匀分布在大多数类型神经节细胞的树突树突周围

兴奋性谷氨酸能输入（PSD95-GFP puncta）的位点用点表示。这些是Neurolucida软件中数字表示的绘图。每个单元类型仅显示一个示例。单元ID号与中的相同表1。此处显示的G5单元格#1是根据中显示的原始数据绘制的图2.

同样，突触在细胞间的空间分布也相似。如上所述，突触避开了穿过内丛状层水平的树突，将双层细胞或胞体的树突与单层树突连接起来。否则，低阶树突状节段和高阶树突形节段的兴奋性输入模式几乎没有差异(图5). 通过电子显微镜重建的少数细胞类型（猫和猴子）显示出同样缺乏兴奋性输入模式(斯特林，1983年;McGuire等人，1986年;科恩和斯特林，1991年;Jacoby等人，1996年;Calkins等人，1998年;Jacoby等人，2000年). 在整个重建细胞样本中，PSD95-GFP点状细胞的总密度为0.19±0.04点/线性μm，对于如此不同大小和生理的细胞来说，这是一个狭窄的范围(表1). 平均值的变化与细胞的任何明显特征无关，例如细胞类型生理反应的大小或复杂性；树状乔木内不同的空间位置也不相同。

锥形双极输出的空间密度在内部丛状层中变化很小

我们的一个主要发现是，不同类型视网膜神经节细胞的树突树突以相似的线性密度接收突触，与神经节细胞大小或生理类型无关。由于不同类型的视网膜神经节细胞在内网状层的不同深度形成树状结构，该发现对PSD95-GFP作为兴奋性输入位点标记的准确性进行了测试。大多数（如果不是全部）视网膜神经节细胞的兴奋性输入在突触前侧伴随有突触带，突触带是由视网膜双极细胞轴突形成的突触的特征性特化。因此，如果对视网膜神经节细胞的输入的突触后密度在内部丛状层的不同水平上树状化的细胞类型之间变化不大，那么内部丛状层的相同水平上的带状突触的密度也应该变化不大。

如果IPL的每一层都被单一神经节细胞类型的树突所占据，那么PSD95点和突触带的空间密度应该匹配。因此，我们在IPL的一系列深度测量了RIBEYE免疫染色显示的突触带密度(图6). 对于IPL的1-4层，突触带的密度范围仅为15.98×10⁴/毫米²至20.07×10⁴/毫米²（第五层主要由杆状双极细胞的轴突终末构成，在视网膜神经节细胞上几乎没有突触，因此这一层的带状密度对于我们的分析来说信息量较小。）尽管对于单个细胞类型来说，尚不可能实现突触前和突触后元件的一一匹配，这一发现再次表明了兴奋性输入的相对一致性。

感受野敏感性和兴奋性输入的分布

当我们分析输入位点在枝晶场测量的二维区域的分布时，出现了两种概括。首先，除了一个（特别是不对称的）乔木外，PSD95位点的最大密度出现在细胞体周围的环形区域。由于树突上PSD95位点的密度在整个树突乔木中变化不大，这种面积分布反映了不同距离树突的不同空间密度。换句话说，树突乔木并不是完美的空间填充物：在胞体附近有一个树突密度特别高的区域。双极细胞对视网膜的覆盖基本上是均匀的（每个已知的双极细胞类型都有一个接近统一的覆盖因子（参见(麦克尼尔等人，2004年)因此，双极细胞输出到神经节细胞的敏感性曲线基本上是平坦的——双极细胞镶嵌中没有重大的不规则性。因此，神经节细胞的最终敏感性应该由该细胞树突树干上的双极输入数量决定，细胞的生理敏感性应该在该数量最高的地方达到峰值。事实上，猫的双极细胞到α神经节细胞的输入信号建模预测了已知的高斯型灵敏度衰减，但模拟显示在体细胞区域附近有一个缺口(Freed等人，1992年). 在兔子身上，单个神经节细胞的感受野以非常高的分辨率被直接绘制出来：这里通过最近端树突上没有PSD95位点来预测细胞体的敏感性降低，事实上在许多细胞中都观察到了（见图​图11,​,3三,​,44,​,55,​,7,7、和​和88属于Brown和Masland，2000年). 有趣的是，这种匹配没有对输入的强度进行任何特定的加权，从而支持了早期的预测(Freed等人，1992年)神经节细胞是电子致密的，这表明每个PSD95位点的突触强度大致相等。

小细胞在单位面积的感受野中接受更多的刺激

我们发现神经节细胞树突状场所包围的区域与单位面积突触密度之间存在强烈的（r=-0.89）反向关系：小细胞比大细胞接收更密集的突触输入(图8). 这种关系主要不是由单元格类型决定的。虽然不同的细胞类型对于任何给定的视网膜偏心率都有不同的大小，但我们的样本还包括两个ON-OFF方向选择细胞的示例，一个来自中央视网膜，另一个来自外围。尽管它们的面积相差约300%，但两者都具有一般关系预测的PSD95位点的总密度。这种关系也不是细胞类型分层有多厚的问题，因为LED和活跃的瞬态细胞都是高度分层的。这是一个违反直觉的发现，因为小细胞上的单个突触在生物物理上应该比大细胞上的突触在去极化胞体方面更强大。

这种关系的结构基础是，就敏感性而言，小细胞每单位视网膜面积的树突比大细胞多。其功能意义解释如下。如上所述，如果神经节细胞是电紧张的，并且如果它们的所有兴奋性输入在有效性上大致相等，那么可用于将膜电位向细胞的动作电位阈值移动的总兴奋性驱动仅仅取决于每个细胞接收的突触的总数。然而，一些细胞调查世界上的大区域和其他小区域。如果细胞接收到相同面积密度的突触输入，问题是小细胞接收到的总兴奋性驱动力将远远低于大细胞，因为感受野的面积可能会变化一个数量级以上。在没有其他补偿的情况下，小神经节细胞对光线刺激视网膜的敏感性将远远低于大神经节细胞。这种趋势将被小单元输入的空间密度增加所抵消。换句话说，兴奋性输入的差异密度将趋向于使小细胞和大细胞的响应正常化，从而使小细胞与大细胞的反应处于相同的动态范围内。否则，完全覆盖两个感受野的刺激会比同样的刺激更强烈地驱动大细胞。当然，还有很多其他种类的补偿可以想象，我们的解释很可能是一种简化。然而，如果没有别的，目前的结果指出了问题的存在。

与其他物种的比较：哺乳动物神经节细胞的突触分布遵循单一的属平面

已经对兔子的神经节细胞进行了详细的电生理学研究，并且在许多情况下，其反应特性与确定的形态类型明确相关(莱维克，1967年;考德威尔和道，1978年;Amthor等人，1989年a;Amthor等人，1989年b;Rockhill等人，2002年;Roska等人，2006年). 它们的范围从大而直接的快速瞬变细胞到微小但生理上复杂的局部边缘检测器。然而，我们发现所有类型的细胞都有类似的兴奋性输入模式。通过连续切片电子显微镜重建的两种小细胞类型（猫和猴）显示出相同的兴奋性输入模式缺失。令人惊讶的是，考虑到它们在大小上的差异，这甚至延伸到了兴奋性输入区的绝对密度，对于我们的整个细胞类型样本，其范围不到两倍。

最近在豚鼠身上报道了一项在范围和目标上与目前类似的研究(Xu等人，2008). 我们在兔子身上的基本发现是一致的：所有类型的视网膜神经节细胞都显示出兴奋性输入的均匀分布（Xu等人通过染色突触带并将其与注入细胞的树突计算关联来测量这些输入）突触输入信号在树突场中的分布，我们可以看到在感受野中心附近突触密度下降。然而，这显然是由于他们在体细胞和近端树突区域的数据平滑所致（参见他们的图4). 据报道，猕猴的侏儒、阳伞和“花环”细胞的兴奋性突触输入在树突树干周围均匀分布(科恩和斯特林，1991年;Jacoby等人，1996年;Calkins等人，1998年;卡尔金斯和斯特林，2007年); 用于绒猴的侏儒、阳伞、黑视素表达细胞和蓝细胞(Ghosh和Grünert，1999年;Jusuf等人，2007年;Eriköz等人，2008年) ; 猫视网膜的α和β细胞(McGuire等人，1986年;Freed and Sterling，1988年). 抑制性突触似乎遵循相同的规则，但目前由于缺乏能够揭示所有类型的抑制性突触体的细胞化学标记，这一结论受到了限制。(Calkins等人，1998年;Grünert和Ghosh，1999年;Jeon等人，2002年;Lin等人，2002年). 在可以比较的地方，光学显微镜和电子显微镜的结果是一致的。这里和之前的这些论文中描述的模式——来自不同的实验室和使用不同的方法——似乎代表了对哺乳动物向视网膜神经节细胞分配突触输入的通用计划的明确描述。

具有讽刺意味的是，早期关于树状计算的有影响力的推测(托瑞和波乔，1978年;科赫等人，1983年;Koch等人，1987年)重点放在视网膜神经节细胞的树突树上，现在看起来相当简单，至少在输入模式上是这样。在这方面，视网膜神经节细胞似乎不同于许多其他投射神经元，其中树突树干的不同区域接收不同密度和类型的兴奋性和抑制性突触输入，并且容易证明视网膜神经节神经元曾经假设的相互作用类型。这并不是说树突计算不会发生在视网膜神经节细胞中，只是说它们不是基于输入的空间排列。树突特化的一个明确例子是离子通道表达的变化(O'Brien等人，2002年;Oesch等人，2005年). O'Brien及其同事仔细地将猫神经节细胞的形态类型与细胞中显示的离子电导阵列相关联。他们发现，代表生物物理特征的导电性如此独特，以至于每种细胞类型都具有独特的特征。

总之，我们和其他人的研究结果表明，普通视网膜神经节细胞是一种致密的神经元，不能通过树突树突特殊区域内的兴奋和抑制的空间模式实现整合功能。相反，它独特的反应是通过结合双极和无长突细胞预先处理的兴奋性和抑制性输入而产生的。这些输入一旦被收集，就会通过细胞类型特异性表达和离子通道蛋白的空间排列以独特的方式形成。

我们感谢本一心（Yixin Ben）的基因注射和视网膜孵化，感谢丽贝卡·罗克希尔（Rebecca Rockhill）创建共焦图像堆栈的数字表示，感谢霍炳兴（Bingxing Huo）在绘制图形方面的帮助。RHM是预防失明研究的高级研究员。由NIH拨款R01-EY017169支持。

这项工作得到了NIH拨款（R01-EY017169）的支持。