临床投资杂志。2008年11月3日；118(11): 3619–3628.
证实CD4的间接异体特异性+CD25型+TCR基因转移的Tregs有利于小鼠移植耐受
，1 ，1 ，1 ，2 ，1 ，三 ，2 ，4 ，1和1
朱莉娅·元善曾
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
雅库普Tanriver
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
江水平
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
邵安雪
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
库拉切尔维·拉特纳索西
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
陈大新
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
汉斯·施特劳斯
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
R.帕特·布西
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
乔瓦娜·隆巴迪
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
罗伯特·莱克勒
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
1MRC移植中心，伦敦国王学院，盖伊校区，英国伦敦。2英国伦敦大学学院汉普斯特德校区免疫学和分子病理学系。三英国伦敦帝国理工学院哈默史密斯校区免疫学系。4美国阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学病理学系。
收到日期：2007年7月3日；2008年8月20日接受。
摘要
T细胞对MHC不匹配移植的反应可以通过直接识别移植细胞上的同种MHC分子或通过识别受体MHC分子中受体APC表面的同种肽来介导，这一过程称为间接识别。作为CD4+CD25型+Tregs在调节同种异体反应中起着重要作用，我们研究了异基因MHC分子特异性小鼠Tregs能否在体外生成，并能促进免疫活性受体小鼠的移植耐受。通过刺激CD4获得能够直接识别异基因MHC II类分子（dTregs）的Tregs+CD25型+C57BL/6小鼠（H-2b条)BALB/c小鼠的异基因DC（H-2d日)。为了产生间接识别异基因MHC II类分子的Tregs，dTregs与具有H-2K特异性的TCR基因进行逆转录d日由H-2A提供b条MHC II类分子。体外证实了TCR转导的Tregs的双重直接和间接异体特异性。在小鼠中，TCR转导的Tregs（而非dTregs）与短期辅助免疫抑制联合使用时，可诱导部分MHC不匹配心脏移植物的长期存活。此外，尽管dTregs在诱导完全MHC不匹配心脏移植物的长期存活方面仅比TCR转导的Tregs稍差，但对长期存活心脏的组织学分析表明，TCR转染的Treg具有显著的优越性。因此，针对异基因MHC II类分子的Tregs可有效促进小鼠移植耐受，这表明此类细胞具有临床潜力。
介绍
天然CD4+CD25型+众所周知，Tregs在预防自身免疫方面起着关键作用。近年来，一些研究小组报告说，这种细胞群也可以在实验模型中用于提高移植耐受性(1)。事实上，使用多克隆CD4进行造血干细胞移植的临床方案已经制定+CD25型+T细胞抑制移植物抗宿主病（GVHD）(2——4)。然而，在移植耐受性的实验模型中，耐受性可以通过CD4转移+T细胞，该效应具有高度特异性，提示CD4的扩增+CD25型+对供体同种抗原具有特异性的Tregs将显著提高效率(1，5，6).
在对MHC抗原的同种异体反应中，涉及2条通路(7)。“直接途径”是指在供体细胞表面识别完整的供体MHC分子。这会以非常高的频率诱导强烈的反应，在体外驱动混合淋巴细胞反应，在体内驱动早期移植排斥反应。当供体同种异体抗原被受体APC内化、加工并被受体MHC分子呈现为肽时，发生间接反应。这是一种低频响应，但可以随时间克隆扩展。对接受移植的患者进行免疫监测表明，间接同种异体反应是慢性排斥反应的主要免疫驱动因素，并对移植后的长期生存构成主要威胁(8，9)。此外，试图确定CD4特异性的小组+能够在啮齿类动物模型中传递耐受性的T细胞得出结论，它们具有间接的异体特异性(6，10，11)。根据这些观察结果，诱导具有间接抗供体反应特异性的调节细胞可能是成功耐受方案的关键组成部分。
虽然间接同种异体特异性可以在CD4中得到增强+CD25型+如前所述，用肽同种异体抗原脉冲的自体树突状细胞重复刺激Tregs，这是无效的，因为自体反应细胞有扩张的趋势(12——15)。在这项研究中，我们探索了一种产生具有间接异体特异性调节细胞的替代方法。从TCR转基因小鼠株中分离出TCR cDNA克隆，该小鼠株的T细胞对K细胞具有间接特异性d日H-2A呈现的分子b条将其克隆到逆转录病毒载体中并用于转导CD4+CD25型+特雷格斯。使用这种方法，我们发现同种异体特异性Tregs与短期全身免疫抑制相结合可以诱导同种异体心脏的无限期存活。尽管具有直接抗供体特异性的Tregs延长了移植物存活时间，但通过TCR转导增加间接同种异体特异性可显著提高疗效。
结果
CD4细胞+CD25型+通过逆转录病毒转导TCR基因可以产生具有间接异体特异性的Tregs。
在本研究中，使用了3种不同的Treg品系。自体反应Treg株（autoTreg）和仅具有直接同种异体特异性的Treg系（dTreg+CD25型+分别用自体（BL/6）和异基因（BALB/c）树突状细胞从C57BL/6脾和淋巴结细胞中纯化的细胞。第三个具有双重特异性的Treg系[dTreg（TCR）]由TCR转导产生，如下所述。从TCR34转基因小鼠的T细胞中分离出TCRα和β链cDNA克隆，并将其亚克隆到基于骨髓增生肉瘤病毒的逆转录病毒载体（pMP71-PRE）中。该TCR对K肽具有特异性d日由H-2A提出b条为了产生对H-2具有直接和间接异特异性的Tregd日用TCR编码的逆转录病毒转导具有直接同种异体特异性的同种异体抗原。
流式细胞术分析显示，在1轮TCR逆转录病毒转导后，7%–15%的Tregs同时表达转导的TCRα（Vα11.2）和TCRβ（Vβ13）链（图)。用K重新刺激TCR转导的Tregsd日肽脉冲未成熟BL/6 DC增加了TcRα11.2的百分比+TcRβ13+细胞。在3次刺激后，超过50%的Tregs表达转导的TCR。表达转导TCR的Treg群体的扩大表明，TCR的逆转录病毒转导是产生抗原特异性Treg的有效途径。在长期体外培养过程中，转基因表达稳定。3个月后，TCR转导的Tregs保留了TCRα11.2和TCRβ13的表达（图).
逆转录病毒转导后表达转导TCRα和β链的Treg群体的扩大。用编码K的基因转导直接异基因Treg系d日54–68间接异体特异TCR（Vα11.2/Vβ13）链，每周用K重新刺激d日肽脉冲的未成熟BL/6 DC。为了检测转导的TCR基因的表面表达，在不同时间点用抗小鼠Vβ13-FITC、Vα11.1/2-PE和抗CD4–APC对细胞进行三重染色。仅CD4+对人群进行门控分析。显示了每个象限中的单元格百分比。
TCR转导的CD4+CD25型+Tregs表现出双重异体特异性。
为了测试转导的TCR的功能，用一系列K浓度的成熟BL/6 DC刺激TCR转导的Tregsd日肽，通过以下方法评估增殖[三H] 胸腺嘧啶掺入。TCR转导的Tregs对K的反应增殖d日肽的剂量依赖性（图A） ●●●●。相反，非转导Tregs和GFP转导Tregs对Kd日BL/6 DC呈现的肽（图A） ●●●●。肽的剂量依赖性增殖表明转导的TCR基因具有功能。
TCR转导赋予直接异体特异Treg株间接异体特异性。(A类)TCR转导的Tregs[dTreg（TCR），黑条]与成熟的BL/6 DC在不同剂量的K存在下共同培养d日肽。在第3天通过以下方法测量T细胞增殖[三H] 胸腺嘧啶掺入。GFP转导的Tregs[dTreg（GFP），灰色条]和非转导的直接同种异体Tregs（dTreg，白色条）用作对照。误差条表示一式三份实验的平均值±SD。(B类)CFSE标记的TCR转导Tregs、非转导的直接同种异体Tregs和Kd日肽脉冲DC扩增的间接同种异体特异Treg（DCiTreg）与成熟BL/6 DC、Kd日肽脉冲BL/6 DC（1 mg/ml）、BALB/c DC或CBA DC。在共培养的第4天收集细胞，并用抗CD4–APC和碘化丙啶（PI）染色。通过流式细胞仪分析评估细胞的CFSE稀释度。仅CD4+圆周率——对人群进行门控分析。括号区域表示每个细胞分裂。
为了确定TCR转导的Tregs是否同时具有间接和直接抗-H-2d日特异性，用CFSE标记细胞，并用不同小鼠菌株产生的成熟DC刺激。CFSE稀释法检测细胞增殖。选择用于直接同种异体特异性的非转导Treg系（dTreg）仅对BALB/c DC产生反应，而对其他DC制剂无反应（图B） ●●●●。相反，具有双重特异性的TCR转导细胞[dTreg（TCR）]不仅在BALB/c DC存在的情况下增殖，而且在Kd日肽（图B） ●●●●。通过比较dTreg（TCR）的增殖与用K产生并扩增的Treg系的增殖，证明了TCR转导方法在实现间接同种异体特异性方面的优势d日肽脉冲BL/6 DC（DCiTregs）。TCR转导细胞对K的反应d日BL/6-DCs呈递的肽比DCiTregs的增殖更具活力（图B） ●●●●。此外，在缺乏K的情况下，DCiTregs也会增殖以响应BL/6 DCd日肽。这一结果进一步支持了这样的观点，即该Treg细胞系含有自身反应性T细胞，并且只有一小部分T细胞具有间接异体特异性，正如之前在人类系统中所证明的那样(15)。这种增殖模式证实了转基因细胞既获得了间接的异体特异性，又保留了直接的异体特异性。总之，这些结果表明TCR转导是产生和扩增具有间接异体特异性Tregs的一种非常有效的方法。
TCR转导没有改变Treg的特性。
为了探讨TCR转导是否改变了Tregs的表型和功能特性，将细胞表面标记的表达和TCR转染Tregs与未转染Tregs的抑制能力进行了比较。如图所示A、 未转导和TCR转导的Tregs显示出类似的Treg标记CD25和FoxP3表达水平。TCR逆转录病毒转导并没有改变Tregs上CD3和CD62L的表达水平。此外，逆转录病毒转导既没有改变体外抑制活性，也没有改变增殖特性。当用抗CD3刺激时，TCR转导的Tregs反应性低，并且抑制活性与非转导Tregs相当（图B） ●●●●。这些数据表明，逆转录病毒转导并没有改变Tregs的表型和功能。
逆转录病毒转导并没有改变Treg的表型和功能。(A类)在每周刺激结束时，用抗CD62L–FITC、抗CD3–FITC，抗CD25–PE和抗FoxP3–APC对TCR转导的Treg或非转导Treg进行染色。(B类)CD4细胞+在T细胞缺失的BL/6 APC和1μg/ml抗CD3存在下，将BL/6小鼠的T细胞与越来越多的TCR转导的Tregs（黑条）或具有直接同种异体特异性的非转导Tregs共同培养。CD4细胞+T细胞（仅CD4）或Treg细胞系（CD25+仅）用T细胞缺失的脾细胞和抗CD3作为对照。在第3天通过以下方法测量T细胞增殖[三H] 胸腺嘧啶掺入。误差条表示一式三份进行的实验的平均值±标准差。
通过转导和内源性TCR激活可诱导抗原特异性抑制。
在确定逆转录病毒转导没有改变Tregs的抑制能力后，我们测试了这些细胞对抗原特异性抑制的能力。首先，将TCR转导的Tregs与来自TCR75转基因小鼠的具有相同间接同种异体特异性的T细胞共培养(16，17)。当Tregs与T效应器的比例为1:1时，增殖抑制率大于90%（图A） ●●●●。其次，检测转导细胞对连锁抑制的影响。OT-2 T细胞，对H-2A呈现的OVA肽具有特异性b条，用作应答细胞。OT-2细胞与Tregs和BL/6 T细胞缺失的APCs共培养，APCs同时用OVA和K刺激d日肽。非转导Tregs和GFP转导Tregs均未抑制OT-2增殖。然而，TCR转导的Tregs在K的存在下抑制OT-2的增殖d日肽（图B） ●●●●。如图所示C、 虽然在缺乏K的情况下可以看到OT-2增殖的适度抑制d日当Kd日将肽添加到用OVA肽脉冲的BL/6 T细胞缺失的APC中。此外，TCR转导的Tregs保留了由其内源性TCR介导的抑制功能，具有直接的异体特异性。当H-2Ad日–限制性OVA特异性DO11.10 TCR转基因T细胞被用作应答者，H-2A激活Tregsd日OVA肽上表达的同种异体抗原-脉冲BALB/c T细胞-缺失的APC抑制DO11.10增殖（图D） ●●●●。总之，这些结果表明TCR转导的Tregs在通过转导或其内源性TCR激活抗原特异性后增强了抑制功能。一旦被激活，它们就能够进行连锁抑制。
同种抗原特异性TCR转导的Tregs可抑制CD4+CD25型——以抗原特异性方式应答。(A类)TCR75 TCR-转基因CD4+T细胞要么单独培养（黑条；TCR75），要么与TCR转导的Tregs（灰条；TCR 75+dTreg（TCR））以1:1的比例在T细胞缺失的BL/6 APC和不同量的K存在下共同培养d日肽。(B类)OT-2 TCR-转基因CD4+T细胞与直接特异性Treg系、GFP-转导的Tregs或TCR-转导Tregs在T细胞缺失的BL/6 APCs和1.0μg/ml Kd日肽和0.5μg/ml OVA肽。未培养Tregs（白条）的OT-2细胞作为对照。(C类)OT-2 TCR-转基因CD4+在T细胞缺失的BL/6 APCs和不同量的Kd日肽（0、0.3、1.0μg/ml）和0.5μg/ml OVA肽。未培养Tregs（蓝条）的OT-2作为对照。(D类)DO11.10 TCR-转基因CD4+T细胞与TCR转导的Tregs在T细胞缺失的BALB/c APC和0.5μg/ml OVA肽的存在下共同培养。以不含Tregs的DO11.10培养物（DO11.10）为对照。在第3天通过以下方法测量T细胞增殖[三H] 胸腺嘧啶掺入。误差条表示一式三份实验的平均值±SD。
TCR转导的Tregs能够以抗原特异的方式在体内扩增。
研究表明，Tregs向次级淋巴器官的迁移对于控制体内T细胞启动至关重要(18)。因此，检测了TCR转导的Tregs迁移到次级淋巴器官并对其同源抗原作出反应而增殖的能力。将CFSE标记的TCR转导的Tregs注射到BL/6或BL/6.K中d日老鼠。转移后第3天，处死小鼠并检查CFSE稀释度。如图所示，在淋巴结和脾脏中均检测到CFSE阳性细胞，表明它们保留了次级淋巴器官的生存能力。此外，转移的细胞在BL/6.K体内广泛增殖d日小鼠，其中Kd日分子既直接存在也间接存在。BL/6小鼠的增殖很小。此外，扩张优先发生在抗原激发部位。当CFSE标记的TCR转导的Tregs被转移到接受BL/6.K的BL/6小鼠中时d日皮肤移植后，脾脏和肠系膜淋巴结中未检测到Tregs的增殖，但移植淋巴结中的细胞增殖和扩张（图)。此外，在携带CBA皮肤移植物的动物中，甚至在移植物训练淋巴结中也未检测到细胞分裂，这证实了注射细胞的抗原特异性。
TCR转导的Tregs可以迁移到次级淋巴器官，并在存在特异性抗原的情况下在体内扩张。TCR转导的Tregs（5×106)用1μM CFSE标记，静脉注射到BL/6或BL/6.Kd日老鼠。三天后，小鼠被处死。采集淋巴结和脾脏。用抗CD4–APC对来自淋巴结和脾脏的细胞进行染色。通过CFSE稀释液的流式细胞术分析细胞的体内增殖。对CFSE阳性细胞进行门控分析。显示门控区CFSE阳性细胞的百分比。
TCR转导的Tregs在抗原激发位点扩增。TCR转导的Tregs（5×106)用1μM CFSE标记并静脉注射到BL/6小鼠。移植后一天，小鼠接受BL/6.K的皮肤移植d日捐赠者或CBA捐赠者。在移植后第12天处死小鼠。采集移植物引流淋巴结、肠系膜淋巴结和脾脏。来自不同淋巴结和脾脏的细胞用抗CD4–APC染色。通过CFSE稀释液的流式细胞术分析Tregs的体内增殖。对CFSE阳性细胞进行门控分析。
TCR转导的Tregs可以控制体内的间接同种异体反应。
本研究的最终目的是使用具有异体特异性的Tregs在完全不匹配的菌株组合中诱导移植耐受。首先，在皮肤移植模型中评估TCR转导的Tregs的体内特异性和抑制功能。BL/6受体在BL/6.K移植前1天注射Treg细胞系d日皮肤移植。BL/6.K的中位生存时间（MST）d日BL/6小鼠的皮肤移植是15天（图)。静脉注射具有直接和间接同种异体特异性的TCR转导的Tregs显著延长BL/6.Kd日移植物存活率（MST，24天），而过继性转移非转导Tregs-缺乏间接抗Kd日特异性，但具有抗BALB/c特异性，并且不能识别完整的Kd日分子由于其CD4性质-没有延迟移植物排斥反应（MST，15天）[无细胞：P（P）< 0.01; dTreg公司：P（P）< 0.01; autoTreg:P（P）< 0.05; dTreg（TCR）治疗组与其他组]。此外，转移自体BL/6 DC刺激产生的自体反应性Treg细胞系并不能延长移植物存活时间。这些数据表明，TCR转导的针对移植表达的同种异体抗原的Tregs可有效控制体内间接同种异体反应，并证明抗原特异性与体内抑制功能的有效性相关。
TCR转导的Tregs延长BL/6.Kd日完全免疫活性小鼠的皮肤移植存活率。TCR转导的Tregs（5×106;n个=4），具有直接同种异体特异性的非转导Tregs(n个=5），或Tregs用自体BL/6 DC扩张（AutoTreg；n个＝4）静脉注射到BL/6小鼠中。移植后一天，小鼠接受BL/6.K的皮肤移植d日捐赠者。WT BL/6收件人(n个=4）接枝BL/6.Kd日未注射Treg的皮肤作为对照。
TCR转导的Tregs联合雷帕霉素和抗CD8抗体可诱导完全免疫活性小鼠的不确定移植物存活。
尽管有许多研究表明Tregs诱导的实验性移植耐受性，但许多研究都是基于Tregs和T效应物在淋巴细胞减少小鼠中的过继转移或微小的不匹配。图中显示的数据清楚地证明TCR转导的Tregs具有抑制完全免疫活性受体中的间接同种反应的能力。然而，BL/6.K中没有实现长期移植物存活d日皮肤移植模型。在单倍型匹配菌株组合的心脏移植模型中研究了移植耐受的诱导。有人认为，单用Treg治疗可能不足以诱导耐受，而修整同种反应性T细胞池可能是Treg有效的必要条件(19)。此外，已经证明Tregs在控制CD8应答方面不如体内CD4应答有效。然而，在拉格牌手表–/–小鼠，Tregs阻止CD4介导的移植物排斥反应+T细胞仅延迟CD8介导的移植物排斥反应+T细胞，可能是由于连锁抑制(20)。此外，研究表明CD8的独立靶向性+在几种移植模型中，T细胞可以将无效的治疗方案转化为有效的治疗方案(21)。根据这些观察结果，使用血管化心脏移植模型对消耗抗CD8抗体和Tregs的组合进行了测试。BL/6小鼠在第0天接受了B6D2F1心脏移植，并将抗CD8抗体（在第1天和第1天静脉注射250μg）与仅含直接抗-H-2的Tregs联合d日特异性或对H-2具有直接和间接特异性的转导细胞d日同种抗原（第1、7、14和21天静脉注射）。注射具有直接异特异性的Tregs导致移植物存活率略有延长，但心脏移植仍然被排斥，MST为34天（抗CD8治疗的MST为25.5天），与之前的研究结果一致，仅控制直接途径不能提供足够的移植物保护来诱导耐受(22)。相反，注射具有直接和间接异体特异性的TCR转导的Tregs，可使心脏移植物长期存活（MST，>150天）（图A） 这表明，这两种途径的共同调控对该菌株组合的耐受性诱导很重要。CD8（CD8）+在第100天分析移植动物时，T细胞计数已恢复到正常水平（数据未显示），长期存活的心脏显示心肌结构正常，内膜无明显增生（图B） ●●●●。
TCR转导的具有直接和间接特异性的Tregs需要在完全免疫活性的小鼠中诱导长期移植物存活。(A类)B6D2F1心脏移植到BL/6受体。在第-1天和第1天通过静脉注射250 mg抗CD8抗体实现短期CD8 T细胞耗竭。TCR转导的直接同种异体Tregs（5×106;n个=4）或具有直接同种异体特异性的非转导Tregs(n个=6）在第1、7、14和21天静脉注射到BL/6小鼠中。WT BL/6受体的抗CD8抗体不含Tregs作为对照(n个= 6). (B类)移植后第100天采集的心脏移植物被固定，并用H&E染色和弹性蛋白/van Gieson染色进行染色（原始放大倍数×400）。
将完全错配的BALB/c心脏移植到BL/6小鼠中，在一个更具挑战性的菌株组合中，进一步测试了异体特异性TCR转导的Tregs与异体反应性T效应细胞缺失相结合的疗效。然而，已经证明Tregs和CD4的过继转移+在BL/6中，效应细胞即使以1:1的比例也不能控制CD4介导的BALB/c排斥反应拉格牌手表–/–收件人(20)。因此，在治疗中添加了短疗程雷帕霉素（1 mg/kg/d，每天一次，第1至13天）。这种免疫抑制剂可以显著减少同种异体反应性T细胞池，而不会损害Tregs的功能(23——26)。如图所示A、 与单独抗CD8治疗相比，抗CD8抗体加雷帕霉素单独治疗延长了移植物存活时间（MST，59天）。当TCR转导的Tregs同时具有直接和间接同种异体特异性时，观察到不确定生存期（MST，>150天）。此外，在这种菌株和治疗组合中，添加仅具有直接同种异体特异性的Treg株也会导致心脏移植存活时间延长（MST，107天）。然而，在接受双重特异性Treg品系或仅直接特异性Treg品系小鼠的心脏组织学上观察到差异。接受TCR转导的Tregs的动物的长期存活心脏具有直接和间接的异体特异性，显示出正常的心肌结构，心肌细胞排列有序（图E） 以及正常心肌细胞和血管系统（图F、 黄色区域），新生内膜增厚较少（图G） ●●●●。相反，只接受直接同种异体特异性Treg系的动物移植的血管病变进展，新生内膜增厚形成（图D） ，心肌结构异常（图B） ，以及一些心肌细胞被胶原和纤维组织取代（图C、 红色区域）接近正常心肌细胞（图C、 黄色区域）。此外，接受TCR转导的Tregs直接和间接同种异体特异性的动物的心脏移植显示较低的平均管腔闭塞（10.07%±2.30%，n个=61个血管横截面），与接受直接同种异体特异性Treg线的患者相比（29.52%±3.81%，n个=62个船舶横截面）（图H） ●●●●。体外分析未能检测到T细胞对BALB/c DC或K细胞的反应有任何差异d日长期存活的小鼠和以混合淋巴细胞反应拒绝移植的小鼠之间的肽（数据未显示）。总之，我们的数据表明，即使在严格的同种异体移植模型中，通过将过继治疗与双特异性Tregs相结合，以及使用抗CD8抗体和短期雷帕霉素治疗，也可以实现长期移植物存活。
TCR转导的Treg治疗与其他治疗相结合，可以在完全免疫活性的小鼠中诱导对完全不匹配的心脏移植的耐受性。(A类)BALB/c心脏移植到BL/6受体。短期CD8+在第1天和第1天通过腹腔注射250 mg抗CD8抗体实现T细胞耗竭。雷帕霉素（Rapa）治疗在第-1天到第14天之间静脉注射（1 mg/kg/d）。TCR转导的Tregs（1×107;n个=4）和非转导的直接同种异体Treg(n个=4）在第1、7、14和21天静脉注射到BL/6小鼠。WT BL/6抗CD8受体(n个=3）或雷帕霉素加抗CD8(n个＝3）而不使用Tregs作为对照。(B类——H（H）)移植后第150天收获的心脏移植物被固定并用H&E染色(B类和E类)和弹性蛋白/范吉森染色(C类，D类，F类、和G公司)（原始放大倍数，×400）。箭头表示内部弹性层。N、 新生内膜；M、 动脉中层。(H（H）)对管腔闭塞的图像进行了定量分析，共分析了123条血管。数据表示平均值±SEM*P（P）<抗CD8+dTreg+Rapa和抗CD8+dTreg（TCR）+Rapa组之间为0.0001。
讨论
众所周知，MHC同种抗原由两种途径识别，即直接和间接。虽然这两种途径都可以独立影响啮齿类动物模型的移植排斥反应，但高频直接途径很可能是急性早期排斥反应的主要驱动因素，低频间接途径在以后的时间点发挥更重要的作用(27)。在这项研究中，我们设计了自然发生的Tregs，以创造一个能够针对这两种同种异体反应的群体。这些细胞被选择用于直接同种异体特异性和逆转录病毒转导以产生间接同种异体特异性，保留了它们的抑制效力并在体外介导了相关抑制，被贩运到抗原可用性的淋巴结引流部位，延长了体内移植存活时间。此外，具有双重特异性的Treg系过继治疗与单独抗CD8抗体或抗CD8与雷帕霉素联合治疗有效结合，以诱导半错配和完全MHC错配移植物的长期存活。然而，在后一种菌株和治疗组合中，只有直接异特异性的Tregs在延长移植物存活方面的效果仅略差。然而，存活时间长的心脏移植物的组织学外观存在显著差异。接受双重特异性Tregs的心脏具有正常的心肌结构；与此形成鲜明对比的是，注射了Treg系且仅具有直接同种异体特异性的小鼠心脏显示出血管损伤、新生内膜增厚的形成以及异常的心肌结构。
TCR基因转移用于抗原特异性免疫治疗的潜力最近在癌症研究中得到证实(28)。这是我们所知的通过TCR基因转导赋予Tregs所需特异性的第一份报告。这个动作有几个好处。首先，它允许大量富集具有所需特异性的细胞。早期在小鼠和人类系统中选择具有间接同种异体特异性的Tregs的尝试效率低得多。使用人类细胞和HLA-DR1:A2四聚体作为读数，我们能够在异肽脉冲自体DC重复体外刺激后检测到9%的四聚体阳性细胞。据推测，四聚体阴性细胞是自身反应性的(15)。相反，在TCR转导和随后的抗原刺激后，超过50%的Tregs表达相关受体。这种方法可以避免费时费力的选择以及抗原特异性Treg体外扩增所需的培养程序。Masteller等人探索了一种替代方法。使用涂有重组MHC II类肽复合物和抗CD28抗体（MHC II：肽/抗CD28珠）的珠来扩增抗原特异性Treg。尽管这种方法可以避免自身反应细胞的扩张，但它也引发了另一个问题。以这种方式扩增的Tregs在控制自身免疫性糖尿病方面不如从TCR转基因小鼠扩增的Tregs有效。缺乏疗效可能是由于使用包衣珠时，由于配体密度高，抗原亲和力低的Tregs扩张所致(29)。TCR转移研究表明，高亲和力TCR向T细胞的转导伴随着亲本T细胞亲和力的维持(30，31)表明通过转导高亲和力TCR，可以避免选择低亲和力Tregs的问题，并可以进一步提高T细胞的功能效能。
第二，这些具有明确异体特异性的高度富集Treg的产生提供了一个机会，解决了与此Treg群体在移植中的临床应用有关的一个关键问题，即同源抗原的特异性是否是一个优势？一些实验和临床研究已经证明使用多克隆Tregs的益处，特别是在抑制GVHD方面(2，32——34)。考虑到连锁抑制现象，可以认为这些细胞的自身抗原特异性足以达到预期效果，其依据是以肽形式呈现供体MHC同种抗原的受体DC将同时呈现自身抗原肽。为了抑制直接同种异体反应，与MHC同种异体抗原发生交叉反应的细胞的频率可能高到足以将注射细胞靶向体内同种异体活性部位。这里提供的数据的明确含义是，供体同种抗原的特异性比自身反应人群具有显著优势。这一发现为这一观察提供了一种解释，即TCR转导的细胞被运输到次级淋巴器官，并在淋巴结中分裂，引流出有同种抗原的部位。当注射多克隆细胞时，可以假定它们分布在所有淋巴组织中，从而产生主要的稀释作用。在之前的一项研究中，我们报道了通过重复同种异体抗原刺激选择用于间接同种异体特异性的Treg系，可以在携带相关抗原的接受皮肤移植的引流淋巴结和移植本身中检测到(13)。这些发现表明，抗原特异性细胞在抑制作用上更有效，过继转移后可能在体内长期存活。此外，在本文研究的两种菌株组合中注射具有直接和间接同种异体特异性的Tregs可诱导长期移植物保护，这一发现对基于Treg的治疗具有重要的治疗意义。最近的一份报告提供了证据，证明仅具有直接同种异体特异性的Tregs不能预防慢性排斥反应（在DBA-into-BL/6组合中），并且为了在预防移植排斥反应方面取得最佳疗效，具有直接和间接同种异体特异性的Treg是必要的(22)。根据这些发现，我们证明，在半不匹配心脏移植模型中，与具有直接特异性的Tregs相比，具有直接和间接特异性的Tregs具有更好的保护作用。在完全不匹配的菌株组合中，具有直接特异性的Tregs也能诱导一些动物的无限存活。然而，对仅具有直接抗供体同种异体特异性的Tregs治疗小鼠的心脏移植物的组织学分析显示出明显的排斥迹象。有趣的是考虑dTreg（TCR）细胞的双重、直接和间接异体特异性的可能意义。有两个关键的考虑因素：第一，菌株组合中的哪些细胞有望表达两种TCR特异性识别的配体；第二，移植后供者MHCⅡ类表达多长时间才能刺激dTregs。为了回答第一个问题，在B6D2F1与BL/6的结合中，由于H-2的组成性表达，表达这两种配体的主要细胞将是供体DCd日II类和K的本构处理d日以及随后H-2A的介绍b条在这种菌株组合中，dTreg（TCR）细胞的双重刺激可能增强了其效力和随后的疗效。相反，在完全不匹配的组合中，直接刺激来自供体细胞，间接刺激来自受体细胞。尽管小鼠心脏上II类表达相对较少，但BALB/c-into-BL/6组合中dTregs的部分疗效可能反映了其在移植物中的积累以及通过持续低水平的H-2持续激活d日第二类。
20世纪90年代末，Turka和Strom的联合研究强调，如果要实现对MHC不相容性的耐受，需要删除大量具有直接同种异体反应性的T细胞(35)。这反映了一个简单的事实，即同种异体反应性T细胞库的规模太大，无法管理，例如，通过调节，除非减少这种库。有鉴于此，我们将工程Tregs的过继治疗与2种辅助治疗相结合：消耗抗CD8单克隆抗体以暂时降低CD8反应和短程雷帕霉素。应该强调的是，这两项措施都是暂时的；CD8（CD8）+移植后数周内T细胞数量恢复，雷帕霉素仅在前2周内使用。重要的是，Strom和他的同事已经证明雷帕霉素可以导致T细胞缺失，这是由于IL-2介导的激活诱导细胞死亡，同时在体内保存Tregs(19).
综上所述，我们的结果表明，构建Tregs对供体抗原具有同种异体特异性的策略，以及将这些细胞的给药与其他不会破坏Treg介导效应的免疫抑制方法相结合的策略具有临床潜力。此外，这种方法也应适用于已知自身抗原的自身免疫性疾病状态。
方法
小鼠、培养基、试剂和抗体。
BL/6（H-2b条)，BALB/c（H-2d日)，BL/6×DBA2 F1（H-2）b条×H-2d日; B6D2F1）和CBA（H-2k个)从Charles River Laboratories购买6-8周龄的小鼠。OT-2、DO11.10、BL/6.Kd日（转K基因BL/6d日)，和TCR75（识别K的TCR转基因小鼠d日肽：H-2Ab条) (17)小鼠在伦敦国王学院生物服务部（新狩猎馆）饲养。DO11.10小鼠是Domenico Spina（伦敦国王学院）赠送的礼物。所有动物实验程序均获得英国内政部批准。RPMI 1640培养基补充我-所有体外试验均使用谷氨酰胺（Gibco，Invitrogen）、青霉素/链霉素（Gibco-Invitrogin）和10%（v/v）FCS（Harlan）。对于细胞纯化和清洗步骤，使用添加2%FCS的RPMI 1640培养基。抗CD4–APC（克隆CT-CD4）来自Caltag，Invitrogen。抗CD4–FITC（克隆GK1.4）、抗CD25–PE（克隆PC61）、抗TCRVα11.1/2-PE（克隆RR8-1）和抗TCRV-β13-FITC（克隆MR12-3）购自BD Biosciences-Pharmingen。抗-FoxP3–APC（克隆FJK-16s）来自eBioscience。
小鼠CD4的制备+CD25型——和CD4+CD25型+T细胞。
取BL/6小鼠脾脏和淋巴结。CD4细胞+使用CD4阴性分离试剂盒（Dynal，Invitrogen）制备T细胞。纯化的CD4+然后将T细胞与生物素化的抗CD25抗体（克隆7D4；BD Biosciences-Pharmingen）在冰中孵育20分钟，然后与链霉亲和素微珠（Miltenyi Biotec）在10°C下孵育15分钟。CD4细胞+CD25型——从CD4中分离出T细胞+CD25型+T细胞通过MACS柱。未结合部分含有CD4+CD25型——T细胞。CD4细胞+CD25型+从柱中洗脱T细胞。流式细胞仪检测细胞纯度。
DC的生成。
Steinmen等人的方案用于从骨髓中生成DC(36)。简单地说，骨髓细胞（5×105/ml）用抗CD8、抗CD4、抗B220和抗MHC II类上清液（YTS169、YTS191、RA34.5、M5/114）的混合物处理30分钟。抗体处理后，用山羊抗鼠IgG Dynal珠（Invitrogen）清洗细胞并孵育30分钟。富含前体细胞的未结合细胞与含有5%（v/v）GM-CSF分泌转染细胞系上清液的10%FCS RPMI 1640培养。在第2天和第4天，去除非粘附细胞。将含有GM-CSF的新鲜培养基加入到粘附级分中用于继续培养。从第6天开始使用细胞。
CD4的生成+CD25型+Treg线。
扩大同种抗原特异性CD4+CD25型+具有直接特异性的Tregs，细胞（2×106每周用未成熟的BALB/c DC（5×105/well）在24孔板中加入10 U/ml IL-2。为了以间接异体特异性扩大Tregs，自体BL/6 DC用K脉冲d日肽用于刺激。通过用自体BL/6 DC重复刺激产生自身反应性Treg系。为了维持TCR转导的Tregs，2×106/用K刺激Tregsd日54–68肽脉冲BL/6 DC（5×105/well）。
逆转录病毒构建物的制备和病毒生产。
利用BL/6 RNA制备的模板cDNA，PCR扩增间接异体特异性TCRα链cDNA（Vα11.2）和TCRβ链cDNA。拉格牌手表–/–TCR34脾细胞(16)。引物序列如下：对于TCRα链，5′-ATGCGCGGCCGC公司AAGACAACAGCGATGGAC-3′（正向）和5′-ATGCGAATTC公司CTCTGTCAGTCTGCAG-3′（反面）；对于TCRβ链，5′-ATGCGCGGCCGCATGGGCACCAGGCTTCTTGGC-3′（正向）和5′-TACGTAGAATTC公司ACATCTGGCTTCATGAGTTCTTTTGAC-3′（反面）（下划线表示限制位点）。正向引物引入NotI位点，反向引物引入EcoRI位点。通过测序证实这些片段，并将其克隆到PRE序列上游NotI和EcoRI位点之间的pMP71GPRE逆转录病毒载体中。
逆转录病毒上清液的产生和逆转录病毒转导。
为了制备逆转录病毒上清液，将TCRα和TCRβ构建物转染到Phoenix-Eco包装细胞中(37)由CaPO提供4转染。转染后第2天收集上清液。对于逆转录病毒转导，首先用DC和抗CD3（1μg/ml）激活T细胞48小时。然后将活化的细胞转移到RetroNectin涂层（Takara）24孔板（2×106至3×106/well）用50%（v/v）逆转录病毒上清液补充10 U/ml IL-2，并在37°C下培养24小时。取上清液，在添加IL-2的新鲜培养基中培养细胞。
T细胞增殖试验。
对于体外增殖试验，Tregs（5×104细胞/孔）用γ射线照射（30 Gy）的成熟DC（5×10三细胞/孔）。用于抑制实验，其中5×104细胞/孔OT-2或DO11.10被用作应答器，0.2μg/ml OVA肽（OVA323–334)和T细胞耗竭的脾细胞（1×105细胞/孔）用于细胞刺激。扩散评估由[三H] 胸腺嘧啶掺入在3天培养的最后18小时内。对于体内增殖，首先用1μM CFSE在37°C下标记细胞5分钟，然后用添加10%FCS的冰镇RPMI清洗两次，然后再悬浮在盐水溶液中进行静脉注射。在指定时间采集脾脏和淋巴结进行流式细胞术分析。
流式细胞术分析。
所有流式细胞术分析均在运行CellQuest软件的BD-FACScalibur上进行。用于表面染色，5×105将细胞与适当抗体的饱和浓度在黑暗中4°C培养30分钟，然后在冷FACS缓冲液（含1%[v/v]FCS和0.01%[w/v]叠氮化钠的PBS）中清洗两次，然后进行分析。
皮肤移植。
皮肤移植如前所述进行(13)。取下石膏模型后，每隔2-3天观察一次移植物。当存活皮肤少于10%时，移植被认为是被拒绝的。采用log-rank检验比较两组的移植物存活率。
异位心脏移植。
按照Niimi的描述进行了腹腔内异位心脏移植(38)。直接腹部触诊异位移植心脏用于评估移植存活率。排斥反应定义为完全停止心跳。直接可视化和移植物组织学检查证实了这一点。采用log-rank检验比较两组的移植物存活率。
组织学分析。
心脏移植物用石蜡包埋，切片，并用H&E和弹性蛋白/van Gieson染色以进行组织学评估。为了评估移植动脉硬化的严重程度，测定了每个移植血管的管腔闭塞百分比。用Image-Pro plus软件版本3（Media Cybernetics）追踪内弹性层和管腔，管腔闭塞百分比按以下公式计算：[（内弹性层面积-管腔面积）/内弹性层内面积]×100。
统计。
如图所示，数据表示为平均值±SEM或SD。两组间差异的显著性由未配对双尾学生的吨测试。P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。
致谢
我们要感谢E.Leung的技术帮助，Angela Giorgini在心脏移植部分的帮助，Domenico Spina提供DO11.10小鼠，以及A.Noble和M.Peakman对手稿的批评性阅读。这项工作得到了英国心脏基金会和RISET的支持。H.J.Stauss和S.A.Xue得到了白血病研究基金的支持。Y.Tanriver得到了德国研究基金会（Ta 436/1-1号拨款）的支持。
脚注
使用的非标准缩写：BL/6、C57BL/6；MST，中位生存时间。
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
本文引文： 临床杂志。投资。 118:3619–3628 (2008). doi:10.11172/JCI33185
乔瓦娜·隆巴迪（Giovanna Lombardi）和罗伯特·莱克勒（Robert Lechler）是联合资深作家。
工具书类
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