TRPV4-mediated disruption of the alveolar septal barrier: A novel mechanism of acute lung injury

Diego F. Alvarez; Judy A. King; David Weber; Emile Addison; Wolfgang Liedtke; Mary I. Townsley

doi:10.1161/01.RES.0000247065.11756.19

圆形Res。作者手稿；PMC 2008年10月7日提供。

以最终编辑形式发布为：

Circ Res.2006年10月27日；99(9): 988–995.

2006年9月28日在线发布。数字对象标识：10.1161/01.资源.0000247065.11756.19

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尼姆斯：美国国家卫生研究院13282

PMID：17008604

TRPV4介导的肺泡隔屏障破坏：急性肺损伤的新机制

迭戈·F·阿尔瓦雷斯,^1,^三朱迪·金,^2,^三大卫·韦伯,¹ 埃米尔·艾迪生,¹ 沃尔夫冈·利德克,⁴和玛丽·汤斯利^1,^三

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关联数据

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摘要

急性肺损伤破坏肺泡间隔屏障，导致斑片状肺泡水肿和低氧血症。虽然钙进入内皮细胞对屏障完整性的丧失至关重要，但在急性肺损伤中参与屏障破坏的阳离子通道尚未确定。我们假设香草醛瞬时受体电位通道TRPV4的激活会破坏肺泡隔屏障。通过免疫组织化学证实TRPV4在人、大鼠和小鼠肺泡隔壁的表达。在离体大鼠肺中，TRPV4激活剂4α-佛波醇-12,13-癸酸盐和5,6-或14,15-环氧碳三烯酸，以及已知的钙通过存储操作通道进入的激活剂thapsigargin，都增加了肺内皮通透性，通过测量过滤系数进行评估，以剂量和钙进入依赖的方式。然而，钌红阻断了对TRPV4激动剂的通透性反应，但对他司加金则没有。大鼠和小鼠肺的光镜和电镜显示，TRPV4激动剂优先在肺泡隔壁的内皮层和上皮层产生气泡或破裂，而thapsigargin破坏了肺泡外血管的内皮细胞间连接。TRPV4中没有对4α-佛波醇-12,13-癸酸盐的渗透性反应^−/−而对thapsigargin的反应保持不变。总之，这些发现表明TRPV4参与了肺泡隔屏障的破坏，并提示其参与了急性肺损伤的发病机制。

关键词：通透性、TRP通道、TRPV4、急性肺损伤

简介

急性肺损伤及其更严重的成人呼吸窘迫综合征以肺泡隔屏障破坏为特征，导致局部肺泡淹水和低氧血症¹.有效的临床治疗有限，死亡率仍然很高²^,^三这种内皮屏障的破坏通常依赖于钙的进入²⁺从细胞外空间⁴^,⁵例如，在完整的大鼠肺中，thapsigargin诱导的储存损耗和Ca²⁺通过存储操作通道进入增加内皮细胞通透性⁶^,⁷.靶向肺泡外血管内皮，而间隔微血管似乎未受损伤⁷^,⁸虽然源自肺泡外肺动脉和间隔微血管的内皮细胞具有不同的表型⁹^,¹⁰两者都有可能成为急性肺损伤的靶点，与肺泡外血管破裂相比，隔膜破裂更有可能促进肺泡淹水和损害气体交换。重要的是，Ca²⁺肺泡间隔室屏障完整性调节的进入途径尚未阐明。

数据一致表明，TRPC1和TRPC4是瞬态受体电位（TRP）通道的典型亚家族成员¹¹^–¹⁵，包含储存操作钙的亚单位²⁺肺内皮通道¹⁶^–¹⁸在离体大鼠肺中，TRPC4对凝血酶诱导的储存损耗的通透性反应减弱^−/−老鼠¹⁸此外，心力衰竭后大鼠肺中对thapsigargin诱导的储存耗尽的通透性反应的丧失与TRPC1和TRPC4的下调有关，TRPC1和TRPC4是正常在肺泡外内皮中表达的通道¹⁹在心衰模型中，对14,15-环氧碳三烯酸（14,15-EET）（一种P450环氧合酶衍生的花生四烯酸代谢物）的通透性反应的保持是令人感兴趣的，因为对thapsigargin诱导的储存损耗和对14,15-EET的通透性反应都依赖于钙²⁺条目。这一引人注目的观察表明，EET必须瞄准Ca²⁺肺内皮的进入途径不同于储存操作的通道。

我们建议Ca²⁺通过TRPV4进入，TRP通道香草醛亚家族的成员¹³^,²⁰^–²⁴对肺内皮通透性和屏障完整性的调节有重要作用。这个假设是基于几个观察结果：5,6-EET和8,9-EET与TRPV4和随后的Ca的激活有关²⁺主动脉内皮细胞进入²⁵^,²⁶、5,6-EET和14,15-EET增加大鼠和犬肺内皮通透性⁶^,²⁷对14,15-EET的通透性反应至少取决于细胞外钙的进入²⁺⁶在当前研究中，我们测试了Ca²⁺通过TRPV4进入调节肺内皮通透性和屏障完整性。此外，我们测试了Ca²⁺通过TRPV4的进入和通过存储操作的通道发生的进入在肺血管的不同空间隔室中引起屏障破坏。

材料和方法

动物

研究方案由IACUC批准，符合NIH《实验动物护理和使用指南》。成年雄性CD40大鼠（139只，查尔斯河）或8-10周龄TRPV4野生型小鼠（TRPV4^+/+)和空室友（TRPV4^−/−)²⁸分别用戊巴比妥钠（50mg/kg体重，静脉注射）麻醉男女（n=39）。肺部被隔离体外如前所述的灌注⁶.

TRPV4表达

根据机构审查委员会批准的方案获得的人类肺切除标本（n=3）通过浸泡在10%福尔马林或100%乙醇中进行固定。用4%多聚甲醛灌流大鼠和小鼠肺（每组2-3只）。切片（5μm）用山羊抗TRPV4多克隆抗体（Alomone）进行免疫组织化学处理，用二氨基联苯胺染色，用苏木精复染。从大鼠肺动脉和微血管内皮的裂解物（总蛋白40μg）和增强化学发光检测的TRPV4制备蛋白质印迹。对小鼠肺的总RNA进行逆转录，然后使用设计用于扩增TRPV4孔环区的引物进行PCR（参见补充数据).

急性肺损伤的显微镜评估

使用光学显微镜和透射电子显微镜（EM）评估戊二醛固定肺的结构变化¹⁹用载体（910μL乙醇）、4αPDD（大鼠或小鼠肺分别为3或10μmol/L）、14,15-EET（仅大鼠肺）或thapsigargin（150 nmol/L）治疗60 min（n=3/组）。使用1μm厚的切片，评估肺泡外血管袖带和肺泡灌流。袖带频率和袖带容积（V_c（c）)总壁体积分数（V_c（c）/V（V）_周)已确定，后者使用点计算策略²⁹通过透射电镜检查同一块的薄片（80 nm）。计数间隔毛细血管中的连接不连续性（间隙）、气泡或破裂，并使用点计数来确定肺泡液体积（V_自动飞行)牙槽间隙分数（V_自动飞行/V（V）_作为). 分别测定每个肺的袖带频率、体积分数和毛细血管气泡或破裂的平均值，然后得出每个组的总体描述性统计数据。

离体肺与内皮细胞通透性评估

用缓冲液（mmol/L:116.0 NaCl，5.2 KCl，0.9 MgSO）在恒定流量下灌注大鼠和小鼠肺₄，1.0钠₂高性能操作₄，2.2氯化钠_三，8.3 D-葡萄糖），含有4%牛血清白蛋白和生理性（2.2 mmol/L）或低（0.02 mmol/L）CaCl₂pH 7.4（38°C）。血流动力学和过滤系数（K_（f）)如前所述进行测量⁶^,¹⁹^,³⁰^,³¹，使用3区条件。K_（f）以7–10 cmH后13–15分钟获得的体重增加率计算₂肺静脉压增加，每克肺干重正常化。K_（f）是特定内皮细胞通透性和交换表面积的乘积，是表面积充分补充时肺内皮细胞通透性的敏感测量值³².

协议

在大鼠肺部灌注生理性[Ca²⁺]，K_（f）在基线检查时和使用TRPV4激动剂4α-佛波醇-12,13-二酸盐（4αPDD，1-10μmol/L，n=3/剂量）或TRPV1激动剂4β-佛波酯-12,13-二酸盐-20高香草酸盐（4-αPDDHV，10μmol/L，n=4）治疗60分钟后测量血流动力学。使用0.02 mmol/L[Ca²⁺]灌流液，K_（f）用4αPDD（3μmol/L）、5,6-EET或14,15-EET（3μol/L，Biomol）或thapsigargin（150 nmol/L），加或不加TRPV拮抗剂钌红（1μmol/L），在基线和治疗后45分钟（每组5例）测量血流动力学。随后，CaCl₂添加以实现生理[钙²⁺]（钙²⁺并在15分钟后重复测量。从TRPV4分离出的肺部^−/−用含4%白蛋白的缓冲液和生理〔Ca²⁺]. K_（f）在基线和使用溶媒（50μL二甲基亚砜）、4αPDD（10μmol/L）或thapsigargin（150 nmol/L）治疗60分钟后测量血流动力学。大鼠肺中的溶媒对照品（每组5个）包括乙醇（910μL或2%）或二甲基亚砜（50μL或0.1%）；在野生型小鼠（n=4）的肺部中也对二甲基亚砜进行了评估。将所有药物添加到灌流液中；记录最终循环浓度。

统计分析

定量数据以平均值±SEM表示。根据情况，使用配对t检验（双尾）或方差分析（ANOVA）比较各组平均值；纽曼-凯尔斯多重比较试验用于确定具体差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

大鼠和小鼠离体肺的基线参数

总肺血管阻力、血管阻力分布和基线K_（f）在大鼠和小鼠的肺中是相似的(表1)并且不受灌注液[Ca的选择影响²⁺]. TRPV4之间在基线测量方面没有差异^+/+和TRPV4^−/−老鼠。

表1

大鼠和小鼠离体肺的基线血流动力学和通透性

	大鼠肺		小鼠肺
灌注液[Ca²⁺]，毫摩尔/升	2.2	0.02	2.2
N个	51	76	23
体重，g	344±6	377±5	22±1
Q、 mL/min/g体重	0.041±0.001	0.037±0.001	0.055±0.002
Q、升/分/100克PLW	1.05±0.03	0.93±0.02	1.23±0.04
帕（厘米）₂O（运行）	17.0±0.1	14.8±0.2	16.5±0.3
Pc（立方厘米）₂O（运行）	10.2±0.1	9.0±0.1	10.4±0.2
Pv（立方厘米）₂O（运行）	4.0±0.0	4.0±0.0	4.2±0.1
Ra，厘米H₂O/L/分钟/100g PLW	6.8±0.2	6.4±0.2	5.0±0.2
Rv（立方厘米）₂O/L/分钟/100g PLW	6.1±0.2	5.5±0.2	5.2±0.3
Rt（立方厘米）₂O/L/分钟/100g PLW	12.9±0.4	11.9±0.3	10.2±0.4
K_（f），毫升/分钟/厘米高₂O/g干重	0.0102±0.0003	0.0106±0.0004	0.0123±0.0003

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Q、灌流；PLW，预测肺湿重⁵⁵^,⁵⁶; Pa，肺动脉压；Pc，肺毛细血管压力；肺静脉压；Ra，动脉血管阻力；Rv，静脉血管阻力；Rt，总血管阻力；K_（f），过滤系数。

TRPV4在肺部的表达：功能性后果

TRPV4在人、大鼠和小鼠的肺间隔室中表达(图1A-C以及细支气管上皮（未显示）。TRPV4也在人和大鼠肺泡外血管的平滑肌中表达。尽管TRPV4在培养的大鼠肺动脉内皮中的表达与微血管内皮相似(图1D)，TRPV4在完整肺的肺泡外血管内皮中没有持续表达(图1A-C). 在大鼠肺中，1、5和10μmol/L 4αPDD增加K_（f）分别增加1.7倍、4.2倍和5.6倍(图1E)支持TRPV4可能在调节内皮通透性中发挥作用的观点。相反，尽管使用了a>EC，但TRPV1激动剂4αPDDHV对内皮通透性没有影响₁₀₀剂量³³.确定TRPV4的激活是否增加了Ca的渗透性²⁺入门级独立时装，K_（f）使用低钙重新评估²⁺/钙²⁺追加备份策略。加利福尼亚州²⁺为低钙选择的浓度²⁺这些实验的一部分是基于允许稳定K的最低浓度_（f）至少1小时（参见补充数据). 钙²⁺加回来提供正常的向内Ca²⁺梯度，如果Ca²⁺钙处理激活了渗透通道²⁺进入结果和内皮通透性增加。K增加了约3倍_（f）4αPDD诱导明显依赖于钙²⁺条目(图2A)被钌红阻挡(图2B)通过与通道上的胞外结构域结合，有效阻断TRPV4²⁴^,³³我们确认大鼠肺对14,15-EET和thapsigargin的通透性反应为剂量-（参见补充数据)和钙²⁺与入口相关的(图2A)，并记录了5,6-EET的类似模式(补充数据和图2A). 0.02 mmol/L[Ca时²⁺]5,6-EET和14,15-EET均诱发渗透性小幅增加，尽管Ca²⁺对EET的正常渗透率响应的发展需要额外支持⁶.在缺乏钙的情况下²⁺add-back，K的增加_（f）在0.02 mmol/L[Ca中由14,15-EET诱导²⁺]（0.010±0.001至0.024±0.003 mL/min/cmH₂O/g干重，p=0.0007，n=5）是暂时的，K_（f）15分钟内恢复到基线水平（p=0.007）。钌红(图2B)阻止了Ca²⁺5,6-和14,15-EET渗透率响应的入口相关成分，但对Ca无影响²⁺对thapsigargin的进入依赖性渗透性反应。在没有治疗的情况下，0.02 mmol/L[Ca²⁺]对K没有影响_（f）有或没有Ca²⁺添加备份（请参阅补充数据). EET激活大电导钙²⁺-激活钾通道（BK_钙)，为Ca提供了增加的驱动梯度²⁺进入³⁴^,³⁵然而，封锁BK_钙通道没有改变EET诱导的渗透率响应（参见补充数据).

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图1

激活肺中表达的TRPV4可增加内皮通透性。在人类（A）、大鼠（B）和小鼠（C）的肺中，TRPV4在肺泡间隔室（左侧面板）和支气管上皮（未显示）中表达。TRPV4在人和大鼠肺中观察到肺泡外血管血管平滑肌中的表达（右图），而在小鼠肺中几乎没有。Western blotting（D）显示，TRPV4在大鼠微血管（MV）和肺动脉（PA）内皮细胞中的表达相似（两组的TRPV4/β-actin带密度均为1.1）。然而，TRPV4在完整肺（A-C）的肺泡外血管内皮细胞中并没有持续表达。TRPV4激动剂4αPDD增加了过滤系数K_（f）在离体大鼠肺中（p=0.021），呈剂量依赖性（p=0.002）*与1或5μmol/L相比，p<0.05。TRPV1激动剂4α-佛波醇-12,13-二癸酸-20-莫夫尼酸（4αPDDHV）无影响（p=0.201，配对t检验）。

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图2

激活TRPV4或存储操作通道可增加钙的渗透性²⁺入门级时尚。低（0.02 mmol/L）细胞外[Ca²⁺]（条纹条），K_（f）在基线（BL）和使用TRPV4激动剂4αPDD或EET或激活存储操作通道的thapsigargin治疗45分钟后测量。A决赛K_（f）Ca后15分钟测量²⁺添加备份（2.2 mmol/L，封闭条）。在治疗前15分钟添加溶媒（A）或TRPV拮抗剂钌红（1μmol/L，B组）。钙²⁺所有激动剂（A）的通透性反应都需要进入，但只有4αPDD或EET的反应被钌红（B）阻断。方差分析的P值显示在各组上方；事后测试确定了具体差异：*p<0.05 vs.BL，^#低钙时与激动剂相比p<0.05²⁺.

屏障破坏的分区

光学显微镜的形态计量分析结果(图3)和变速箱EM(图4)如所示表2与对照组相比，.4αPDD和thapsigargin导致大鼠频繁出现肺泡外袖套（p=0.006），但在小鼠肺中没有。尽管如此，V_c（c）/V（V）_周各组大鼠和小鼠肺组织无差异。TRPV4的激活导致大鼠和小鼠肺的间隔内皮细胞出现气泡或破裂（与对照组或thapsigargin相比，分别为p=0.009和p=0.019）。此外，TRPV4激动剂破坏了I型肺泡上皮细胞，表现为上皮细胞与基底层分离。4αPDD增加V_自动飞行/V（V）_作为与对照组和thapsigargin相比，在大鼠和小鼠肺中（分别为p=0.003和0.011）。当14,15-EET引起明显的间隔损伤时_自动飞行/V（V）_作为变量更大，因此4组方差分析不显著。相反，他司加金主要靶向肺泡外血管的内皮间连接复合体，导致间隙的形成；间隔毛细血管网备用，V_自动飞行/V（V）_作为没有增加。总之，这些数据支持这样的观点，即TRPV4的激活（通过4αPDD或EET）和存储操作通道的激活（经由thapsigargin）促进了肺离散血管室的屏障破坏，即使这些药物导致肺总钾的类似增加_（f）以Ca为单位²⁺入门级时尚。

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图3

肺泡外血管套扎的显微评估。在对照大鼠肺中很少观察到血管周围袖带（A）。由4αPDD（B）、14,15-EET（C）或thapsigargin（D）诱导的血管周袖套形成是异质的，当出现袖套形成时（箭头所示），袖套体积分数在各组之间没有差异（参见表2). 肺泡外血管常无不同的对照。比例尺为100μm。PA，肺小动脉；Br，细支气管；五十、淋巴管。

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图4

大鼠肺内皮细胞超微结构的评估。使用透射电子显微镜评估内皮细胞完整性。在使用载体或药物治疗1小时后，从戊二醛固定肺中随机选择块，并测量K值_（f）记录内皮通透性。显示了肺泡外血管（A-D）和间隔毛细血管（E-H）的典型显微照片。对照肺（A和E）保留了内皮超微结构，尽管偶尔观察到间隔毛细血管出现泡或破裂。4αPDD（B和F）和14,15-EET（C和G）很少改变接合形态。然而，这两种激动剂都会导致内皮细胞破裂，中隔毛细血管内皮细胞（F和G）出现气泡（星号），以及肺泡上皮细胞出现气泡（插图G）。Thapsigargin导致肺泡外血管（箭头，D）内皮细胞连接处出现缝隙，但对间隔室（H）没有影响。比例尺（A–H）为2μm；G中插入的比例尺为500 nm。

表2

肺泡外袖带和肺泡隔屏障破裂

	肺泡外血管，n	%带袖口的肺泡外血管	袖带体积分数，V_c（c）/V（V）_周	间隔毛细血管，n	每个毛细血管的气泡、破裂	肺泡液体积分数，V_自动飞行/V（V）_作为
		离体大鼠肺
控制	231	6.0 ± 3.6	0.158 ± 0.054	367	0.15 ± 0.05	0.008 ± 0.008
4αPDD	129	29.0 ± 2.6^*^†	0.320 ± 0.118	223	1.34 ± 0.25^*^‡	0.055 ± 0.007
14、15-EET	219	8.3 ± 5.2	0.237 ± 0.081	470	1.29 ± 0.36^*^‡	0.172 ± 0.157
Thapsigargin公司	190	36.2 ± 7.0^*^†	0.458 ± 0.089	397	0.33 ± 0.08	0.003 ± 0.003
		离体小鼠肺（TRPV4^+/+)
控制	434	13.8 ± 0.2	0.157±0.049	528	0.16 ± 0.03	0.012 ± 0.003
4αPDD	454	17.1 ± 4.9	0.254 ± 0.068	408	1.49 ± 0.42^*^‡	0.108 ± 0.027^*^‡
塔普斯卡菌素	348	21.4 ± 7.3	0.202 ± 0.025	403	0.28±0.15	0.015 ± 0.009

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数据为平均值±SEM（每组3个肺）。由于放大后无法显示整个血管的周长，因此未对肺泡外室的损伤进行量化。

^*与对照组相比p<0.05；

^†与14,15-EET相比p<0.05；

^‡与thapsigargin相比p<0.05。

钌红（一种阻断TRPV4的多效性拮抗剂）抑制了4αPDD和EET介导的通透性反应。虽然TRPV1的激活对大鼠肺的内皮通透性没有影响，但钌红有可能阻断其他TRPV亚型，从而影响通透性反应。因此，我们利用转基因小鼠靶向删除trpv4基因第12外显子²⁸，编码跨膜结构域5和6，包括预测的通道孔环区域（TRPV4^−/−). 基因分型（参见补充数据)和PCR(图5A)用于记录野生型小鼠中TRPV4的表达。而3μmol/L 4αPDD对TRPV4的渗透率没有影响^+/+小鼠，10μmol/L 4αPDD增加K_（f）2.8倍(图5B); 这个剂量没有改变K_（f）来自TRPV4的肺部^−/−室友。Thapsigargin增加K_（f）两个TRPV4均为3倍^+/+和TRPV4^−/−老鼠。这些结果证实，激活TRPV4可增加小鼠肺的内皮通透性。

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图5

激活TRPV4可增加小鼠肺的内皮通透性。A.使用设计用于扩增TRPV4孔环区域的引物，在野生型和杂合子小鼠中观察到预测的612 bp产物，但在无效动物中没有观察到。B.在离体小鼠肺中，我们发现TRPV4激动剂4αPDD（10μmol/L）增加了内皮通透性（K_（f）)仅在TRPV4+/+小鼠中（p=0.036，配对t检验）。相比之下，通过thapsigargin（150 nmol/L）激活存储操作通道增加了野生型和空白小鼠的通透性（配对t检验，分别为p=0.032和0.008）。这些结果证实了TRPV4在介导急性肺损伤中的作用*与基线相比，p＜0.05（配对t检验）。

讨论

本研究首次证明了TRPV4在肺内皮中的功能作用，这与TRPV4对Ca的作用有关²⁺肺泡间隔网络中内皮通透性和屏障完整性的入口依赖性调节。尽管对K_（f），TRPV4和储存操作通道的激活导致不同血管区室的损伤。4αPDD和14,15-EET激活TRPV4优先靶向肺泡间隔微血管，而thapsigargin诱导的储备耗尽靶向肺外血管。TRPV4激动剂通常会导致内皮泡和/或破裂，而thapsigargin会诱导内皮细胞连接处形成缝隙。这些数据表明，不同的内皮细胞隔室，以及可能不同的肺内皮细胞亚细胞隔室必须是继钙之后的靶向细胞²⁺通过这些TRP通道进入。Ca的观察²⁺通过钌红预处理大鼠肺，清除了对5,6-和14,15-EET渗透性反应的入口依赖性成分以及TRPV4激动剂4αPDD，表明TRPV4在调节肺内皮通透性中具有重要作用。TRPV4激动剂4αPDD在肺部对TRPV4的通透性反应丧失证实了这一观点^−/−老鼠。鉴于肺泡隔屏障在急性肺损伤中的严重脆弱性²^,^三我们在啮齿动物肺损伤模型中的发现以及人类肺泡隔中TRPV4表达的发现，使我们推测TRPV4可能在人类急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的发展中起作用。

TRP通道和渗透率

钙²⁺通过激活选择性钙进入内皮细胞²⁺通道或非选择性阳离子通道，如由TRP通道蛋白大超家族编码的通道。肺内皮细胞的焦点主要集中在TRPC亚家族。内皮细胞表达TRP通道的mRNA和蛋白，包括TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC6和TRPC7¹⁴^,³⁶^,³⁷在大鼠肺中，TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6/7蛋白在肺泡外血管内皮中表达。而包括TRPV4在内的一些TRPV亚家族成员的mRNA在人肺动脉内皮中表达³⁶，只有TRP蛋白的一个子集实际上可能在调节肺内皮通透性中发挥生理作用。两项研究探讨了TRPC通道在调节完整肺通透性中的作用。蒂鲁帕蒂等。据报道，TRPC4对凝血酶的渗透性反应部分丧失^−/−老鼠¹⁸我们最近发现，在心衰的主动脉-腔静脉瘘模型中，血管外血管中的内皮细胞TRPC1和TRPC4表达下调，并且对thapsigargin的通透性反应消失¹⁹.尽管Ca²⁺可通过接收器操作的TRP通道（TRPC3、TRPC6和TRPC7）进入³⁸^,³⁹这些通道确实在大鼠肺内皮中表达，用二酰甘油类似物激活这些通道对大鼠肺的内皮通透性没有影响¹⁹除了典型的TRP家族外，还没有研究TRP蛋白在肺内皮通透性调节中的作用。除了凝血酶和thapsigargin，我们不知道Ca²⁺内皮通透性的进入依赖性增加是由于TRP通道的门控，也不是与哪些TRP通道有关。我们之前的工作评估了花生四烯酸P450环氧酶衍生物EET对正常大鼠肺和慢性心力衰竭动物肺内皮通透性的影响⁶^,¹⁹支持钙的异质性概念²⁺-肺内皮通透性的依赖性调节。P450环氧酶代谢花生四烯酸形成四种区域异构体：5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET⁴⁰.EET在炎症激发后从人类肺部释放⁴¹表明它们可能参与急性肺损伤。在犬肺中，阻断EET合成可减轻乙氯洛韦引起的肺水肿和低氧血症⁴²此外，外源性5,6-EET和14,15-EET增加了犬和大鼠肺的内皮通透性⁶^,²⁷，单位：Ca²⁺依赖于入口的方式。EET必须针对Ca的概念²⁺与TRPC1/TRPC4不同的渗透通道基于以下证据：1）大鼠肺对EET和thapsigargin的渗透反应需要钙²⁺条目，2）在实验性诱导的心力衰竭后，对14,15-EET的反应保持不变，而对储存耗竭的反应消失，3）心力衰竭大鼠肺泡外血管中TRPC1和TRPC4表达下调⁶^,¹⁹我们目前的结果支持这样的观点，即肺间隔微血管内皮中表达的TRPV4在EET和4αPDD的通透性反应中起着关键作用。

TRPV4通道在肺泡间隔网络中的功能作用

TRPV4，一种最初被描述为被低渗激活的通道²⁰^,²³^,⁴³似乎参与检测细胞外液渗透压的变化²⁸虽然TRPV通道因其在感觉传导中的作用而受到重视⁴⁴^–⁴⁷，现在可以识别非感应功能²¹^,⁴⁸^–⁵⁰尼利乌斯及其同事的工作²⁵^,²⁶^,⁵¹提示TRPV4可能在内皮Ca中起重要作用²⁺发送信号。4αPDD和5,6-EET激活HEK-293细胞中异源表达的TRPV4以及主动脉内皮细胞中内源性TRPV4，促进Ca²⁺钌红抑制进入²⁶此外，EET诱导的钙²⁺TRPV4衍生的内皮细胞进入主动脉内皮细胞减少^−/−老鼠²⁵总之，这些数据表明TRPV4可能在Ca中发挥作用²⁺内皮通透性的入口依赖性调节。我们的结果为TRPV4在肺泡间隔网络中的表达提供了功能性作用²⁺入门级时尚。这种反应和钙²⁺钌红可以阻断对5,6-和14,15-EET的入口依赖性渗透率响应。此外，TRPV4中观察到的对4αPDD的渗透率响应^+/+小鼠缺乏TRPV4^−/−室友。

透射电镜证实，4αPDD和14,15-EET除了对间隔内皮屏障产生影响外，还导致了肺泡上皮细胞的破坏，这很可能是导致K增加的原因_（f）以及这些TRPV4激动剂诱导的肺泡灌流。TRPV4先前已被证明在呼吸道上皮细胞中表达⁵²^–⁵⁴尽管其在完整肺的细支气管或肺泡上皮中的功能作用尚未阐明。我们的结果表明，对连接Ca的信号级联的探索²⁺通过TRPV4进入肺泡I型细胞，将这些细胞从基底膜上分离出来，这将提供信息。

总之，这项研究为TRPV4在调节肺泡隔网络屏障完整性中的功能性作用提供了关键证据²⁺通过存储操作的TRP通道进入肺泡外血管会导致间隙形成，该室屏障破坏的功能后果可能与TRPV4依赖性室间隔屏障破坏的后果不同。激活肺泡外内皮细胞中的存储操作通道会导致血管周围袖带内的液体积聚，尽管这可能对肺泡气体交换影响不大。相反，脆弱的肺泡隔屏障被破坏，如钙²⁺经由TRPV4的流入导致肺泡泛滥并且因此可以预测会损害气体交换。事实上，这是急性肺损伤的标志。这项工作对转化生物医学研究的启示是，TRPV4可能是急性肺损伤治疗干预的一个新的分子靶点。

补充材料

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致谢

这项工作得到了国家卫生研究院拨款（HL081851和MH064702）以及美国心脏协会奖学金（0315049B）的支持。作者感谢Sue Barnes、Freda McDonald和Doug Drake的技术支持。

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