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视觉研究。作者手稿；PMC 2008年10月7日提供。
以最终编辑形式发布为：
Vision Res.2007年3月；47(5): 624–633.
2007年1月30日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.visres.2006.11.020
预防性维修识别码：PMC2562796型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院19231
PMID：17267005

杆状cGMP磷酸二酯酶基因β亚基错义突变引起的两种小鼠视网膜变性

B.张,1 N.L.霍斯,1 M.T.帕杜,2,三 A.M.德语,2 R.E.赫德,1 M.T.戴维森,1 S.Nusinowitz公司,4 K.伦加拉扬,2 A.P.博伊德,2 S.S.斯塔尔,2 R.C.乔杜里,2 J.M.尼克森,2 J.R.赫肯利,5和J.H船权2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

我们报告了两种新的遗传性视网膜变性小鼠模型的染色体定位、突变基因鉴定、眼部外观、组织学和功能分析钯6b第1版（“第页”, “第个或“无杆”）突变。其中一个菌株含有映射到小鼠第5号染色体的常染色体隐性突变。序列分析表明，视网膜变性是由杆状cGMP磷酸二酯酶（β-PDE）基因β亚基第13外显子的错义点突变引起的(钯6b). 该菌株的基因符号设置为钯6b第10行，缩写第10行此后。小鼠纯合子第10行该突变在出生后第16天（P16）出现组织学变化，在4周龄时出现硬化性视网膜血管，与视网膜变性一致。视网膜切片TUNEL和活化caspase-3免疫反应呈高度阳性，特别是在外核层（ONL）。ERG从来都不正常，但在P18时可以很容易地测量到杆和锥ERG的a波和b波，并且在两个月大时稳定下降超过90%。蛋白质提取物第10行视网膜β-PDE免疫反应阳性开始时间与野生型（P10）大致相同，但信号平均低于野生型的40%。有趣的是，养育第10行完全黑暗状态下的小鼠退化延迟至少一周，之后形态和功能丧失无规律地进行。第二种菌株与第1版小鼠发现，观察到的视网膜变性表型代表了一个可能的新等位基因钯6b测序证明杆状磷酸二酯酶基因β亚基外显子16中存在错义点突变，不同于第1版和第10行。该菌株的基因符号设置为钯6b137奈米，缩写137奈米此后。这种突变的纯合子小鼠在三周大时表现出视网膜变性，视网膜斑驳，视网膜血管呈白色。外显子13错义突变(第10行)是已知第二个突变等位基因首次在预期收益6b该基因可能为研究人类常染色体隐性遗传性视网膜色素变性（arRP）的发病机制提供了模型。它还可能为RP的实验性药物治疗提供更好的模型，因为其发病较晚，视网膜变性较轻第1版和137奈米.

关键词：小鼠模型，视网膜变性，视网膜色素变性，rd1，rd10，nmf137，PDE6b，β-磷酸二酯酶，视杆感光细胞，cGMP-PDE，视杆cGMP磷酸二酯酯酶基因β-亚基

介绍

最早报道的视网膜变性动物模型之一是“无杆视网膜”小鼠，Keeler将其描述为由常染色体隐性突变（基因符号，第页; (基勒1924)). 在受影响的动物中，视杆感光细胞大约在出生后第8天（P8）开始退化，到四周时就没有感光细胞了(基勒1924;基勒1966;Farber和Lolley 1974年;LaVail和Sidman 1974年;Pittler和Baehr 1991年). 视网膜变性之前，视网膜中积累了环磷酸鸟苷（cGMP），并与视杆感光细胞cGMP-磷酸二酯酶6型（cGMP-PDE）活性不足有关(Farber和Lolley 1974年;法伯和萝莉1976;Beavo，Conti，Heaslip，1994年). cGMP是脊椎动物光感受器中连接光能光子吸收和神经信号传递的关键信使分子。当光子被视紫红质吸收时，cGMP-PDE和转导蛋白被激活。cGMP-PDE催化cGMP降解为鸟苷-5′-单磷酸（5′-GMP），关闭cGMP门控的离子通道，最终产生视觉信号。因此，cGMP-PDE在光感受器将光转换为神经脉冲中至关重要(Yau和Baylor 1989年). 视网膜退化是由缺陷引起的Pde6b，编码杆状光感受器cGMP磷酸二酯酶6型β亚单位的基因，该基因包含一个内含子MLV病毒插入和一个无义点突变(Pittler和Baehr 1991年;Bowes，Li等人，1993年)（基因符号预期收益6b第1版; 缩写第1版此后(Beavo，Conti，Heaslip，1994年). 这对异常现象广泛分布于世界各地的近交系和野生系小鼠中(Pittler和Baehr 1991年;Bowes，Li等人，1993年;Clapcote等人，2005年). “无杆视网膜”突变被证明具有相同的序列异常，这表明这种突变在实验室菌株出现之前就有古老的历史(Pittler，Keeler等人，1993年).

人类基因催化结构域中的许多突变，PDE6B，在常染色体隐性视网膜色素变性患者中发现（arRP；OMIM 180072）(McLaughlin，Sandberg等人，1993年;McLaughlin，Ehrhart等人，1995年). 因此第1版小鼠和其他鼠种钯6b突变等位基因被认为是RP的动物模型。将其用作研究工具的兴趣仍然很浓厚。事实上，除了自然产生的菌株外，新菌株正在产生。Hart等人最近发表的数据表明，通过N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）突变诱导产生的几种新型Pde6b突变体的基因型和表型相关(Hart，McKie等人，2005年). 类似地，我们最近发现了两种新的小鼠菌株，它们在钯6b基因，预期收益6b第10行（缩写）第10行此后）(Chang，Hawes等人，2002年)和钯6b137奈米（缩写）纳米137下文）。这里我们详细描述了它们的基因型和表型。这个137奈米突变体退化的速度与rd1、，但在第10行这只老鼠比较晚，在黑暗中饲养可能会延迟，这表明它可能是一种有用的研究工具。

材料和方法

动物

本研究中的小鼠最初在马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室的研究动物设施中饲养，并在标准化条件下饲养，随后在佐治亚州亚特兰大的埃默里大学和退伍军人管理医院饲养。它们使用NIH31 6%肥肉和酸化水饲养，在常规设施中采用14小时光照/10小时黑暗循环，定期监测以保持无病原体环境。笼子内的光强度在50至200勒克斯下测量。的子集第10行老鼠在完全黑暗中饲养。所有实验均由各自的机构动物护理和使用委员会批准，并按照ARVO《关于在眼科和视力研究中使用动物的声明》进行。

原产地

钯6b第10行在断奶时发现CXB-1重组近交系视网膜血管呈白色(图1). 随后第10行通过与C57BL/6J重复回交，形成一个同源的近交品系（以下简称B6）来维持种群-rd10中，或者简单地说第10行应变。表型的主要方面在两种遗传背景上似乎没有差异。钯6b137奈米在基因突变筛查中发现B6小鼠被ENU诱变。第一代（G1)和第三代（G三)通过三代繁殖计划获得的小鼠分别进行了显性和隐性突变检测。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms19231f1.jpg

两个月大时不同鼠种的眼底外观：第1版（A） ，第10行（B） ，137奈米（C） 和C57BL/6J野生型（D）。视网膜变性第10行和137奈米菌株很容易与野生型和第1版两个月大时通过眼底镜检查的视网膜外观。

临床视网膜评估

在特征研究和连锁杂交中，所有小鼠都用1%阿托品滴眼液（佛罗里达州坦帕市Bausch and Lomb Pharmaceuticals Inc.）扩张瞳孔，并用78个屈光度透镜进行间接眼镜检查。观察到视网膜变性的迹象，如血管衰减和视网膜色素上皮改变。眼底照片是用Kowa Genesis小型动物眼底照相机拍摄的（日本东京Kowas）(Hawes，Smith等人，1999年).

组织学和形态计量学

对一周至三个月大的小鼠眼睛的塑料或石蜡切片进行组织学研究。对于塑料包埋，眼睛浸泡在冷固定剂中（1%多聚甲醛、2%戊二醛和0.1 M二甲氨基甲酸缓冲液），同时保持方向。将眼睛放置在固定剂中24小时，然后将其转移到0.1 M的冷二甲氨基甲酸缓冲溶液中再放置24小时。将样品嵌入甲基丙烯酸盐组织树脂中，以获得眼镜杯的上下横截面。使用组织刀在超切片机（美国伊利诺伊州Reichert Ultracut）上以0.05μm切割组织，并将其热固定在玻璃载玻片上。对于石蜡包埋，通过注射大约1μl 10%的缓冲福尔马林（Stephens Scientific，Riverdale，NJ）固定眼睛，然后在4°C下浸泡在相同的固定剂中30分钟，然后储存在PBS中以备后期处理。眼睛在连续的乙醇和二甲苯洗涤中脱水，在熔化的石蜡中洗涤（TissuePrep 2，Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ），并嵌入块中。在美国光学820旋转切片机（马萨诸塞州萨特布里奇）上对眼睛进行5μm切片。塑料和石蜡切片用苏木精-伊红（H&E）或1%甲苯胺蓝染色。

切片使用光学显微镜（Leica DMRB，Bannockburn，IL）进行分析。在放大20倍的Adobe Photoshop图像中获取了大约500微米的区域。横跨视网膜上下轴的四个区域是图像，其中两个区域位于视神经上方，两个位于视神经下方。对每张图像进行三次感光细胞核计数和视网膜厚度测量（内核层、神经节细胞层、感光细胞内段和感光细胞外段），并取平均值作为该区域的代表值。使用Image Pro Plus 5.0（马里兰州银泉市媒体控制学）对每只眼睛共五个部分进行平均。为了确保固定方案的选择不会改变每个场计数的细胞核数量，P18第10行从塑料植入眼和石蜡植入眼的六个切片（每个切片四个视野）中计数视网膜ONL核。每个场±SEM的平均计数为428±44，石蜡为501±50-对塑料包埋样品。双尾t检验分析表明，这些平均值在统计学上没有差异（p=0.274）。

视网膜电图

在过夜暗适应后，通过腹腔注射含有氯胺酮（80 mg/kg）和甲苯噻嗪（16 mg/kg）的生理盐水溶液对小鼠进行麻醉。在瞳孔扩张（1%硫酸阿托品）后，使用金或铂环电极（参考口腔中的金丝或面颊中的针电极）从一只眼睛的角膜表面记录视网膜电图（ERG）。放在尾部的针状电极用作接地。在角膜表面滴一滴甲基纤维素（2.5%），以确保电接触并保持角膜完整性。使用热水垫将体温保持在38°C的恒定温度。所有刺激物均在Ganzfeld圆顶中呈现（马里兰州盖瑟斯堡LKC Technologies）。记录了在4.0至5.0 log单位强度范围内对白光闪烁的罗德反应。在棒饱和背景（1.46 log cd/m2)暴露在背景光下10分钟后，允许完全适应光线。

在个人电脑中使用I/O板（型号PCI-1200；德克萨斯州奥斯汀国家仪器公司）对响应进行放大和过滤（0.03至10000 Hz）并进行数字化。在240毫秒的响应窗口内，每0.5毫秒采样一次信号。对于每种刺激条件，反应都是计算机平均值，对于最弱的信号，平均值可达20条记录。记录了年龄从P14到P63的33只rd10小鼠的反应。对14只C57Bl/6J小鼠从P18到P40进行了与野生型小鼠的比较。

β-PDE免疫反应性

从C57BL/6、C57BL/6J视网膜分离的蛋白质rd10/rd10，和C3H/HeJrd1/rd1在出生后第9至11天（P9-11）、P12-14、P15-17、P18-20和P60以及来自P60 C57BL/6的小鼠全脑，按照制造商的说明，使用WesternBreeze™化学发光试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行西方免疫印迹分析。主要抗体是针对一组混合合成肽产生的亲和纯化多克隆抗体，用于调节编码cGMP-PDE、H Q Y F G（K/R）K L S P E N V a G a C（亲和生物试剂，Golden，CO）β亚单位基因的人类和小鼠氨基酸序列之间的单次错配。在每个阶段处死三到四只小鼠，摘除眼睛，去除视网膜。使用微型离心管中的手持式电池动力杵（Pellet pestle Motor；Kimble/Kontes，Vineland，New Jersey），在制造商的裂解缓冲液中对每对视网膜进行均质化，然后在10000 g下离心10分钟。对P60野生型小鼠浸泡过的全脑的一部分进行类似均质化。将上清液转移到新试管中，并使用BCA方法（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）测定蛋白质浓度。使用4–12%梯度Bis-Tris ZOOM™凝胶（Invitrogen）对含有30μg蛋白质的等分样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，按照制造商的说明进行封闭，然后用PDE6b多克隆抗体（1μg/ml）孵育90分钟。按照制造商的指示清洗、用二级抗体孵育、化学发光底物和增强剂孵育。然后将柯达BioMax X射线胶片（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）暴露在污渍中不同时间。使用Epson Perfection 4870照片扫描仪对胶片线性范围内的曝光进行透射扫描，该扫描仪连接到运行Adobe Photoshop CS v.8（Adobe Systems，Inc.，San Jose，CA）的Apple Macintosh G5计算机（Apple Computers，Cupertino，CA）。信号密度是通过确定Adobe Photoshop图像上某一波段区域的净强度来计算的。

使用PDE6b多克隆抗体在小鼠视网膜切片上进行免疫组织化学。用P22 C57BL/6、，第10行、和第1版老鼠。将切片固定在4%多聚甲醛中的0.1 M磷酸盐缓冲液中，加0.03 M蔗糖在冰上浸泡20分钟，然后在室温下在PBS中的0.1%Triton X-100中渗透5分钟。切片用正常山羊血清封闭15分钟，与一抗（1μg/ml）孵育1小时，然后与FITC-结合的山羊抗兔IgG孵育（1:1000稀释；钙生物化学）。在用PBS-BSA清洗和用慢速褪色缓冲液（Molecular Probes，Eugene，OR）清洗两次后，将一滴慢速褪色光防褪色介质放在切片上，并将盖玻片放在载玻片上。然后用共焦显微镜观察切片并拍照。

细胞凋亡检测

通过TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）分析和抗活性caspase-3免疫反应性（分别为DeadEnd™荧光TUNEL系统和anti-active®caspase-3抗体；威斯康星州麦迪逊市普罗米加）在石蜡切片上评估细胞凋亡，并按照制造商的说明使用共焦显微镜。对于TUNEL，将切片脱蜡，再水化，用蛋白酶K处理，与TdT/核苷酸混合物（含荧光素-12-dUTP）反应，并用碘化丙啶反染色。对于活性caspase-3检测，将切片在0.1%triton x-100/PBS中渗透，然后与Anti-active®caspase-3抗体反应，然后与荧光素结合的驴抗兔抗体反应（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch）。将一滴防伪溶液（Molecular Probes，Eugene，OR）添加到含有纸巾的区域，安装盖玻片，并用指甲油密封边缘。使用尼康EFD-3显微镜（尼康，梅尔维尔，纽约州）和由Biorad LaserSharp 2000 v5.2软件控制的Biorad MRC 1024共聚焦装置（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA）通过荧光共聚焦显微镜观察切片荧光检测采用520nm发射和495nm激发，碘化丙（反染）检测采用617nm发射和535nm激发。

基因图谱

为了确定第10行我们交配的基因C57BL/6Jrd10/rd10小鼠到CAST/Ei小鼠。将未表现出视网膜异常的F1小鼠回交给C57BL/6Jrd10/rd10老鼠。如前所述，已分离出尾部DNA(Johnson，Gagnon等人，2003年). 对于PCR（聚合酶链反应）扩增，使用25 ng DNA，体积为10μl，含有50 mM KCl、10 mM 200μM dNTP和0.02 U Tris–Cl，pH 8.3，2.5 mM MgCl2，0.2 mM寡核苷酸，AmpliTaq DNA聚合酶。最初在94℃下变性3分钟的反应在94℃进行40次循环，15秒，51℃下1分钟，72℃下1 min，然后在72℃下最后延长7分钟。PCR产物在3%MetaPhor（FMC，Rockland，ME）琼脂糖凝胶上通过电泳分离，并用溴化乙锭染色后在紫外光下观察。最初，对混合DNA样本进行微卫星（Mit）DNA标记的基因组扫描(Taylor，Navin等人，1994年). 在检测到5号染色体上的连锁后，微卫星标记D5Mit157、D5Mit91、D5米特25对个人DNA样本进行评分。

基因鉴定/基因组测序

要测试钯6b作为候选基因，我们根据GenBank登录号中的mRNA序列设计了四对PCR引物X60133型,X57656毫米、和X87952型(表1). 对于直接测序，PCR反应放大到30μl；放大在36个周期内完成，在94°C下进行15秒的变性步骤，在60°C下退火2分钟，在72°C下延伸2分钟。使用Qiagen试剂盒（QiagenCo.）从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。通过自动荧光标记测序进行测序反应。根据标准程序从3周龄小鼠的脾脏中制备基因组DNA。使用TRIZOL LS试剂（GIBCO BRL）从新生小鼠视网膜中分离出总RNA，并使用SuperScript™预扩增系统（GIBCO-BRL）制作第一链cDNA。对于CfoI公司我们设计了另一对引物扩增基因组DNA以确认突变：Pde6b13F 5′-CTTCTATTCTCGTCAGCAAGC-3′和Pde6b13R 5′-CATGAGTAGGGTAAAACATGGTCTTG-3′。扩增在36个周期内完成，在94°C下进行15秒的变性步骤，在51°C下退火1分钟，在72°C下延伸1分钟。CfoI公司通过添加8μl PCR产物、1μl 10x缓冲液（SE缓冲液5）和2-5单位的CfoI公司（SibEnzyme）。

表1

用于小鼠的PCR引物钯6bcDNA扩增和测序

任命序列（5′-3′）碎片大小外显子
Pdeb1f公司TGTGAAGATGTTGGCTGGC公司7601–4
Pdeb1r公司CATCAAAGAACTCTTCTCCTTGG公司
Pdeb2f公司ctggtcagccaataaggtgtgtg7484–11
Pdeb2r公司中国民航总局
Pdeb3f公司AAAGAGCCTGACTGTGAGG公司90111–19
Pdeb3r公司TGAAACCACTTGCAGCTTAGG公司
Pdeb4f公司阿格卡特70015–22
Pdeb4r公司ACACGGCTTATAGGATACAGCAGG公司

之间的补充测试第1版应变和第10行和137奈米进行菌株筛选。影响第10行或137奈米纯合子与C3H/HeJ小鼠交配，这些小鼠为纯合子钯6b rd1突变。三名经验丰富的观察员（B.C.、N.L.H.和J.H.）通过眼底镜对F1代后代的后眼进行了目视检查，以确定视网膜退化的迹象。

结果

临床表型

第10行小鼠在4周龄时出现早期视网膜变性，视网膜血管硬化。Nmf137型24天龄时，小鼠的视网膜呈现斑点状，视网膜血管呈白色。这两个菌株的视网膜变性很容易与正常和第1版两个月大时眼底镜下的视网膜外观(图1).

组织表型

组织学检查显示第10行小鼠在16天时开始于中央视网膜，20天时扩散至周边视网膜（数据未显示）。到60天大时，未留下ONL（数据未显示）。ONL的Nuclei计数反映了这种下降(图2). 然而，内核层和神经节细胞层厚度没有受到影响(图3). 这个137奈米突变体在16日龄时表现出视网膜外核层的广泛变性，30日龄时视网膜中没有ONL残留。137奈米和第1版似乎比年观察到的变性更严重第10行突变体(图3). 深红色视网膜第10行小鼠通过P24未表现出退化(图3). 到P30时，ONL中的细胞核丢失变得明显，并且在以后的时间内发生变化（数据未显示）。黑暗饲养对第1版或137奈米视网膜变性。

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外核层（ONL）中的核数第10行小鼠视网膜随时间的变化。使用光学显微镜对一周至三个月大的小鼠眼睛的塑料或石蜡切片进行了研究。除出生后第15-16天的样本外，rd10切片的计数在所有阶段均显著低于C57/Bl6野生型（“C57”）的计数（p<0.001）。数据为平均值±SEM；条形图上方的数字是采样大小。统计分析采用ANOVA和事后学生-纽曼-凯尔斯多重比较测试。

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组织学第10行,第1版、和137奈米24日龄小鼠视网膜显示出相对程度的视网膜变性。通过该阶段，第10行周期性光照饲养小鼠的外核层（ONL）大约有四个核厚，而137奈米只有一个核厚第1版没有感光细胞核。相反，暗红色的ONL第10行小鼠在24天大时没有变薄，有大量的内节（IS）和外节（OS）。视网膜神经节细胞层（GCL）和内核层（INL）不随应变或照明方式的变化而变化。

ERG表型

纯合子记录的ERG第10行与野生型小鼠相比，小鼠的杆和锥反应降低。图4显示了在黑暗和光适应条件下，随着闪光强度的增加而记录的一系列ERG波形。面板A，第一列，显示了C57BL/6J野生型动物以杆为主的反应。注意，随着闪光强度的增加，正b波和负a波的振幅增加，隐式时间减少。相同的闪光强度导致了更小的响应第10行P18和P30的小鼠（面板A的第二列和第三列）。在第18页，直到0.6 log cd sec/m，才能看到a波2闪光强度。P30仅在最亮的闪光强度下出现一个小的a波，进一步说明了暗适应退化反应中灵敏度的丧失。面板B说明了C57Bl/6J和第10行老鼠。这个第10行与野生型反应相比，P18的所有闪光强度下的反应都较小，P30的锥体功能持续丧失。然而，请注意，随着第10行与暗适应b波相比，光适应b波。在P18处第10行暗适应反应为C57Bl/6反应的30%，而光适应反应为野生型反应的50%。同样，在第30页第10行与野生型相比，暗适应b波仅为10%，而光适应反应为30%。图5显示了暗适应和光适应记录的a波和b波振幅随年龄的减少。暗适应a波从P14快速下降至P30，P50无法记录(图5A，圈）。暗适应b波振幅从P14稳定下降至P63时小于15μV(图5A，三角形）。锥隔离反应的丧失较慢。到P63时，锥形隔离的a波是不可记录的，而b波的振幅小于6μV。在137奈米任何年龄的老鼠。

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C57BL/6J和第10行P18和P30的小鼠处于暗适应（A）和光适应（B）状态。夜间暗适应后记录暗适应反应，而背景光为1.46 log cd/m时记录光适应反应2在相同强度下暴露10分钟后。

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rd10小鼠ERG a波和b波振幅随年龄增长而下降。A） 罗德主导了暗适应反应。B） 锥形隔离光适应反应。误差条表示平均值的标准误差。

TUNEL分析

P18视网膜切片第10行与野生型视网膜相比，小鼠TUNEL阳性(图6). 信号是ONL特有的，INL和GCL中几乎没有信号(图6). P18中发现抗活性caspase-3免疫反应第10行内部段，但不是野生型。其他人中几乎没有发现抗活性caspase-3活性第10行视网膜层(图6).

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P18小鼠视网膜细胞凋亡。P18 C57野生型（A、C）和第10行（B，D）小鼠眼睛接受荧光TUNEL（A，B）或使用活化caspase-3（C，D）特异性抗体进行荧光免疫化学。切片用碘化丙啶复染。TUNEL阳性和活化的caspase-3阳性细胞发出黄绿色荧光。野生型切片显示几乎没有TUNEL信号（A），而第10行切片在外核层和偶尔在感光细胞的内段有丰富的TUNEL信号，但在视网膜的其他层没有（B）。野生型切片显示几乎没有激活的caspase-3免疫荧光（C），而第10行切片在感光细胞的内段有丰富的信号，但在视网膜的其他层（D）没有信号。缺乏一级抗体的对照染色无信号（数据未显示）。

β-PDE免疫反应

在野生型和第10行视网膜,但不是第1版视网膜或野生型大脑(图7，顶部）。免疫反应性第10行P9-11提取物中检测到野生型视网膜提取物。尽管所有通道中都装载了等量的蛋白质，但信号第10行在所有阶段，提取物均少于野生型(图7、顶部和中部）。提取物中未显示免疫反应第1版任何阶段的视网膜或P60野生型全脑(图7). Pde6b抗体仅标记P22野生型和第10行视网膜，但在第1版视网膜冷冻切片(图7，底部）。在野生型视网膜冰冻切片的免疫染色中省略一级抗体导致无信号(图7，底部）。

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β-PDE免疫反应贯穿整个发育过程。从C57BL/6（野生型；“wt”）中去除的视网膜蛋白提取物，第1版、和第10行在出生后第9天到第20天，用cGMP-PDEβ亚基特异性抗体对小鼠进行免疫印迹分析。此外，还检测了P60 C57BL/6的视网膜和全脑蛋白提取物。顶部面板：西方免疫印迹的代表性放射自显影。wt和第10行视网膜蛋白提取物，但不在第1版视网膜或wt脑提取物。蛋白质提取物的来源显示在车道上方。“Std”是“Magic Mark™”分子量标准（Invitrogen）。“肽”是一种合成的肽混合物，针对它产生了一级抗体（详见正文）。如垂直线所示，印迹取自单独的实验，具有代表性。中间面板：western blots P9-20数据的量化。扫描自拍照片。通过从条带的像素密度中减去背景像素密度来确定条带的净强度。每个品系每阶段3-4只小鼠的平均净强度。底部面板：免疫组织化学显示β-PDE一抗的特异性。P22中的眼睛冷冻切片第1版（A） 、重量（B）和第10行（D） 用β-PDE一级抗体和FITC-偶联二级抗体对小鼠进行检测。β-PDE抗体标记wt（B）和第10行（D） 光感受器，但在第1版切片（A）或wt切片，用二级抗体孵育，但不是一级抗体（C）。

遗传分析

遗传分析表明，这两种突变表型均为单常染色体隐性遗传基因。基因突变第10行菌株被映射到小鼠染色体（Chr）5D5密特7和D5密特291(图8)和基因符号钯6brd10/rd10（再次缩写第10行此处）被指定为小鼠视网膜退化系列。在补充测试中，受影响的第10行将小鼠与C3H/HeJ小鼠交配，该小鼠为纯合子第1版突变后，观察到所有F1后代都在早期受到影响，其中一些在21天时显示出一些白色视网膜血管，所有在28天时都显示出白色血管和斑驳的视网膜，并且视网膜外观与第1版66天时为纯合子。类似地，互补测试配对137奈米具有第1版小鼠在26天大时导致所有F1后代受到影响，这表明在137奈米代表可能的新等位基因钯6b这与第1版.

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A.96只老鼠从rd10/rd10对CAST/Ei进行表型和基因分型。在小鼠Chr 5上观察到与几个标记的连锁。方格列代表单倍型（填充框，rd10/rd10等位基因；开盒，CAST/Ei等位基因）。每一单倍型的染色体数目显示在每一列下面。B.Chr 5基因图第10行显示最接近标记的区域和人类同源区域。最接近标记的重组估计值（±标准误差）和顺序为D5密特91− 1.04±1.04 −rd10、D5Mit157− 1.04±1.04 −D5Mit25。

基因鉴定和基因组测序

自从第10行视网膜变性映射到小鼠Chr5附近第1版突变基因和等位性检测呈阳性钯6b基因很有可能是一个候选者。序列分析表明第10行视网膜变性是由第13外显子的错义突变引起的（一种新的突变将密码子560 CGC变为TGC；将精氨酸变为半胱氨酸，Arg560Cys）钯6b基因(图9A). 这个137奈米视网膜变性也由第16外显子的错义突变引起（一种新的突变将密码子659 CTC变为CCC；将亮氨酸变为脯氨酸，Leu659Pro）钯6b基因(图9B). 这个第10行突变导致a的丢失CfoI公司使我们能够对第10行聚合酶链反应/限制性片段长度多态性突变(图9). ). 为了证实错义密码子在rd10 Pde6b基因，我们从我们的连锁分析中重新检测了96个DNA（49只受影响和47只未受影响的小鼠）CfoI公司RFLP。我们扩增了一个Pde6b13F/Pde6b13%R97-bp基因组片段，其中包含一个CfoI公司正常等位基因中的位点和第10行等位基因。PCR扩增产物的消化CfoI公司来自野生型、纯合型和杂合型第10行DNA显示了预测的RFLP模式（野生型：54和43 bp的两条带；纯合子第10行一条97 bp的带；杂合的第10行：97、54和43 bp的三条带）(图9C). 该分析表明rd10/rd10表型和错义突变。因此，RFLP模式为验证是否存在第10行遗传分析中的等位基因。

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野生型（WT）等位基因第13外显子1678位（C至T）的单碱基替换周围的核苷酸序列和第10行等位基因钯6b第16外显子的基因（A组）和位置1976（T至C）显示为野生型等位基因和137奈米等位基因钯6b基因（面板B）。新的突变将基因中的密码子560 CGC改变为TGC（氨基酸变化：Arg560Cys）钯6b中的基因第10行小鼠（A组）和CCC密码子659 CTC（氨基酸变化：Leu659Pro）钯6b中的基因纳米f137小鼠（面板B）。PCR扩增产物的消化CfoI公司来自野生型C57BL/6J（第2道）纯合子的DNArd10/rd10（车道3）和杂合CXB-1xB6-第10行/+F1（车道4）显示了预测的RFLP模式（面板C）。Lane 1是一个100碱基对（bp）的DNA大小标记。凝胶图像侧面的数字是以碱基对（bp）预测的片段大小。

讨论

编码杆状cGMP磷酸二酯酶β亚单位基因突变的小鼠钯6b基因组成了一些最古老和研究最多的视网膜变性动物模型。小鼠纯合子第1版突变包含一个内含子反转录转座子插入和一个无义突变钯6b基因。这对突变在世界各地的近交系和野生系小鼠中广泛分布(Bowes等人，1993年;Pittler&Baehr 1991年). 在受影响的动物中，视网膜杆感光细胞大约在出生后第8天开始退化，到4周时就没有感光细胞了。

我们发现了另外两种携带钯6b基因，钯6b第10行(第10行)和钯6b137奈米（137奈米）导致视网膜退化。视网膜变性是由基因外显子13的错义突变引起的钯6b中的基因第10行小鼠是已知的第一个在小鼠中自发出现的突变等位基因钯6b不是的基因第1版.小鼠纯合子第10行突变显示常染色体隐性遗传性视网膜变性，由基因外显子13的错义突变引起预期收益6b基因。中央视网膜的视杆感光细胞在16日龄时开始退化，外围视网膜在20日龄时退化，到60日龄时，感光细胞不再存在。

相对于第10行突变137奈米ENU诱导扫描中出现突变。中T到C的变化纳米137突变与ENU的突变一致，ENU通常使嘌呤烷基化。在这种情况下，ENU处理很可能修改了与T相反的A，如图9，导致A去排尿，然后用G替换A进行容易出错的酶修复，然后在所示突变基因序列中补充C，如图9. The137奈米突变体显示从16天大开始ONL的广泛变性，并且到30天视网膜中没有留下ONL。中的遗传模式137奈米小鼠为常染色体隐性遗传。这似乎比在第10行突变，与第1版突变体。

这个第10行该菌株在大约10天大时具有视网膜β-PDE免疫反应性，但信号明显低于年龄匹配的野生型视网膜。蛋白质缺乏免疫反应第1版任何阶段的视网膜、P60处的野生型大脑和感光细胞以外的视网膜细胞类型都表明抗体的特异性。尽管免疫反应性低于野生型，但明显高于背景或第1版小鼠视网膜处于任何阶段，表明与第1版小鼠体内产生大量β-PDE第10行视网膜。

视网膜电图（ERG）显示，在第10行突变体，但在137奈米和第1版突变体（数据未显示）。ERG测量的视杆视觉循环功能的持续性以及β-PDE蛋白表达的持续性第10行早于变性开始的突变表明rd10视网膜变性不是由β-PDE蛋白缺失引起的，而是由表达不足和/或单位酶活性低引起的。这可能导致细胞内cGMP积累，速度慢于但与第1版视网膜，最终导致细胞死亡。也就是说，这些数据表明钯6b第13外显子错义突变第10行突变体可能仍有一些功能，而预期收益6b外显子7无义突变第1版小鼠和钯6b第16外显子错义突变137奈米小鼠失去了功能。未来的实验计划是比较这些菌株中棒状cGMP-PDE酶活性和cGMP积累，并探索暗显对这些参数的影响。

这个第10行在研究常染色体隐性遗传性视网膜色素变性（arRP）的发病机制和实验治疗方面，小鼠可能比第1版和137奈米因为它发病较晚，视网膜退化程度较轻。事实上第10行小鼠被用于研究病毒介导的基因传递（Rex等人，2004）和干细胞移植（Otani等人，2004年）后神经营养素表达对视网膜变性的影响。进一步的效用可能来自于能够通过饲养来延缓退化的发生第10行黑暗中的老鼠。

致谢

在打击失明基金会、预防失明研究基金会、圣殿骑士教育基金会、退伍军人管理局健康服务研究与发展服务部颁发的优秀评审奖的支持下，NIH授予R01 EY007758、P30 EY06360、T32 EY007092、R01 EY14026、R01 AY12514和R01 EY016470。这项工作的一部分在佛罗里达州劳德代尔堡视觉和眼科研究协会的年会上以抽象形式介绍。

脚注

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