酵母细胞周期调控基因的综合鉴定酿酒酵母通过微阵列杂交^D⃞

介质和生长条件

YEP介质(谢尔曼，1991年)在所有实验中使用，并辅以适当的碳源。除非另有说明，否则每个实验的描述中都指出了碳源，并以2%（wt/vol）的最终浓度使用。在使用之前，将α因子实验的YEP的pH值调整为5.5。用于淘析的介质首先通过Whatman#1滤纸。在每个实验描述中规定的温度下，以250–300 rpm的速度摇晃酵母培养物，摇晃体积不超过容器最大体积的25%。

微阵列制造

使用基因PAIRS引物扩增酵母ORF（Research Genetics，Huntsville，AL）。使用每对引物和以下试剂在96周的PCR板中进行100微升PCR反应：每个引物1μM，每个dATP、dCTP、dTTP和dGTP 200μM，1×PCR缓冲液（Perkin Elmer-Cetus、Norwalk、CT），2 mM MgCl₂，和2 UTaq公司DNA聚合酶（Perkin Elmer-Cetus）。在Perkin Elmer-Cetus 9600热循环机中进行热循环，在94°C下进行5分钟的变性步骤，然后进行30次循环，熔化、退火和拉伸温度和时间为94°C，30 s；54°C，45秒；和72°C，分别为3分钟30秒。通过凝胶电泳验证PCR产物的正确性。通过使用基因PAIRS引物重复PCR反应、订购定制引物或使用酵母ORF DNA（研究遗传学）作为模板，对被认为失败的产品进行扩增。失败PCR的再放大使用与初始放大相同的协议。

如前所述，制备DNA并打印到微阵列上(沙隆等., 1996;德瑞西等., 1997[http://cmgm.stanford.edu/pbrown/];艾森和布朗，1999年)每个元素的中心间距为190μm。对每个微阵列进行目视检查，本研究中使用的所有微阵列估计缺失<1%的所有元素，但cdc15实验中使用的阵列除外，其缺失了所有元素的～3%。

细胞密度和尺寸测量

使用Coulter Counter Multisizer（Coulter Electronics，Hialeah，FL）或Beckman FACScan工作站（Beckman Instruments，Fullerton，CA）测量所有细胞尺寸。Coulter计数器也用于测量淘析的细胞密度。在OD时测量α因子实验中的细胞密度₆₀₀使用Pharmacia Ultrospec III分光光度计（新泽西州皮斯卡塔韦市Pharmacia。

萌芽指数计算

使用配备有Virsonic 300（Virtis，Gardiner，NY）微探针的声波仪，在50%功率下对每个样品进行30秒的声波处理，以分离分离的细胞。对至少200个细胞进行计数，并对是否有芽进行评分。

DNA含量测定

样品的制备如前所述(Futcher，1993年)，并使用贝克曼FACScan工作站测量DNA含量。

核染色

细胞在水中清洗，并在含有1μg/ml DAPI的水中重新悬浮。然后将细胞放置在玻璃载玻片上，并使用荧光显微镜观察细胞蔡司Axioplan显微镜(卡尔蔡司纽约州桑伍德）。

基于α因子的同步

酵母菌株DBY8724培养至OD₆₀₀取0.2 in YEP葡萄糖，异步取样，并将α因子（PAN设施，斯坦福大学贝克曼中心）添加至12 ng/ml的浓度。120 min后，将细胞以3000 rpm的转速在Sorvall（Newtown，CT）S34转子中造粒5 min，并倾析上清液，从而去除α因子。将停滞的细胞重悬于新鲜的YEP葡萄糖中至OD₆₀₀为0.18。在接下来的140分钟内，每隔7分钟采集25 ml样本进行RNA分析，并采集5 ml样本进行FACS分析。释放OD后91分钟₆₀₀通过添加新鲜培养基，培养物的质量从～0.4降至～0.2。

基于大小的同步

将9升酵母菌株DBY7286在25°C的YEP乙醇（2%，vol/vol）中培养至1.5×10的细胞密度⁷细胞/ml。细胞在Beckman JA-10转子中造粒10分钟。保存上清液，称为澄清培养基。将细胞重新悬浮在300 ml澄清培养基中，并使用配备有50%功率微探针的Virsonic 300超声波处理2分钟。将该体积装入配有JE-5.0淘析转子的Beckman J-6 M/E离心机中的双色淘析室（Beckman Instruments，Fullerton，CA；目录号356940和356941）。在25°C的澄清介质中运行淘析器。未混合子细胞（400 ml，2.3×10⁷以17.7 fl的模式细胞体积收集细胞/ml），并在25°C下生长。在接下来的6.5小时内，每隔30分钟采集一次样品，并使用独立的样品进行DAPI染色（1 ml）、FACS分析（2 ml）、出芽指数（1 ml）和RNA制备（25 ml）。收获后，DAPI、FACS和出芽指数的样品立即在冰上冷冻。

基于Cdc15的同步

这个cdc15-2型（DBY8728）菌株生长到2.5×10⁶23°C下YEP葡萄糖培养基中的细胞/ml。然后将培养物转移到37°C的空气培养箱中，并在该温度下保持3.5 h。此时，细胞密度已达到6.6×10⁶细胞/ml，96%的细胞是a的大哑铃特征cdc15逮捕。然后将细胞从cdc15通过将培养物转移到23°C水浴中进行逮捕。从切换至23°C水浴开始，每隔10分钟采集一次样品，持续300分钟。到班后300分钟，细胞密度已达到4×10⁷细胞/ml。将同一原始培养物的一部分在23°C至1×10的温度下培养⁷细胞/ml，提取对照mRNA。通过新芽的出现监测细胞周期的进展。

因为cdc15-2型37°C停搏释放后，细胞并没有在数量上完成细胞分离，FACS分析很难解释。因此，我们跟踪了cdc15-2型通过监测细胞周期中新芽的出现。在释放到23°C后50分钟，当12%的哑铃有小芽时，第一个新芽出现（通常是两个小芽，每半个哑铃上各有一个）。带小芽的哑铃在60分钟时的百分比为52%，70分钟时为76%，80分钟时为96%，90分钟时几乎为100%，当时几乎所有的哑铃不仅有一个芽，而且有两个芽，每一半哑铃上都有一个。第二轮小芽出现在150分钟，此时3%的细胞有小芽。160分钟时的百分比为9.7%，170分钟时为32%，180分钟时为68%，190分钟时为81%。第三轮小芽在270分钟出现，尽管此时同步性正在衰退。

Cln3和Clb2实验

对于Cln3，实验菌株31（DBY8725）在23°C的YEP棉子糖/半乳糖（各1%）中生长，密度为1×10⁷细胞/ml。然后过滤细胞，用2体积的YEP洗涤，并在23°C下重悬于YEP棉子糖中。这些细胞在孵育3小时后由于缺乏Cln活性而停滞。然后通过将培养物转移到37°C下2.5小时来灭活Cdc34p。然后分裂培养物，并将半乳糖以2%（wt/vol）的最终浓度添加到一半。每10分钟采集一次该培养物中的细胞，持续40分钟获取RNA。在时间0时采集整个对照培养物。实验进行了两次（在我们的数据集中，每次杂交一次）。显示了40分钟（第一次实验）和30分钟（第二次实验）后半乳糖样品的数据。

对于Clb2实验菌株245（DBY8726）生长到5×10的密度⁶在30°C条件下，将YEP棉子糖/半乳糖（各1%）放入，然后离心，用2 vol YEP清洗细胞，然后再悬浮在YEP棉籽糖中。6 h后，将二甲基亚砜添加到最终浓度为1%，并将诺克唑添加到最终密度为15μg/ml。然后分离培养物，并将最终浓度为2%（wt/vol）的半乳糖添加到一半。每10分钟采集一次该培养物中的细胞，持续40分钟获取RNA。在时间0时采集整个对照培养物。实验进行了两次（在我们的数据集中，每次杂交一次）。显示了来自两个40分钟后半乳糖样品的数据。

为了控制Cln3和Clb2实验对半乳糖添加的影响，菌株W303a（DBY8727）在30°C的250 ml YEP棉子糖中生长，细胞密度为1×10⁷细胞/ml。将培养物分成两部分，并将一半（实验培养物）的半乳糖添加到最终浓度2%（wt/vol）。40分钟后，采集两种培养物以制备mRNA。本实验的数据可在我们的网站上获得。

RNA制备

将培养物直接移液至含有约20克冰的50毫升Falcon（新泽西州林肯公园）试管中，以快速冷却细胞，从而获得RNA分离样品。通过在台式离心机中旋转3分钟收集细胞，然后通过浸泡在液氮中冷冻，并在−80°C下保存，直到RNA制备完成。通过向每个冷冻细胞颗粒中添加10 ml水饱和苯酚、10 ml醋酸钠缓冲液（50 mM醋酸钠、10 mM EDTA，pH 5.0）和1 ml 10%十二烷基硫酸钠（均预热至65°C）来制备RNA。每种混合物在65°C下培养10分钟，每1分钟剧烈旋转10秒。在1500×克将水相转移到另一个含有10ml水饱和苯酚的50ml锥形管中10min。样品旋转30秒，并重复旋转。再次将水相转移到一个新的50 ml锥形管中，添加10 ml苯酚：氯仿（1:1），然后旋转15分钟。通过将水相添加到等量异丙醇和0.1 vol 3 M醋酸钠中沉淀RNA。样品在1500×克将RNA颗粒化。用70%乙醇清洗颗粒并在室温下干燥。将RNA颗粒溶解在TE中（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）至～2.5 mg/ml。

探针准备

总RNA（15μg）和6μg寡聚-dT合并成15μl的总体积。将RNA寡核苷酸-dT混合物加热至70°C 1分钟，然后在冰上冷却。添加三微升25 mM Cy3-或Cy5-共轭dUTP（美国伊利诺伊州阿灵顿高地阿默沙姆）、3微升1 M DTT、6微升第一链缓冲液（美国加利福尼亚州拉荷亚州斯特拉赫纳）、0.6微升dNTP（每种dATP、dCTP、dGTP和15 mM dTTP各25 mM）和2微升上标II（斯特拉赫内）。然后将每个样品在42°C下培养2小时，以生成Cy-标记的cDNA。通过添加1.5μl停止溶液（1 N NaOH，0.1 M EDTA）并在70°C下孵育10分钟来降解起始RNA。通过添加15μl 0.1 N HCl和400μl TE（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.4）来中和样品。通过在Centricon-30（Amicon，Danvers，MA）中分离，将标记的cDNA浓缩并从未结合的氟中分离出来，直到在流动中看不到更多的氟，并且探针浓缩至<4μl。

微阵列杂交

将由Cy3-和Cy5-标记的cDNA、3×SSC、0.3%SDS和1.8μg/μl酵母tRNA组成的探针混合物（12μl）应用于每个微阵列。用22-mm方形盖玻片覆盖微阵列（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA），并将其放置在定制的杂交室中（参见http://cmgm.stanford.edu/pbrown/). 密封前，在杂交室内放置10微升水，并将杂交室内放置在65°C水浴中。允许微阵列杂交4-6小时。将微阵列从室中取出，放置在标准组织化学载玻片支架中，分别在以下溶液中浸泡30次进行清洗：2×SSC，0.2%SDS；0.4×标准立方厘米；和0.2×SSC。

数据采集和处理

使用定制的扫描激光显微镜扫描微阵列。以20μm/像素的分辨率为每个荧光片分别采集2×2-cm的图像。通过在组合的Cy3–Cy5图像上手动叠加方框网格来提取数据，以便每个方框包含一个阵列点。记录每个盒子内每个荧光的平均荧光强度。通过平均每个框中最弱的12%像素的强度来估计局部背景。根据背景校正值计算荧光比率。质量差的斑点（通过目视检查进行分析）已从进一步考虑中去除。作为每个点数据内部一致性的度量，计算了Cy3和Cy5强度之间的逐像素相关系数；相关值较低（即<0.4）的斑点被排除在进一步分析之外。

以细胞周期依赖方式调节的mRNA的鉴定

从数据库中提取α因子时间序列中每个基因的数据，并对其进行归一化，以便平均对数₂在实验过程中（比率）等于0。傅里叶变换（方程式。1–三)将应用于每个基因的数据序列，并存储每个基因的结果向量（C），其中ω是细胞周期的周期，t是时间，Φ是相位偏移，比率（t）是时间t的比率测量值。我们发现傅里叶变换的大小（D，方程式。4)ω的微小变化是不稳定的，因此我们平均了40个值范围内的变换向量，这些值均匀分布在实验的估计除法时间（66±11）周围。我们最初将Φ的值设置为0。

1

2

三

4

然后，使用标准皮尔逊相关函数，将实验中每个基因的表达谱与代表已知在G1、S、G2、M和M/G1中表达的基因的五个不同谱相关联。已知基因类别的图谱通过对数平均值确定₂（比率）已知在五个时间段中每个时间段达到峰值的每个基因的数据。峰值相关分数被定义为每个基因的数据系列和每个剖面之间的最高相关值。通过傅里叶变换计算的矢量按峰值相关值缩放。

对cdc15实验（ω在60和80之间变化）和cdc28数据（ω在80和100之间变化）赵等. (1998). Thecdc28型通过将每个测量值除以该基因的测量值的平均值，首先将数据集转换为比率式测量值。在此步骤之前，有必要排除一些似乎异常的数据点。任何一侧的两个值在同一方向上相差三倍的数据值都被排除在外。因此，每个基因都有三个载体得分（三个分析数据系列中的每个都有一个）。

为了为每个基因生成一个载体，我们将每个实验的载体加在一起。然而，三个实验的Φ值不应该相同，因为实验在细胞周期的不同点开始。因此，在组合三个实验的矢量之前，计算了Φcdc15和Φcdc28（相对于α因子实验）的常数cdc15和cdc28对于已知基因，分别使求和的载体的平均大小最大化的实验。淘析数据不包括在内，因为不可能计算出使少数已知基因的值最大化的Φ。α因子和cdc15载体乘以0.7，这样它们就不会对最终的“总CDC得分”产生不适当的影响，最终的CDC得分是通过取最终载体的大小来计算的。

基因根据其CDC总分进行排序，并对列表进行检查，以确定其中已知细胞周期基因的位置。我们选择了一个超过91%已知细胞周期调控基因的CDC分值阈值。总共有800个基因达到或超过了CDC的得分。

促销员分析

使用Gibbs取样策略在起始密码子上游700 bp处识别出了基序。这种战略最初是由劳伦斯等。(1993)找到蛋白质序列中的模式，然后由纽瓦尔德等. (1995)考虑到重复主题的可能性。我们修改了这些吉布斯采样算法，以允许对DNA（Zhang，未发表的数据）进行模式搜索，其中包括双链搜索、回文对称性以及子运动包含和排除等功能。一旦为组或簇建立了模体，我们通过搜索所有组ATG上游700 bp的模体一致性（具有指定的不匹配）以及非细胞周期调控基因的对照组来测试其预测价值，并比较这些位点在不同组中的分布。

同步的文化

我们测量了以三种独立方式同步的细胞培养中mRNA相对水平随时间的变化。首先我们用α信息素来逮捕MAT一细胞处于G1期。其次，我们使用离心淘析来获得小的G1细胞。最后，我们使用了一种对温度敏感的突变，cdc15-2型在限制温度下，它会在有丝分裂后期阻止细胞。我们使用了三种方法，因为每种方法都引入了特征工件。例如，信息素的使用具有交配特征的调节结果，而温度敏感突变体的使用可能会引起热休克。

同步实验在主要方面有所不同。首先，他们使用不同的碳源和不同的温度进行实验，结果是细胞以不同的速度生长。其次，使用两种不同的酵母菌株背景（S288C和W303），最后，在细胞周期的不同时间点同步细胞。每种方法通过一个细胞周期（淘洗）、两个周期（α信息素）或三个周期产生显著的细胞周期同步性(cdc15型)根据材料和方法中所述，每个实验至少采用以下一种方法确定：芽数、DNA含量分析（FACS）和核染色（DAPI）。

从收集的每个样品以及对照样品中提取RNA（相同细胞在相同培养基中在相同温度下呈指数增长的异步培养物）。使用Cy3（“绿色”）为所有对照组合成荧光标记cDNA，使用Cy5（“红色”）为全部实验样品合成荧光标记的cDNA。将标记的对照和实验cDNA的混合物竞争性地与基本上包含所有酵母基因的单个微阵列杂交(德瑞西等。，1997). 用扫描激光显微镜测量实验（红色）与对照（绿色）cDNA的比率(沙龙等。，1996).

细胞周期蛋白Cln3p和Clb2p的转录反应

为了从机理上了解所观察到的细胞周期调节的控制，我们确定了其mRNA水平对两种特征良好的细胞周期调控因子Cln3p和Clb2p的诱导反应的基因（参见纳斯密斯，1993年). 在G1期后期，Cln3p-Cdc28p蛋白激酶复合物激活MBF和SBF两种转录因子，这些转录因子反过来促进许多对出芽和DNA合成重要的基因的转录(克罗斯，1995年). 在细胞周期的后期，Clb2p-Cdc28p复合物抑制SBF的活性，使SBF调节基因的表达恢复到低水平(阿蒙等。，1993). 此外，已知Clb2p-Cdc28p可激活至少四个基因的表达，CLB1级,CLB2类,SWI5系列、和BUD4（预算4）(阿尔托费尔等。，1995;桑德斯和赫斯科维茨，1996年).

为了确定由Cln3p和Clb2p控制的其他基因，我们逮捕了cln公司⁻或clb公司⁻G1晚期细胞cdc34-2对于CLN3号机组实验和在M中使用诺康唑CLB2类实验。然后我们诱导了第3类或CLB2类不诱导细胞周期进展。将来自表达Cln3p的G1期细胞的RNA（标记为红色）与来自在没有Cln3p的情况下被捕的G1相细胞的对照RNA（标记成绿色）进行比较。同样，对于CLB2类实验中，将来自表达Clb2p的M期细胞的RNA（标记为红色）与来自在没有Clb2p时被阻止的M期电池的对照RNA（标记成绿色）进行比较。在每种情况下，通过微阵列杂交定量测量mRNA水平。此外，我们进行了一项实验，以测试半乳糖对不含诱导细胞周期蛋白的异步培养的影响（见材料和方法）。在Gal细胞周期蛋白实验中，被鉴定为受半乳糖添加强烈影响的基因没有被进一步考虑。

数据分析和可用性

我们收集的总数据包括约400000个单独的比率测量值。数据的质量和可靠性只能通过以适合进一步查询或计算机分析的形式不受限制地访问所有数据来评估。因此，除了此处打印的摘要外，我们还提供了来自互联网上两个位置的主要数据。数值数据在每个阵列上每个基因的实际测量比率表中提供。它们可以从期刊网站下载为以tab分隔的文本文件(http://www.molbiolcell.org)或者从斯坦福大学的服务器(http://cellcycle-www.stanford.edu). 斯坦福大学网站还提供了阵列图像、辅助数据以及浏览和搜索完整数据集的功能。如有要求，作者也可提供原始数据。

这项工作的综合性质还有另一个结果：在下文中，我们提到多达400个基因。每次出现每个基因时都提供详细的文献资料是不切实际的。相反，我们有选择地提供了参考，我们鼓励读者使用指向酵母菌属基因组数据库(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces网站)和酵母蛋白质数据库(http://quest7.proteome.com/YPDhome.html)将在两个细胞分子生物学和斯坦福大学网站。

细胞周期调控转录物的鉴定

结合同步实验的数据，我们能够识别800个表达受细胞周期调控的基因。我们通过结合傅里叶算法和相关算法来实现这一点，如材料和方法中所述。这导致了每个基因的得分，我们称之为CDC总分。为了说明这一点，表​表3三提供了一些针对几个基因获得的评分类型的汇总统计数据和示例（包括受细胞周期调控和不受细胞周期调节的特定示例）。

通过我们的经验方法设定CDC总分的阈值，我们旨在尽量减少假阳性评估，同时包括已知具有周期性mRNA水平的绝大多数先前特征基因。尽管我们无法客观地将这种行为与噪声区分开来，但许多其他基因显示出细胞周期调控的迹象（通过对数据的目视检查和使用我们的算法进行量化）。

我们用两种方法估计假阳性率。首先，我们随机化了每个实验的数据（按基因和时间点），并进行了上述所有分析。随机数据产生了24个“基因”（约6200个），CDC得分超过了我们用于将基因分类为细胞周期调控基因的阈值。我们假设这代表了对假阳性率的合理估计（即，识别出的所有基因中，约3%为假阳性）。在第二个更保守的测试中，我们将数据集随机分配到基因内。当我们以这种方式随机改变数据时，得分高于我们阈值的基因数量大约高出三倍（75个基因）。因此，假阳性（在800个细胞周期调控基因中）的数量可能<10%，甚至可能低至3%。

按表达模式分类细胞周期调控基因

我们使用了两种不同的方法来根据基因的表达模式对其进行分类，我们称之为“阶段化”（通过峰值表达的时间）和“聚类”（通过实验中表达的相似性，如下所述）。这两种方法之间没有简单的关系，尽管结果中有一些共同的特征。通过确定每个基因的峰值表达时间（根据傅里叶算法计算）并按此时间对所有基因进行排序，创建“相组”。我们将这个有序集分为五组（有些任意），分别称为G1、S、G2、M和M/G1，这些组与文献中常用的组相似。为此，我们使用已知基因的已公布基因表达时间来确定哪些基因属于哪个阶段组。图​图1A1A显示了我们确定的800个基因，根据表达阶段进行排序。每列代表实验中的一个时间点，每行代表一个我们确定为细胞周期调控的基因。我们在每个时间点测量的每个基因的表达比率是用颜色编码的，反映了表达比率相对于该基因平均值的大小，红色的阴影表示增加（开），绿色的阴影表示减少（关）。此显示基于艾森等。（1998年）在细胞周期的每一部分中表达的基因用侧面的颜色条（和相位）表示，细胞周期的时间进程用顶部表示。

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图1

酵母细胞周期中的基因表达。基因对应于行，每个实验的时间点就是列。显示每个基因的诱导/抑制比率，以便通过显示的颜色强度指示大小。如果颜色是黑色，那么对照组与实验cDNA的比率等于1，而最亮的颜色（红色和绿色）代表2.8:1。比率>2.8显示为最亮的颜色。在所有情况下，红色表示mRNA丰度增加，而绿色表示丰度减少。灰色区域（如果可见）表示缺少数据或数据质量低。右边的颜色条表示基因所属的相组（M/G1，黄色；G1，绿色；S，紫色；G2，红色；M，橙色）。这些相同的颜色表示顶部的细胞周期阶段。（A） 细胞周期调控基因的基因表达模式。这800个基因是按照它们达到峰值表达的时间排序的。（B） 共享相似表达谱的基因通过文本中描述的聚类算法进行分组。左边的树状图显示了星团的结构。

通过阶段划分，有300个G1基因（例如。，CLN2型,注册号1,CDC9公司,RAD27型,SMC3公司、和MNN1型)，71个S基因（例如组蛋白），121个G2基因（例如。，CLB4级,白色3、和销售信息系统3)，195个M基因（例如。，数据库2,CLB2型,CDC5公司,CDC20型、和SWI5（瑞士）)和113个M/G1基因（例如。，ASH1型,SIC1公司,CDC6型、和EGT2型). 这是一个粗略的分类，有许多缺点（例如，G2组中的最后一个基因和M组中的第一个基因几乎同时表达，但在不同的组中），但它对讨论结果很有用。

DNA结合位点的鉴定

我们搜索了我们列表中800个基因中每个基因的起始密码子上游700 bp，以确定可能控制细胞周期中表达的已知或新因子的潜在结合位点。我们发现，大多数基因与已知的与峰值表达时间相关的细胞周期转录因子结合位点具有良好的匹配。此外，我们检查了上游序列中这些元素的分布，发现位点及其相对于ATG的位置都包含预测基因相组的信息。图​图22显示了G1、S、G2、M和M/G1期组启动子中六个位点的频率，以及一组非细胞周期调控基因的控制集。这些站点是以前发布的SCB和MCB以及对已发布站点的四个扩展和修改（MCM1+SFF、扩展SWI5、SCB变体和退化MCB）。我们的网站上提供了所有推广人搜索的完整结果。

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图2

结合位点频率。图形显示了五个细胞周期调控组和一个由279个非细胞周期调控基因组成的控制组的上游区域中各种启动子元件的分布情况，这些基因对Cln3p或Clb2p诱导都没有反应。在每种情况下，x轴上的数字表示与起始密码子的距离，而条表示上游启动子区域中每个基因每个残基的特定位点的频率。N是任意基数；Y是C或T；W是A或T；R是A或G；M为A或C（A）SCB。（B） SCB上的变体，也类似于MCB。（C） 微型断路器。（D） MCB_D，一个退化的MCB序列。（E） MCM1/SFF现场。（F） Swi5e，一个扩展的Swi5站点。

集群及其调控

聚类是使用以下聚类算法建立的艾森等。(1999)该算法对所有数据进行排序，找出每个实验中行为最相似的基因对，然后逐步将其他基因添加到初始对中，形成明显相互调控的基因簇。如下文所述，聚类算法成功地识别了相关调控基因，因为对簇中基因的5′区域的分析表明，这些基因共享共同的启动子元件，其中许多元件根据已发表的文献可以识别。因此，这些簇为理解细胞周期调控的转录机制提供了基础。图​图1B1B显示了我们细胞周期调控基因的整个聚类图；我们的网站上提供了一个带有基因名称的更大版本。使用相同的颜色编码表示，并在最左侧添加由聚类算法计算的相似树（树状图）。聚类图的许多部分（子聚类）如下所述，我们讨论的部分汇总在表中​表4。4。这些子集群在主集群中的位置如图所示​图1B：。1B。

G1集群

“CLN2”簇是最大的子簇，包含76个基因。该簇中的基因包括CLN1型,CLN2型,CLB6类,注册号1,CDC9型,CDC21型,CDC45型,POL12型油轮,POL30系列,交换机1以及许多其他与DNA复制有关的基因。该集群的一部分如图所示​图3A。三A.这些基因的主要特征是，其表达受到强烈的细胞周期调控（即大的峰谷比）；峰值表达发生在G1期中期（出芽前约10分钟cdc15实验）；它们是由镀锌CLN3但受到强烈压抑镀锌-CLB2这些基因的58%的5′区至少有一个基序ACGCGT的拷贝（对照基因的6%），这是一个完美的MCB元件。52%的人至少有一个CRCGAAA（对照基因的13%）拷贝，这是一种退化的SCB元件。此外，16个具有AGAAGAAA基序，类似于在CLN3号机组（AAGAAAAA）(帕尔维兹等。，1998). 最后，17个具有我们不认识的CCACAK图案。在这个集群的核心之外，还有至少43个额外的基因，这些基因不太紧密地聚集在一起，但似乎与CLN2型聚类（共119个基因）。

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图3

G1集群。转录剖面如图图例所示​图1。1.（A）CLN2型集群。一部分基因与G1细胞周期蛋白调控相似CLN2型，在细胞周期的G1期达到峰值表达。要查看所有细胞周期调控基因的完整簇，请访问http://cellcycle-www.stanford.edu（B）Y′簇。位于Y′元素中的31个基因显示了细胞周期中mRNA水平的调节，该水平在G1期达到峰值。

“Y’”簇（图​（图3B）三B） 包含31个ORF，它们都具有相同的DNA序列相似性。基因组中有38个ORF具有这种相似性，我们确定其中36个是受细胞周期调控的。这38个ORF都存在于染色体末端的Y′元素中。值得注意的是，这些结果可能并不代表36个独立的观察结果，因为与这些ORF相对应的cDNA几乎肯定会在微阵列上杂交。我们不知道这些ORF是如何调节的，也不知道其功能意义。

有一组92个基因，包含ALG7公司,FKS1（FKS1）,气体传感器1,眼镜5,项目管理T1、和PMI40型以及参与细胞壁合成的其他基因(Klis，1994年)，这不是聚类图上的一个聚类，但实质上是相互关联的。这些基因可以在我们的网站上看到，如图​图3C。三C.表达受细胞周期强烈调控，峰值表达几乎与出芽一致（比CLN2型中的集群cdc15实验）。这些基因是由镀锌CLN3被压抑镀锌-CLB2这些基因中的大多数具有ACRMSAAA基序（其中R为A或G，M为A或C，S为C或G），这可能是SCB基序（CACGAAA）的延伸和变异。比较CLN2型这个集合的聚类表明，MCB基序的表达可能在SCB基序表达之前被激活，但这两种表达都是由CLN3号机组（与之前的研究一致）并受到CLB2类早期研究表明，抑制SCB驱动的表达需要CLB2类而抑制MCB驱动的表达则没有(阿蒙等。，1993). 我们的结果通过证明扩展了这一点CLB2类可以抑制MCB驱动的表达，即使可能有额外的抑制机制。该组中的许多基因也具有AARARAAG基序，这与CLN2簇中发现的基序相似（见上文）。然而，由于启动子通常富含此类序列，因此该基序的意义尚不清楚。

S和M集群

图中的组蛋白簇​图4A4A是所有细胞周期基因中最紧密的一组。这九个基因具有非常高的峰谷比，总分为～10。组蛋白有三种已知的调节模式：第一，存在抑制转录的负元素；第二，除S期外，mRNA的3′区有一个元素使信息不稳定；第三，有一个重复的阳性元素，可以激活转录(弗里曼等。，1992). 阳性元件的部分核心基序是ATGCGAAR，它类似于我们的退化SCB基序（ACRMSAAA）。与此一致，组蛋白表达是由女孩-CLN3号机组然而，已经表明HTA2型/HTB2型mRNA的积累不受单次突变的显著影响SWI4号机组,SWI6系列，或MBP1型(Lowndes公司等., 1992;十字架等., 1994). 此外，组蛋白水平不受GAL-CLB2的影响。组蛋白调节峰值的尖锐性值得注意，因为它给人一个同步程度的良好印象，也因为组蛋白是第一个发现周期性调节的基因(赫里福德等。，1981).

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图4

S和M集群。转录剖面如图图例所示​图1。1（A）组蛋白簇。编码组蛋白和酵母组蛋白H1同源物的八个基因簇非常紧密，在酵母细胞周期的S期表达。（B） MET集群。许多蛋氨酸途径成员的表达在组蛋白之后达到峰值。（C）CLB2类集群。表达类似于CLB2类突出显示了在M期达到峰值的基因。

“MET”簇（20个基因，图​图4B）4B） 完全出乎意料。它包含10个参与蛋氨酸生物合成的基因。此外，该聚类中的两个未命名基因显示出与人类蛋氨酸合成酶的序列相似性，两个可能是氨基酸转运蛋白（具有未确定的特异性），一个类似于表17其中一个位于MET2型最后，ECM17型，该簇中唯一一个先前特征基因，未知为蛋氨酸生物合成途径的一部分，类似于人类的亚硫酸盐氧化还原蛋白。因此，该簇中几乎所有的基因都可能参与蛋氨酸代谢。该簇中的基因表达在组蛋白之后达到峰值，并且至少有一些是由CLN3号机组我们搜索了MET簇中基因的上游区域，发现其中15个基因具有一致的AAACTGTGG，这与Met31/Met32结合的一致性相同(布莱索等。，1997).

“CLB2”集群（图​（图4C）4C） 包含35个基因，包括许多与有丝分裂有关的基因，如CLB2类,CDC5公司,CDC20型、和SWI5系列也有许多其他不太紧密聚集的基因似乎以类似的方式进行调控，包括WSC4型,项目管理计划1和主要的质膜质子泵项目管理A1和项目管理A2. TheCLB2类簇是高度调节的，在M中有一个峰值，这些基因是由女孩-CLB2类，而女孩-CLN3号机组看起来有点压抑。之前已知，在这个集群中发现的四个基因，CLB1级,CLB2类,SWI5系列、和BUD4（预算4），由两种转录因子Mcm1p和SFF的组合调节(阿尔托费尔等., 1995;桑德斯和赫斯科维茨，1996年). Mcm1p与共识TTACCNAATTNGGTAA结合(阿克顿等。，1997)然而，基于其中三个基因，SFF被认为与一致序列GTMAACAA结合。此外，转录CLB1级,CLB2类、和SWI5系列已知由Clb2p活性诱导，可能是因为SFF的翻译后激活(阿蒙等。，1993). 我们比较了CLB2类簇和某些其他共同调节的基因（例如。，ASE1型也被认为是SFF的可能目标[佩尔曼等。，1995])并发现其中大多数包含易于识别的MCM1+SFF基序。在这组35个基因中，只有9个基因(知识产权2,MOB1型,数字1,YCL012W型,业务单元3,CHA1号机组,YCL063W型,YLR057W型、和YML033W型)与MCM1+SFF的共识不太容易识别。包含该位点的基因的比对可以在我们的网站上查看，根据该比对，我们推断出MCM1+SFF结合的新共识，如图所示​图5。5.

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图5

MCM1+SFF达成共识。通过对发现于CLB2类集群（请参阅我们的网站以获取对齐），我们为新的MCM1+SFF共识开发了一个矩阵。计算并显示在现场每个位置发现每个底座的次数。通过检查每个位置的核苷酸频率来确定共识。

M/G1集群

“MCM”集群（图​（图6A）6A） 包含34个基因，包括全部6个Modern Creation Munich直接参与DNA复制的基因(MCM2型,MCM3型,CDC54型,CDC46型,MCM6公司、和CDC47型; 审核人骑士与吹牛，1996年)以及FAR1公司,数据库2,SPO12号机组、和KIN3。这些基因在周期后期达到峰值，大约在M/G1边界处，由CLB2类有点压抑CLN3号机组。此群集与CLB2类集群，除了峰值表达稍晚。对上游区域的搜索显示，这些基因中的大多数包含Mcm1p的结合位点，正如之前对该簇的一些成员所显示的那样(麦金纳尼等。，1997). 这些MCM1站点中的一些（但不是全部）站点附近有SFF站点（例如FAR1公司,SPO12号机组,KIN3型、和CDC47型)，尽管这些假定的SFF站点具有不同的质量。有人认为，这个簇中的一些基因是通过“ECB”调节的，ECB是Mcm1p结合位点的变体(麦金纳尼等。，1997).

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图6

M/G1集群。转录剖面如图图例所示​图1。1.（A）MCM集群。MCM基因参与DNA复制的启动，并在细胞周期的M/G1转变期间进行协同调控。（B）SIC1公司集群。在M/G1边界处达到峰值的27个基因形成了一个亚簇。（C） MAT集群。这是一个在M/G1边界表达的13个共调控基因簇，其中许多基因与交配有关。

“SIC1”簇包括27个基因，包括EGT2型,PCL9系列,TEC1公司,ASH1型,SIC1公司、和CTS1型这些基因受到强烈的细胞周期调控（图​（图6B）6B） 峰值出现在M晚期或M/G1边界。镀锌CLN3可能会抑制其中一些基因，而镀锌-CLB2对这些基因的表达没有一致的影响。已知其中几个基因受转录因子Swi5p调节，Swi5p本身是CLB2类群集(多尔曼等。，1992;博博拉等。，1996;纳普等。，1996). Swi5p被认为绑定到ACCAGC一致同意的站点(纳普等。，1996)事实上，当我们在SIC1公司我们在27个基因中的许多基因中发现了一致的RRCCAGCR。当检查所有细胞周期调控基因是否存在原始Swi5p共识或新的扩展共识时，发现扩展共识对晚期M期基因更具特异性。这一比较显示在我们的网站上。该簇中约40%的基因中也发现了GCSCRGC基序。

“MAT”簇包含13个基因，如图所示​图6C。6C.其中一些基因（MFα1,MF公司α2、和STE3型)针对MATα细胞(贾维斯等。，1988)只有在cdc15实验是用MATα菌株进行的。集群中的其他基因(KAR4、AGA1、SST2、和保险丝1)是由α因子诱导的，因此在α因子实验开始时表现得非常强烈。然而，当不存在α因子时，这四个基因在其他实验中振荡。我们在其中几个基因的上游区域发现了MCM1结合位点，包括MFα1和MFα2此外，如下文所述，我们发现与Mcm1p合作诱导α特异性基因的转录因子MATα1本身是受细胞周期调控的，这可能在很大程度上解释了该簇中α特异性的基因的振荡。

其他基因和调节因子

表中总结的九个集群或近集群​表44约占细胞周期调控基因的一半。其余的基因往往不太受细胞周期的强烈调控，也不太紧密地聚集在一起。我们试图在剩余基因的启动子中发现新的元素，但没有取得很大成功。这些元素中最好的是一致的GCAGNRNCCW，我们在CLB4级,业务单元3,心肺复苏8,专业2,循环012w,YCL063W型,YGL217C型,云南L043C,YDR130C型、和YOL030W公司; 这些基因似乎具有良好的协同调控（峰值表达发生在G2）。可能还有我们无法找到的其他新颖的上游元素。

很可能剩余的许多基因实际上与我们所描述的簇成员共同调控，它们的转录可能由相同类型的元素控制。事实上，我们知道剩余的一些基因具有可识别的元素（例如MCB和SCB），而在其他情况下，这些元素可能是已知元素的高度退化版本。这可能解释了为什么我们观察到的细胞周期调控相对较弱，以及为什么基因没有紧密聚集。最后，mRNA水平可能振荡，不是因为转录控制，而是因为细胞周期对mRNA稳定性的控制；组蛋白mRNA是以这种方式部分控制的(王等。，1996).

对于我们确定的簇，簇中的一些基因不包含明显的元素；例如，CLB2簇中的9个基因不包含明显的MCM1+SFF位点。我们不知道这些基因是否包含我们的算法无法识别的隐秘退化位点，或者这些基因是否由未知因素调节。

细胞周期调控基因的功能

我们确定的细胞周期调控基因的主要功能是细胞周期控制、DNA复制、DNA修复、出芽、糖基化、核分裂和有丝分裂、细胞骨架结构和交配。在图中​图77我们将294个命名基因按照功能类别和它们所属的相组排列在我们的集合中。

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图7

细胞周期-具有特征功能的调节基因。297个细胞周期调控基因按功能和峰值表达阶段进行分组。几个功能组被划分为子组，这反映了功能的性质。那些用红色突出显示的细胞以前被认为是受细胞周期调控的。许多功能类别在细胞周期的特定时间段显示出对基因表达的强烈偏见。明显的例子包括参与DNA合成和DNA修复（G1）、交配（M、M/G1和G1），染色质结构（G1和S）以及蛋氨酸生物合成（S和G2）的基因。

DNA复制、修复和染色体组装

研究参与特定过程的基因的表达模式是有益的。例如，我们可以追踪许多以某种方式参与DNA复制的基因的表达（如图​图7）。7). 在G1期达到峰值的基因中，有23个基因在DNA复制中具有已知功能。这些基因包括DNA聚合酶的亚单位及其辅助因子（例如。CDC2（CDC2）,POL1型油轮、和POL2型油轮)，参与核苷酸合成的基因（例如。川东北21)以及参与DNA合成起始的基因（例如CDC45）。许多基因参与DNA修复，例如永磁同步电机1和MSH2型在G1期达到峰值表达，提示DNA损伤修复可能是S期的正常部分。

随后，当S期实际发生时，组蛋白基因达到峰值表达。在M期晚期或M/G1期，所有六个MCM基因对复制前复合物的形成都很重要(MCM2型、MCM3、CDC54、CDC47、，MCM6公司,CDC47型、和川东北54)CDC6达到峰值，可能是为了帮助建立下一个细胞周期的起源。因此，许多复制和修复所需的基因在需要之前达到峰值表达，组蛋白正好在需要的时候达到峰值，一些对DNA合成调节重要的基因在下一轮S期之前达到峰值。只有两个已知的起始基因，CDC45型和数据库4（我们在分析中没有确定；见下文）在S期之前达到峰值，这表明这些可能对触发复制特别重要。

萌芽与萌芽生长

萌芽是细胞的主要代谢活动，涉及多个子过程。细胞必须为新芽（萌芽）选择一个位置，并为不断增加的表面积制造成分，表面积由新的细胞膜（需要脂类和完整的膜蛋白）和新的细胞壁（主要由葡聚糖、甲壳素和甘露糖蛋白组成）组成。所有这些过程都需要通过分泌器官将成分输送到新膜和细胞壁合成的部位，而在正常情况下，这些部位只发生在芽中(凯撒等。，1997; 有关评论，请参阅卢等。，1997;奥尔良，1997年).

我们发现了17个与芽位选择和细胞极化有关的基因（例如。，业务单元3,BUD4（预算4）,BUD8（预算8）,BUD9（预算9）,BEM1公司,GIC1,MSB1型、和MSB2型). 如图所示​图7，7，这些基因均未被报道为细胞周期调控基因。其中一些(BUD9、CDC10、和RSR1（RSR1）)在G1期出现峰值表达，与芽分化的作用一致。其他(BUD4、BUD8、和BEM1公司)在M期达到峰值，表明在接下来的细胞周期中发挥作用，即在萌芽途径中比G1组更早。我们还鉴定了分泌、糖基化（制造甘露糖蛋白所需）、脂类合成和细胞壁合成所需的许多基因。

细胞分裂和有丝分裂

细胞分裂的另一个基本过程是有丝分裂（有关微管相关主题的综述，请参阅博茨坦等。，1997). 在细胞周期中，许多事件的发生使得有丝分裂能够及时进行。当主轴极体（SPB）复制时，此过程在G1开始。为了促进这一过程，SPB的六个已知成分在G1中达到峰值表达(CNM67（人民币67元）,第一届全国大学,SPC42型,SPC97型,SPC98系列、和管4)，一个(SPC34标准)S期间的峰值，以及一个(NUF2号机组)M相期间的峰值。其中一些基因已经被认为是受细胞周期调控的(第一届全国大学、和SPC42型) (基尔马丁等。，1993;Donaldson和Kilmartin，1996年).

一旦进入有丝分裂程序，细胞必须产生纺锤体，负责将细胞核移向芽颈，以便进行核分裂。这个过程需要微管和许多辅助蛋白质（形成纺锤）以及驱动蛋白（用于细胞核和SPB的运动）。这些基因主要在细胞周期的前半段达到峰值表达。在G1中比1，BUB1，IPL1，哈萨克斯坦共和国3、和SLK19系列达到峰值表达，在S期间，五个基因(CIN8公司,KAR9标准,知识产权1,STU2型、和VIK1系列)峰值。五个基因在G2期间达到峰值(业务单元2,CIK1型,知识产权2,基普3、和数字1)以及主要的β微管蛋白2号管最后，一个基因(ASE1型)在M。

微管蛋白信息会受到细胞周期的调节，这有些出乎意料；不幸的是，我们用于α因子和淘析实验的微阵列中，没有包含与两个主要因子互补的DNA(管1)或未成年人(管3)α微管蛋白。我们的数据集表明管1可能是细胞周期受到调控，因为它的得分刚好低于我们的临界值。我们希望通过一种独立的方法（定量实时PCR）来验证主要微管蛋白在细胞周期中的调节[海德等。，1996]). 该方法允许测定具有良好重复性的相对mRNA水平。我们按照材料和方法中的详细说明进行了分析，结果如我们所怀疑的，管1和2号管细胞周期受到适度调节，但管3似乎不太如此（图​（图8）。8). 这表明管1可能是由于它们不在某些阵列中而导致的。应该注意的是管道22.33分明显高于我们设定的细胞周期调节阈值，但管11.25分略低于管3（得分0.53）大大低于阈值。与图的比较​图88说明了分数接近阈值可能是数据不足或监管不力的结果。

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图8

Tubulin消息级别。mRNA水平管1,2号管、和管3，相对于购电协议1使用材料和方法中所述的TAQman分析法，在α因子阻滞释放后的同步分裂期间测定。

一类相对较小的基因表现出严格的时间调控，这是一组与染色单体凝聚力有关的基因。其中五个基因(SMC1公司,SMC3公司,MCD1型,PDS1（PDS1）、和PDS5系列[斯特伦尼科夫等。，1993;山本等。，1996;瓜奇等。，1997;迈克利斯等。，1997])在下一轮DNA合成前的G1期出现峰值表达。

在细胞周期结束时，细胞必须退出有丝分裂，以便进行下一轮分裂。为此，蛋白质系统会抑制Clb-Cdc28p的活性。其中一种蛋白质是Sic1p，已知其表达在此时达到峰值(多诺万等。，1994). 许多抑制Clb-Cdc28p或使细胞退出有丝分裂的蛋白质被称为细胞周期调节蛋白，并在M期达到峰值。我们还发现数据库20（在功能上与数据库2)是细胞周期调节的，在G2达到峰值。

配对

至少有19个直接参与交配的基因受到细胞周期调控。其中包括交配信息素（a因子和α因子），也许最有趣的是，还包括交配型中心转录因子MATα1本身。MATα1与Mcm1结合DNA(Sengupta和Cochran，1991年)并诱导α特异性基因的表达。先前的研究表明，参与交配的一些基因受细胞周期调控，这种调控是由于Mcm1和Ste12之间的协同结合。MATα1转录因子本身振荡的事实提供了另一种机制，通过这种机制，参与交配的基因可能受到细胞周期的调节。我们在其中几个基因的上游区域发现了Mcm1位点，包括MATα1。交配相关基因的调控显然很复杂，涉及到几个转录因子。然而，似乎大多数这些转录因子以某种方式与Mcm1合作。事实上，许多交配功能都是由细胞周期调节的，包括一种α-特异性转录因子，这有助于解释交配、开始和细胞周期之间的深层联系。例如，如果交配中涉及的基因在开始时被多种机制关闭，这有助于解释通过开始的传递如何阻止交配。

细胞周期控制基因

在我们确定的参与细胞周期控制的19个基因中，有17个已知受细胞周期调控。这组主要包括细胞周期蛋白和转录因子，它们的活性和作用时间都有很好的记录（参见科赫和纳斯密斯，1994年;安德鲁斯和米斯迪，1998年). 我们最新确定的两个调控细胞周期的基因是白色3和高铁7号线.

蛋氨酸生物合成

许多参与蛋氨酸生物合成的基因都是受细胞周期调控的，这是一个出乎意料且有些令人惊讶的结果。有许多可能性。首先，细胞内可用的蛋氨酸库实际上比任何其他氨基酸都要少；因此，蛋氨酸可能会限制(琼斯和芬克，1982年). 事实上，Unger和Hartwell（1976）注意到，对硫或蛋氨酸的饥饿会有效地导致G1期阻滞，这表明细胞周期的进展对蛋氨酸的可用性特别敏感。他们还发现，蛋氨酸tRNA合成酶的一个对温度敏感的等位基因会导致G1期阻滞，即使存在蛋氨酸。这些观察结果表明，蛋氨酸基因的细胞周期调控确保了该生物合成途径在下一个细胞周期中有足够的蛋白质合成能力；如果资源不足，G1就会被捕。

众所周知，构成硫氨基酸生物合成途径的20多个基因在转录水平上受到协调调控。当细胞内的S公司-腺苷甲硫氨酸，途径的终产物（甲硫氨酸tRNA是另一终产物）(托马斯等。，1989). 因此，第二种可能性是S公司-当细胞进入S期时，腺苷蛋氨酸被耗尽，导致这些基因的去表达，从而导致细胞周期调节。

第三种可能性是，实际上抑制这些基因的蛋白质Met30p的含量有限，由于某种原因，在S期或之前滴定，导致这组基因的协同去表达。支持这一观点的数据是，Met30p作为靶向Swe1降解的F-box蛋白参与细胞周期调控(凯撒等。，1998;巴顿等。，1998).扫描1转录是细胞周期调控的(妈妈等。，1996)（我们的分析重述了这一观察结果），在G1/S相界处达到峰值。因此，在蛋氨酸生物合成相关基因被Met30p抑制之前，已知Met30p底物的浓度增加。因此，Met30p可能会受到限制，从而允许MET基因的表达。我们不知道这些基因的细胞周期调控对其功能是否重要。

有趣的是，另一种F-box蛋白，Grr1，也参与细胞周期调节，调节HXT公司基因（己糖转运蛋白）。这个下一页基因是一组非常弱的细胞周期调控基因的成员，这些基因在M/G1中达到峰值，其中还包括第一阶段和RGA1公司（图中可见​图1B1B）。因此，参与细胞周期控制的两种不同的F-box蛋白也调节提供营养素的基因，而这些营养素相关基因对细胞周期的调节较弱。这些F-box蛋白可能在某种程度上协调营养物质的利用与细胞周期。

其他营养基因

细胞周期调控的营养相关基因中有很大一部分参与了必需矿物质和有机化合物在细胞膜上的运输。由这些转运蛋白移动的一些化合物是氨基酸(GAP1），氨(平均零售价和环境保护计划3)、糖（例如。，HXT1型和RGT2型)、和铁(场效应晶体管3和飞行时间1). 我们还鉴定了酸性磷酸酶（例如。，电话3和电话8). 几乎所有这些基因都在M和M/G1期细胞周期后期达到峰值表达。

发育途径基因：孢子形成和假菌丝生长

许多与特殊发育途径中的功能相关的基因显示了细胞周期调控。这些包括明显的孢子化特异基因SPS4系列和SSP2型，其分别在M和M/G1中具有峰值表达。这些可能代表以下情况SPO12号机组已知其在有丝分裂和减数分裂途径中的功能(Klapholz和Esposito，1980年;Toyn和Johnston，1993年).

Y′基因

虽然Y′基因并不是严格意义上的功能类别，但它形成了一组有趣的共调控基因。Y′序列是在许多染色体上发现的仅靠近端粒本身的着丝粒的重复序列。在Y′元件内有两个开放的阅读框，有适当的剪接信号表明它们形成了一个大的产物，尽管实验尚未表明这些位点是功能性的(路易斯和哈伯，1992年;路易斯，1995年). 这两个ORF中较大的（端粒近端）与RNA解旋酶相似，包含解旋酶活性所必需的所有基序(路易斯和哈伯，1992年). 然而，这些ORF之间的序列相似性很高，我们无法区分这些元素中的一个、几个或全部是受细胞周期调控的。

与先前分析的比较

我们识别受细胞周期调控的基因的方法的一部分依赖于对已经发表的大量数据的检查。赵等. (1998)使用不同的技术和方法进行了与我们类似的研究。我们的方法可以聚合来自许多实验的数据，从而提高总数据集中的信噪比。它也说明了从这种基因组规模的实验中获得原始数据的价值和必要性。数据来自赵等. (1998)有助于我们识别一些受细胞周期调控的基因。图​图99图中显示了位于x轴附近的几个点，这些点代表了细胞周期调控基因的识别明显依赖于Cho的数据等.剩余基因的细胞周期调控评估，如图所示​图9，9，无论Cho的数据等包括。

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图9

CDC总分在很大程度上独立于cdc28数据集。使用cdc15和α因子实验（绘制在y轴上）或使用cdc15α因子和cdc28实验（x轴）。为每个基因绘制一个点。需要注意的是，添加数据会增加分数的绝对值；然而，正是相对大小表明了细胞周期的调节。

我们的结果与赵等。(1998)是指细胞周期调控基因的数量。通过人工决策过程，他们发现421个基因受细胞周期调控。我们的800个基因包括其中的304个，但在我们的数据中，其他117个似乎没有明显的细胞周期调控。因此，我们的800个基因集包含496个Cho未识别的基因等。

这两项研究的实施方式存在许多技术差异，很难说这些差异是如何导致结果之间的差异的。我们分析的一个显著优势是实验的多样性，从中我们可以确定细胞周期调节的特征模式。这使我们能够区分细胞周期调控和混杂模式，例如当培养物从一种温度转换到另一种温度时，由热休克反应引起的模式。

这两种分析之间最大的差异之一是关于每个细胞周期可能出现两次峰值的基因。我们确定了10个受细胞周期调控的基因，根据赵等。(1998)显示出一个以上的峰，但在表达中没有单个显著的峰。我们的算法旨在寻找具有单一表达峰值的基因；它严重影响了一个以上的峰值。此外，在这些情况下，对总数据的目视检查并没有显示出多个峰值。因此，我们认为聚合数据集不支持这些基因存在多个表达峰值。这就意味着可能还有其他基因在每个细胞周期中都有一个以上的峰值。

两组数据中许多不同的基因具有较低的峰谷比和相对较差的CDC总分。我们鉴定出更多适度调控的基因也许是很自然的，因为我们进行了大量的实验，并且采用了统计方法而非手工方法进行鉴定。然而，值得注意的是，其中一些差异存在于细胞周期调控非常强的基因中。赵等。(1998)未能找到FKS1（FKS1）,GOG5公司,EGT2型、两个组蛋白基因和其他几个具有很强调控的基因。包含Cho数据集之前等。，我们找不到HO。相当多的强调控基因没有被Cho识别等。已知受Cdc28p（与Cln3p或Clb2p组合）相当直接调控的基因。这样的表达川东北28-依赖基因可能在cdc28-13Cho的块释放实验等。

转录调控机制

我们对清单中的800个基因进行了已知细胞周期转录因子结合位点的检测，其中一半以上的基因与峰值表达期相关的已知位点匹配良好。此外，近70%的相同基因对Cln3p或Clb2p诱导（或两者）表现出显著反应。此外，我们确定了细胞周期调控的其他基因集，这些基因形成功能通路，并且已知是协同调控的（例如，蛋氨酸生物合成基因）或已知其调控的一些东西（例如，己糖转运蛋白）。因此，我们在一定程度上了解了约500个基因的细胞周期控制的分子机制，这是一个令人满意的数字。

然而，这留下了约300个基因，我们没有合适的细胞周期转录因子的良好结合位点，也没有发现任何引人注目的新位点。因为这300个基因往往是调控较弱的基因，可能其中一些包含已知因子的退化位点，因此在我们的搜索中被遗漏了（通常不允许错配）。或者，这些基因中的一些可能由我们未能识别的新位点控制；其他可能以组合方式由已知因素控制，使得峰值表达在意外的时间。另一种可能性是，这些转录物中的一些可能以其他方式控制，例如通过mRNA稳定性。我们的数据集为进一步研究这些问题提供了肥沃的土壤。

这些数据为我们提供了细胞周期中转录控制逻辑电路的部分图片。Cln3p-Cdc28p对MBF和SBF的作用在G1和S中诱导了大量基因（≥200）。此外，M通过Clb2p-Cdc28p的作用使其受到抑制。同时，Clb2p-Cdc28p通过MCM1+SFF作用，诱导其自身的基因群，其数量可能>50。这些基因包括重要的转录因子Swi5p；一旦其转录被诱导，它就可以进入细胞核（可能是因为Clb2p-Cdc28p活性下降）(莫尔等。，1991)，另一组基因被激活。其中包括CDK抑制剂SIC1公司，这对于停用Clb2p-Cdc28p很重要。Clb2-Cdc28活性的丧失导致所有Clb2p-依赖性转录物的转录崩溃，此外，允许Cln3p-Cdc28p重新激活MBF和SBF以开始新的细胞周期。这幅图中的一个缺口是，我们不了解MCM1位点（ECB）M/G1期表达的基因的振荡。也就是说，ECB或Mcm1p是什么使这些基因的表达受到细胞周期调控的？第二个遗漏是，我们不太清楚如何CLB2类虽然部分答案肯定在于Clb2p蛋白稳定性和Clb2p-Cdc28p活性的调节，但它首先是诱导的。

细胞周期调控的功能意义

细胞周期调控研究的重点是具有细胞周期特异功能的基因。也就是说，它们是基因，其功能只在循环的一部分中需要。例如，这些基因直接参与DNA复制、出芽和有丝分裂。对于一些这样的基因，转录调控可能是一个保护资源的问题。例如，表达可能不会造成很大伤害CDC9公司（DNA连接酶）组成。然而，只有在需要时，通过表达它和数百个其他类似基因，细胞才能获得一个小小的优势。此外，酵母菌经常会遇到所谓的“睡美人”情况：它们休眠数周或数月，然后被要求在停止的地方恢复生命。在休眠期内，自行车运动所需的基因显然不需要，但在休眠后立即非常需要。因此，细胞周期调控的表达可以确保循环细胞始终可以获得必要的基因产物。在这方面，值得注意的是，富含嘌呤的基序AAGAAAAA(帕尔维兹等。，1998)被认为对葡萄糖反应很重要；该基序在从稳定期向快速生长的转变中可能很重要，我们发现类似的基序在几种细胞周期调控基因的启动子中富集。也就是说，这些基因可能受到生长调节和细胞周期调节。

其他具有细胞周期特异功能的基因充当调节器或开关。对于这些基因来说，不仅重要的是它们到底何时开启，也重要的是何时关闭。一个很好的例子是Clb2p，它对有丝分裂事件很重要，但对G1事件具有拮抗作用。Clb2p受到高度调节：其转录受到调节；调节蛋白质的稳定性；Clb2p-Cdc28p复合物的活性受磷酸化、去磷酸化和抑制剂结合的调节。这些调控机制中的任何一种对生存能力来说都是不可或缺的，但如果失去了几个，那么解除管制的Clb2p都是致命的。因此，控制开关的基因的转录调控可能是其功能的核心。

细胞周期调控转录可用于以高度可控的方式构建结构。这可以用细胞调控DNA复制的策略和细胞调控出芽的策略之间的一些相似性来说明。这两个过程都发生一次，并且每个周期只发生一次；也就是说，细胞既必须启动该过程，也必须防止重新启动。在这两种情况下，细胞都会构建一个起始结构，对于复制前复合体，该结构包含起源识别复合体成分、Mcm蛋白和Cdc6p，对于芽前位点，该结构则包含芽蛋白（和其他）。在这两种情况下，转录控制在特定时间提供启动复合物的关键成分，以便复合物能够有序构建；然而，这些建筑群以后不可能在不合适的时间轻易重建，部分原因是这些组件不再可用。复制和萌芽起始复合物的构建发生在复制或萌芽实际发生之前很久，因此，复合物的关键成分（例如，Mcms、Cdc6p、Bud4p和Bud8p）在使用之前很久就在M阶段提供了。

这些类型的细胞周期调控基因是众所周知的。然而，由于我们的鉴定是相对完整和包容的，并且由于鉴定方法不是假设驱动的，我们能够找到非常意外类型的细胞周期调控基因。特别是，我们发现许多细胞周期调控基因的功能基本上不是细胞周期特异性的。这些包括参与分泌和脂质合成的基因，这些基因可能在任何时候都需要，至少在某种程度上是需要的。在这些情况下，细胞周期调节的作用可能是在有额外需求时，即在出芽时，提供额外的转录物。这种基因最好的一个例子可能是项目管理A1，编码主要的质膜质子泵，一种稳定的蛋白质。这个项目管理A1功能是必不可少的，尽管在整个细胞周期中都需要它的功能(塞拉诺等。，1986)，其转录是强周期的。峰值表达可能与芽中质膜生长最快的时间相一致；可能需要周期表达式来提供项目管理A1用于子单元。在这种情况下，存储项目管理A1事先，因为过量项目管理A1有毒，导致细胞内膜结构积聚(埃斯皮奈等。，1995). 细胞周期调控项目管理A1可以部分地被认为是化学计量问题的答案。化学计量因素对其他细胞周期调控基因也很重要，尤其是组蛋白、SPB成分和微管。

我们感谢Jon Mulholland、Holly Sundberg、Trisha Davis、Anita Sil和Lee Hartwell提供的帮助和有益的对话。我们也感谢那些帮助完成繁琐的微阵列制造任务的人（Cammy Kao、Audrey Gasch、Tracy Ferea、Joseph DeRisi、Craig Cummings和Barbara Dunn）。赫尔曼·维恩（Herman Wijnen）、马克斯·迪恩（Max Diehn）和道格·罗斯（Doug Ross）对手稿的批判性阅读值得感谢。基因组数据库，特别是酵母菌属基因组数据库(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces网站/)和酵母蛋白质数据库(http://quest7.proteome.com/YPDhome.html). 这项工作得到了美国国立卫生研究院对D.B.（GM46406和CA77097）、B.F.（GM45410）、P.O.B.（HG00450）和M.Q.Z（HG01696）的资助。这项工作也得到了霍华德·休斯医学研究所的支持。P.O.B.是霍华德·休斯医学研究所的助理研究员。M.Q.Z.还获得了冷泉港实验室协会奖的支持，G.S.获得了陆军部博士后奖学金（DAMD17-97-1-7316）的支持。