结果
STRA6增强NIH 3T3细胞的视黄醇摄取
为了证实STRA6介导细胞摄取维生素A，我们建立了稳定的NIH 3T3细胞系，表达人STRA6和人卵磷脂：视黄醇酰基转移酶（LRAT）。为了获得表达这两种蛋白的细胞系，我们引入了一种人类STRA6系列将基因构建到表达人LRAT的NIH 3T3细胞中。免疫印迹和免疫组织化学证实STRA6的表达。ID4标记的STRA6定位于质膜，在一定程度上定位于内质网，如与钙网蛋白的融合图像所示(). 为了测定STRA6介导的holo-RBP4对视黄醇的摄取，我们用8μM holo-RBP 4培养不同细胞系16小时，然后用高压液相色谱法（HPLC）分析其视黄醇含量。色谱图显示，与仅表达STRA6的细胞相比，同时表达STAR6和LRAT的细胞对holo-RBP4的视黄醇摄取显著增强(). 观察到无论是视黄酯（RE）还是所有-反式-在表达STRA6的细胞中检测到视黄醇，这表明LRAT在有效摄取视黄醇到靶细胞中起着关键作用。为了量化视黄醇摄取的差异，我们通过用holo-RBP4培养STRA6/LRAT-和LRAT-表达细胞来确定这一过程的动力学。该实验显示，表达STRA6和LRAT的细胞对视黄醇的摄取量高达8倍(). 视黄醇的摄取和酯化遵循双曲线动力学，培养25小时后达到饱和。
视黄酸依赖于STRA6的摄取和释放（A） 用免疫组织化学和共聚焦显微镜检测NIH 3T3细胞中稳定表达的1D4表位（蓝色）标记的STRA6的亚细胞定位；用抗钙网蛋白多克隆抗体（red）检测钙网蛋白。比例尺=20μm。
（B） 用8μM holo-RBP4孵育后，代表STRA6-、LRAT-和STRA6/LRAT-表达细胞的维甲酸成分的色谱图。星号表示所有-反式-视黄醇迁移。
（C） 视黄醇摄取的时间过程。LRAT-和STRA6/LRAT-表达细胞与8μM holo-RBP4孵育。在指定的时间点测定细胞的维甲酸含量。数值代表三个独立实验的平均值±SD。
（D） 视黄醇的STRA6依赖性释放。用10μM all培养细胞-反式-实验前16小时服用视黄醇。然后用PBS清洗细胞，并添加含有8μM apo-RBP4的新鲜培养基。16小时后，收集培养基并通过HPLC测定维甲酸成分。数值代表三个独立实验的平均值±SD。
（E） 视黄酸摄取不依赖于STRA6。Apo-RBP加载了所有-反式-维甲酸（RA）并通过快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化。通过吸收光谱（插图）确认RA负载效率。将稳定表达STRA6和LRAT的NIH 3T3细胞与8μM RA-RBP4或8μM RA孵育过夜。用反相色谱法测定维甲酸组成。
STRA6介导视黄醇的双向转运
接下来，我们讨论了STRA6是否也通过添加所有-反式-在培养基中加入视黄醇（10μM），用RE预加载STRA6/LRAT-和LRAT-表达细胞。两种细胞株在与所有细胞株孵育后均产生相当数量的RE-反式-视黄醇（参见图S1在线提供）。然后用PBS缓冲液清洗细胞，以去除所有-反式-视黄醇。随后，添加含有8μM apo-RBP4的新鲜培养基。培养16小时后，我们通过HPLC分析培养基的维甲酸成分。事实上，所有-反式-与仅表达LRAT的细胞相比，在同时表达STRA6和LRAT细胞的培养基中，视黄醇显著增加(). 因此，STRA6似乎是一种与RBP4合作调节视黄醇双向转运的通道或转运蛋白。
RA的摄入不依赖于STRA6
由于STRA6缺乏会导致各种器官的多系统发育畸形，因此有人建议STRA6在RA的摄取中发挥作用，RA是发育过程中具有生物活性的维生素a衍生物(Golzio等人，2007年). 为了在细胞培养系统中验证这一假设，我们用RA加载apo-RBP4，并将表达STRA6和LRAT的细胞与holo-RA-RBP4复合物孵育16小时。尽管我们发现RA与RBP4结合(，插图），RA在STRA6/LRAT表达细胞中没有积累。相反，未与RBP4结合的RA被这些细胞有效吸收()在这些细胞中可以检测到各种RA立体异构体。因此，我们在细胞培养中没有发现证据表明STRA6可以介导全RA-RBP4复合物对RA的摄取。
的表达式视黄醇结合蛋白4和街道6斑马鱼开发
接下来，我们使用斑马鱼在动物模型中分析Stra6的功能。安视黄醇结合蛋白4最近在这种硬骨鱼中发现了同源基因(Tingaud-Sequeira等人，2006年)还有一条斑马鱼街道6Ensembl数据库中也报告了同源基因(www.ensembl.org/Danio_rerio/index.html). 两者都有视黄醇结合蛋白4和街道6斑马鱼的基因似乎是单拷贝的(www.ensembl.org/Danio_rerio/index.html). 我们通过RT-PCR克隆了相应的cDNA，并在全长克隆后验证了它们的序列。斑马鱼Stra6和Rbp4的预测氨基酸序列与它们的小鼠和人类对应物完全一致(图S2). 然后我们分析了街道6和视黄醇结合蛋白4全山原位杂交（WISH）反义RNA探针的mRNA表达模式(). 斑马鱼视黄醇结合蛋白4在卵黄合胞层中表达，从分割阶段开始，随着发育持续存在于这些细胞中(). 我们还用抗人Rbp4的抗血清进行免疫印迹分析，验证了Rbp4在蛋白水平上的表达(). 的表达式街道6在体细胞发生早期的卵黄合胞体和头部和躯干的肠系膜细胞中检测到(). 在受精后24小时（hpf）街道6在其中一些组织中似乎保持不变，尽管水平有所下降（数据未显示）。此外，染色街道6mRNA在前体节可检测到()已经证明有助于RA的产生，促进后脑发育(Begemann等人，2001年). 此外，街道6在这个胚胎阶段在眼睛原基和松果体中表达(). 松果体是一个对光敏感的内分泌器官，需要维生素a才能产生松果体特有的视紫红质(Ziv和Gothilf，2006年). 在发育后期，街道6表达仅限于发育中的眼睛和松果腺()在其他组织中未检测到。受精后4天（dpf）幼虫眼睛的交叉切片显示街道6mRNA在视网膜色素上皮（RPE）中表达().
街道6和视黄醇结合蛋白4斑马鱼发育过程中mRNA表达的原位杂交分析（A） 在12体节期，街道6mRNA（蓝色）在卵黄合胞体和头部和躯干的肠系膜细胞中表达。在眼睛原基、松果腺（PG）和前体节（箭头）中也可以检测到染色。
（B） 受精后24小时（hpf），染色街道6（蓝色）见于发育中的眼睛、中脑前部、松果腺（PG）和前体节（箭头）。
（C和D）在受精后第3天和第4天（dpf）幼虫期，街道6mRNA在眼睛和松果体中表达。
（E） 通过一只4 dpf幼虫的眼睛进行的交叉切片显示街道6视网膜色素上皮（RPE）表达（蓝色）。
（F和G）视黄醇结合蛋白424 hpf（F）和48 hpf（G）胚胎中的mRNA表达（蓝色）。染色图案表明视黄醇结合蛋白4表达于卵黄合胞层。
（H） 15 hpf胚胎中Rbp4表达的免疫印迹分析。使用小鼠血浆（0.1μl）作为对照。
比例尺=100μm。在所有图片中，前面都位于左侧。
Stra6基因敲除导致胚胎畸形
我们使用了反义吗啉寡核苷酸（MO）方法(Nasevicius和Ekker，2000年)进行Stra6功能丧失研究。我们设计了两个针对5′区域的非重叠MO街道6mRNA，覆盖碱基−27至−3（MO1）和−1至+24（MO2）。此外，我们使用剪接供体位点MO（MO3）来删除街道6信使核糖核酸(). 该外显子的缺失导致相应mRNA编码区的移码，从而破坏编码的Stra6蛋白的C末端部分。将这些MO中的每一个注射到受精卵中后，我们通过显微镜确定Stra6缺乏是否会导致发育异常。注射了三种MO中的任何一种的大鼠出现小眼症，身体轴弯曲，并出现心脏水肿(). 这种表型在MO1和MO2处理的胚胎中均匀存在（98%），但在MO3处理的胚胎中频密性较低（约20%）。RT-PCR分析证实了街道6从2 dpf MO3处理的畸形变形体中分离出的mRNA，而一些野生型街道6在没有严重畸形的MO3变体中仍然可以检测到mRNA(). 为了证实用MO1和MO2处理的变形体中Stra6缺乏，我们测定了4只dpf幼虫的眼视黄醇水平，这些幼虫在此阶段应该已经发育出功能性光感受器(复活节和尼古拉，1996年). HPLC显示，这些变体中的总头部维甲酸水平显著降低(). RE是最丰富的维生素A衍生物，与此发育时间点RPE中眼睛特异性Lrat的表达一致(Isken等人，2007年). 11-顺式-视网膜是视觉色素的发色团，在MO1和MO2变形幼虫中也可以检测到，但显著减少(). 因此，Stra6的靶向敲除导致幼虫眼睛维生素a缺乏和严重的胚胎畸形。
Stra6靶向基因敲除导致胚胎异常和发育期眼睛维生素A缺乏（A） 斑马鱼的结构示意图街道6基因。白色方框表示5′-和3′-素数非翻译区域（UTR），黑色方框表示街道6mRNA。
（B） 针对街道6mRNA。MO1和MO2的绑定会阻止街道6mRNA。对于外显子5的缺失，MO3靶向第5外显子剪接供体位点街道6前mRNA。
（C） 利用第5外显子延伸引物MO3-up和MO3-down进行RT-PCR分析（参见[B]），证实了MO3-处理的变体中第5外显子的缺失。通道1，MO3处理的发育缺陷胚胎（见[D]）；第2道，对照胚胎；第3道，MO3处理的胚胎没有严重的发育缺陷；第4道，控制胚胎。
（D） 3dpf控制和特性的照片街道6变形幼虫分别注射MO1、MO2和MO3。
（E） 视黄酯（RE）和11-顺式-与对照幼虫相比，4dpf MO1和MO2变体头部的视网膜水平。数值代表三个独立实验的平均值±SD*通过Student t检验，与对照组相比，p<0.005。
街道6胎儿发育严重的胚胎缺陷
接下来，我们进一步分析了Stra6缺陷胚胎的畸形形态细节。4只dpf幼虫眼睛的交叉切片证实了小眼畸形，但显示了正常分层的不同视网膜细胞层(). 此外，变形体表现出心脏水肿和变形的心室(). 为了更好地显示心脏的病理改变，我们将MO2注射到一种表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的鱼类菌株中，该菌株在控制第1页所有血管和心脏中的促进剂(劳森和温斯坦，2002年). 共焦成像显示，变形人的心脏没有环形，心房像气球一样扩张(). 体内观察表明，Stra6缺陷胚胎（n=100）仍能检测到心脏收缩。然而，在心脏水肿最严重的变形体中（约30%）()，血液没有循环，血红蛋白染色显示头部有渗出的红细胞(). 由于变形体也表现出颅面骨形态的改变，我们用阿尔西安蓝染色软骨(). 第一和第二足弓畸形，鳃弓缺失(). 因此，Stra6缺陷斑马鱼胚胎发育出多系统畸形，与马修·伍德综合征患者所描述的畸形相似(Golzio等人，2007年;Pasutto等人，2007年).
斑马鱼Stra6缺乏导致多系统畸形（A和B）通过4 dpf对照（A）和MO2变体（B）幼虫眼睛的交叉截面。这个街道6变形眼较小，但呈现不同视网膜层的规则分层。五十、 透镜；视网膜色素上皮；ONL，外核层；OPL，外丛状层；INL，内核层；IPL，内丛状层；ON，视神经；GCL，神经节细胞层。
（C–E）对照组（C）和MO2-处理的变体（D和E）心包区域的特写视图。（D）中显示的心脏特征代表70%的变体；（E）中显示的心脏特征代表30%的变体（n=100）。注意，由于（E）中的循环中断，心脏中没有红细胞。
（F和G）3 dpf对照组（F）和MO2-处理组（G）心脏的三维视图TG（飞行1:EGFP）Y1型胚胎。血流用虚线表示。心室（V）在左侧，心房（A）在右侧。
（H和I）对照组（H）和2 dpf MO2处理的（I）胚胎的心脏表型如血红蛋白染色（E）所示。在对照组中，红细胞染色主要在心脏和卵黄上方的传入血管中检测到。在变形体中，心脏和传入血管中的血红蛋白大大减少，但头部可见红细胞外渗（见箭头）。
（J和K）5 dpf对照组（J）和MO2处理的变形体（K）幼虫颅面骨骼软骨的阿尔西安蓝染色。Stra6缺乏症患者的Meckel软骨（m）、腭喹酯（pq）和角质玻璃（ch）变形，角质枝体（星号）染色高度减少。
动物在无PTU的水中饲养。在所有图片中，前面都位于左侧。
比例尺=100μm in（A）–（E）和（H）–（K）。
Stra6缺乏导致几个胚胎组织中RA过量
正如许多研究所证明的那样，RA缺乏会导致斑马鱼和小鼠的神经管、体节、心脏和眼睛的模式缺陷(Begemann等人，2001年;Grandel等人，2002年;Hamade等人，2006年;基根等人，2005年;Niederreither等人，1999年). 因此，对变形体中多效性畸形的解释可能是Stra6在获取维甲酸信号所需的卵黄维生素a中的作用。然而，与街道6体细胞发生时的mRNA表达，我们通过双重WISH染色发现后脑和体节的正常模式krox20/myoD变体中的标记(). 分析第6.1页作为一种眼科标志物，21个体节胚胎的视网膜推测略小于正常值(). 然而，视网膜的腹侧部分没有丢失，这是RA-缺陷斑马鱼胚胎的特征(凯悦等，1996年;Marsh-Armstrong等人，1994年).
对照组和对照组标记基因表达的比较街道6Morphant胚胎标记基因和所示胚胎的发育阶段。左侧为对照胚胎；街道6右侧显示了变形胚胎。动物在无PTU的水中饲养。
（A和B）双重染色克罗克斯20和肌营养不良揭示了后脑菱形肌和体节的正常模式。此外，菱形节5（R5）和第一体节（1s）之间的距离在对照胚胎和变形胚胎之间是相当的。
（C和D）染色第6.1页（蓝色）在21体节期显示，推测的视网膜在街道6变体比对照中的变体多，但第6.1页mRNA在前后轴上的表达具有可比性。
（E–J）染色cyp26a1mRNA表达。
（E和F）cyp26a1在23体节期，对照组和MO2变体的mRNA表达无明显差异。
（G–J）cyp26a1与对照组（I）相比，MO2处理的变形体在发育中的眼睛中的mRNA表达降低（[G]中的箭头），但在心包区（[H]中的箭）和变形胚尾部（J）出现较深的染色。
比例尺=100μm。在所有图片中，前面都位于左侧。
接下来我们分析了cyp26a1mRNA水平。这种视黄醇羟化酶将RA分解为极性代谢物，其mRNA水平以依赖于RA的方式上调(Abu-Abed等人，2001年;Emoto等人，2005年). 在23个体节胚胎中，我们发现cyp26a1基因变体与对照之间的mRNA表达(). 在31 hpf时，cyp26a1变形体眼睛发育过程中信使核糖核酸表达减少但并非缺失(). 有趣的是，cyp26a1眼部外的表达增强，例如心包区()以及MO2变形胚胎的尾部(). 因此，Stra6的靶向敲除不会在早期发育阶段导致胚胎RA缺乏，而是会导致一些组织在发育过程中产生过量RA。
降低RBP4水平可缓解胚胎缺陷
根据对高架桥的观察cyp26a1我们推测，在没有Stra6的情况下，holo-Rbp4可能会导致局部非特异性RA过量，例如在发育中的心脏。因此，我们试图通过用酪氨酸酶抑制剂1-苯基-2-硫脲（PTU）在药理学上降低Rbp4水平，以及通过阻断视黄醇结合蛋白4mRNA翻译视黄醇结合蛋白4-MO覆盖的−6到+19视黄醇结合蛋白4mRNA。PTU抑制斑马鱼的色素沉着，也被证明下调视黄醇结合蛋白4幼虫期mRNA的表达(Tingaud-Sequeira等人，2006年). 为了证实PTU在胚胎发育期间降低Rbp4水平，我们进行了WISH和免疫印迹分析。两者都有视黄醇结合蛋白4在24 hpf对照和MO2变形胚胎中，200μM PTU的存在降低了mRNA表达和Rbp4蛋白水平(). 我们还通过免疫印迹分析证实了Rbp4水平的降低视黄醇结合蛋白4-MO处理的胚胎(). 为了证明胚胎Rbp4水平降低导致卵黄维生素a动员减少，我们测定了4 dpf幼虫的维甲酸水平。当动物在PTU的存在下饲养时，幼虫眼睛中的维甲酸含量显著降低，但躯干中的维a酸含量显著增加(). 同样，视黄醇结合蛋白4变形物显示眼睛中的维甲酸水平显著降低，躯干中的维酸水平显著增加(). 重要的是，PTU和视黄醇结合蛋白4-MO治疗未引起明显的发育异常()，如小眼症和心脏缺陷，正如我们在Stra6缺陷胚胎中发现的那样。
PTU和视黄醇结合蛋白4-MO治疗可防止发育异常街道6Morphants公司（A）视黄醇结合蛋白4PTU处理的胚胎中mRNA表达（蓝色）降低。
（B） 4 dpf对照组和PTU-和视黄醇结合蛋白4-MO处理的幼虫。数值代表三个独立实验的平均值±标准差*与Student t检验的对照组相比，p<0.02。
（C） PTU、PTU和MO2处理的24 hpf胚胎中Rbp4水平的免疫印迹分析（左），以及视黄醇结合蛋白4-MO（右）与相应控件进行比较。Ponceau S红色滤膜显示为负载控制（下面板）。
（D）街道6在有PTU和无PTU的情况下饲养变形体和对照组（n=170）。显示了3只dpf幼虫的代表性照片。PTU治疗预防了73%患者的发育异常街道6变体。在没有PTU的情况下街道6变形体显示心脏水肿（星号）。
（E） 从卵母细胞中培育的幼虫视黄醇结合蛋白4-MO或与视黄醇结合蛋白4-MO和MO2。这些变形幼虫是在没有PTU的情况下饲养的。视黄醇结合蛋白4变形幼虫无发育异常（n=120）。共注视黄醇结合蛋白4-MO和MO2在很大程度上预防了77%的复合变形体（n＝120）的发育异常。
比例尺=100μM in（A）和500μM in（D）和（E）。在所有图片中，前面都位于左侧。
为了确定Rbp4水平的降低是否可以防止MO2变体的发育异常，我们对在有无该化合物的情况下饲养的变形幼虫进行了显微镜分析（每种情况下n=170）。当MO2和PTU联合治疗时，73%的变形体可防止明显的发育畸形(). 相比之下，几乎所有在没有PTU的情况下饲养的MO2处理胚胎都表现出心脏水肿和心脏腔室形态改变(). MO2和视黄醇结合蛋白4-MO还可以防止77%的胚胎出现发育障碍，而所有仅注射MO2的兄弟姐妹都会出现特征性异常(). 因此，通过PTU药物治疗或通过视黄醇结合蛋白4-MO治疗可以降低Stra6缺陷斑马鱼胚胎的高死亡率。
讨论
维生素A在脊椎动物的整个生命周期中都是必需的，例如视觉、细胞增殖和分化。全部-反式-视黄醇结合RBP4（holo-RBP4）是存在于人类和大多数脊椎动物循环中的最丰富的类视黄醇衍生物。在人类中，遗传性血视黄醇缺乏症已被描述为一个具有复合杂合错义突变的家族RBP4模式两名受影响的受试者视力下降、夜盲和轻度眼底萎缩(Biesalski等人，1999年). 与这些缺陷一致的是，RBP4缺陷小鼠的表型正常，但早期视力受损(Quadro等人，1999年). 因此，人们普遍认为RBP4是维持眼部维生素A依赖性视觉过程所必需的，但对胚胎RA的产生并非必需。最近，STRA6被认为是一种holo-RBP4受体，促进维生素a进入靶组织(Kawaguchi等人，2007年). 因此，令人惊讶的是，STRA6缺陷会导致人类Matthew-Wood综合征，并伴有与RA信号受损相关的多系统畸形(Golzio等人，2007年;Pasutto等人，2007年). 这一发现与STRA6作为长期寻找的holo-RBP4受体的拟议作用相冲突，并表明该膜蛋白的另一未知作用。
STRA6-依赖性维生素A摄入依赖于LRAT
为了解决STRA6缺乏的生化基础，我们建立了细胞培养和动物模型。我们克隆了斑马鱼视黄醇结合蛋白4和街道6基因，并表明其表达是在功能循环发育前不久的分割阶段开始的。在幼虫后期，街道6mRNA的表达仅限于眼睛的RPE，表明该生物体从holo-Rbp4中获得维生素A以支持视力。事实上，Stra6的靶向敲除导致了幼虫眼睛的生化检测维生素A缺乏，从而验证了在活体动物模型中，Stra6作为维甲酸通道/转运体的拟议功能。
我们的细胞培养研究表明，只有那些同时表达STRA6和LRAT的细胞才能积累大量的维生素A。我们的发现是，表达STAR6的细胞缺乏类维生素A，这表明存在一种细胞内低丰度的维生素A受体。我们提供了几行证据，证明LRAT是这种受体。在细胞培养中，维生素A在细胞外和细胞内的流动是由通过LRAT向RE细胞积累的代谢转化驱动的。斑马鱼模型的研究结果进一步支持了这一观点。Lrat和Stra6都在RPE中表达，RE在发育中的斑马鱼眼睛中积累。此外，爱尔兰共和国表情，就像街道6在松果体发育早期即已在24hpf时启动，在眼睛发育早期即为56hpf(;Isken等人，2007年). LRAT对依赖STRA6的维生素A积累的这一需求在哺乳动物模型中也很明显：拉特无效小鼠眼睛和肝脏选择性缺乏维生素A(Batten等人，2004年). 因此，我们认为RBP4、STRA6和LRAT在靶组织摄取维生素A的过程中依次起作用。哺乳动物（包括人类）在肝脏、肺和眼睛等各种组织中产生RE，这一事实可能解释了STRA6和LRAT在哺乳动物中更广泛的表达(Batten等人，2004年;Kawaguchi等人，2007年)与斑马鱼相比(;Isken等人，2007年). 此外，我们发现STRA6视黄醇通道以依赖于RBP4的方式双向运输视黄醇，很可能有助于在细胞内和细胞外池之间实现维生素A的稳态浓度。这种依赖于STRA6的细胞外和细胞内小室间视黄醇水平的稳态调节可能在需要母亲持续供应维生素a的哺乳动物胚胎中发挥更重要的作用，而在快速消耗卵黄维生素a以建立视力的斑马鱼胚胎中则不然。
STRA6对维持胚胎RA平衡至关重要
我们的细胞培养分析排除了STRA6在获得RA（维生素a的发育活性形式）中的作用，正如其他人最近提出的那样(Golzio等人，2007年). 我们没有发现任何证据表明RBP4结合的RA是由STRA6表达细胞积累的。这表明STRA6具有较高的底物特异性，或需要与STRA6相互作用的细胞内RA-结合蛋白。我们对斑马鱼模型的分析表明，Stra6缺陷除了引起眼睛的类视黄醇缺陷外，还导致发育异常，如患有Matthew-Wood综合征的Stra6缺乏患者所述的眼部、心脏和颅面畸形(Golzio等人，2007年;Pasutto等人，2007年). 小粒细胞血症可能与RA缺乏有关(Marsh-Armstrong等人，1994年)但与RA-缺乏斑马鱼胚胎相比(Biehlmaier等人，2005年;Lampert等人，2003年)，Stra6缺陷胚胎的视网膜层整体分层正常。此外，我们没有观察到视网膜腹侧部分的丢失，正如在缺乏RA-的斑马鱼胚胎中所描述的那样(凯悦等，1996年). 在斑马鱼中，发育中眼睛的RA-依赖性图案过程在很大程度上依赖于β-胡萝卜素作为RA前体(Lampert等人，2003年). 因此，该过程基本上不需要holo-Rbp4提供视黄醇来生产RA。与无严重发育性眼部缺陷相一致，β-胡萝卜素和循环RE也被建议用于预防哺乳动物（包括人类）RBP4缺乏症的眼部缺陷(Paik等人，2004年). 重要的是，RA是哺乳动物发育后期视杯规格所必需的(Molotkov等人，2006年). 因此，发育中的小鼠眼睛缺乏RA生成不会导致严重的小眼畸形（临床无眼症）(Molotkov等人，2006年)正如马修·伍德综合征患者所描述的那样(Golzio等人，2007年;Pasutto等人，2007年). 因此，正如斑马鱼所证明的那样，次要影响，很可能是周围组织中RA过量，导致Stra6缺乏性小眼症。Stra6缺陷斑马鱼胚胎的心脏和颅面异常也可能归因于胚胎RA过度而非RA缺乏。这一结果是由标记基因分析表明cyp26a1在发育中的心脏中的表达以及缺乏街道6在这个器官中的表达。因此，我们推测，这些发育异常是由循环holo-Rbp4引起的，在Stra6缺乏症的循环中无法清除。为了降低胚胎Rbp4水平，我们使用了PTU，PTU是一种抑制色素沉着但也能降低视黄醇结合蛋白4表达式(;Tingaud-Sequeira等人，2006年). 此外，我们还设计了一个红细胞压4-要阻止的MO视黄醇结合蛋白4mRNA翻译。这两种治疗都降低了Rbp4蛋白水平和蛋黄维生素A的动员。更重要的是，它们在很大程度上防止了Stra6缺陷型变体的发育异常。因此，我们得出结论，在Stra6缺乏症中，未从循环中清除的Rbp4-结合维生素A会引发发育异常。这一发现可以很好地推断出哺乳动物的情况，并为RBP4和STRA6缺乏症在患者中造成截然不同后果的生化基础提供了现成的解释。
总之，我们的研究验证并扩展了川口及其同事（2007）。我们在动物模型中表明，Stra6是长期寻找的holo-Rbp4受体。在细胞培养中，我们证明STRA6视黄醇通道以依赖于RBP4的方式双向运输视黄醇。在这个过程中，维生素A在胞外和胞内小室之间的净流量是由通过LRAT的代谢转化驱动的，以支持RE的产生。此外，我们提供证据表明，在Stra6缺乏症中，Rbp4结合的维生素A未从循环中清除，会导致发育异常。STRA6和RBP4的功能障碍与马修·伍德综合征等多种人类疾病有关(Pasutto等人，2007年)和2型糖尿病(Yang等人，2005年). 因此，我们在细胞培养和斑马鱼中发现的普遍性需要在哺乳动物模型中进行进一步测试，例如Stra6型突变体和带6/Rbp4双突变小鼠。
实验程序
NIH 3T3细胞系的稳定转导
全长人STRA6系列和轻轨自动列车克隆是从美国类型培养物收藏中心购买的。为了构建逆转录病毒表达载体，STRA6系列和轻轨自动列车通过PCR扩增cDNA，并使用引物5′-GCGAGATGATTCACCATGTCGTCCCAGCCAGCAGG-3′和5′-CGTCGTAGCGGCCGCTCAGGGGCACCATTGG-3′在编码序列的末端引入EcoRI和NotI位点STRA6系列和5′-GAGGTGATTCAGCTACTACTCAGGAGAAGAACCACTGCTG-3′和5′-ACTGACGGCCGCATGAAGTTAGCCACCATAG-3′轻轨自动列车这些结构体被克隆到T.Kitamura（东京大学）提供的pMXs-IG或pMXs-IP逆转录病毒载体中(Kitamura等人，2003年). 对插入物进行排序，并确认其与STRA6系列和轻轨自动列车存放在Ensembl数据库中的参考序列(网址：www.ensembl.org). 使用标准方法生成NIH 3T3成纤维细胞的稳定转染体。
免疫组织化学
对于细胞STRA6检测，在STRA6的C末端标记一个15氨基酸表位（SATASKTETSQVAPA），该表位与小鼠视紫红质（1D4）C末端的ROS靶向序列相对应。利用引物5′-TTCTAGCGGCGCTCAGGCGCGCGCCACCTGTGTGGCGCACTATTGG-3′通过PCR引入1D4序列。通过用4%多聚甲醛将表达STRA6-1D4的NIH 3T3细胞固定在PBS中10分钟，对1D4标记的STRA6进行定位。用PBST（0.1%Triton X-100的PBS）清洗细胞三次，并在室温下用1.5%正常山羊血清在PBST中孵育15分钟，以阻断非特异性结合。然后依次用抗1D4标记的单克隆抗体和兔抗钙网蛋白多克隆抗体培养细胞。细胞在PBST中漂洗三次，并用Cy5-结合山羊抗鼠IgG和Cy3-结合山羊抗兔IgG染色以检测钙网蛋白。细胞安装在90%甘油中的2%1,4-二氮杂二环[2,2,2]辛烷中，以延缓光漂白，并使用配备钛/蓝宝石激光的徕卡TCS SP2共焦/多光子显微镜进行成像（Chameleon-XR，Coherent，Inc.）。
人RBP4的表达与纯化
人类RBP4模式克隆到pET3a表达载体中的cDNA是J.W.Kelly（斯克里普斯研究所）赠送的礼物。中用于RBP4表达式的过程大肠杆菌基于之前发布的方法，稍作修改(谢等人，1998年). 简而言之，根据标准方案，RBP4在BL21细胞中表达。这些细菌细胞被采集并通过渗透性休克进行裂解(Burger等人，1993年). 将不溶性材料沉淀，用20mM Tris-HCl（pH 8.0）洗涤三次，并溶解在7M盐酸胍和10mM DTT中。添加缓冲液（25 mM Tris-HCl[pH 8.8]）以将盐酸胍浓度稀释至5.0 M。过夜培养后，通过超速离心（120000×g，1小时，4°C）去除不溶性物质，并将收集的上清液用于RBP4复性程序。通过向含有25 mM Tris-HCl（pH 8.8）、0.3 mM胱氨酸、3.0 mM半胱氨酸、1 mM EDTA和1 mM视黄醇的混合物中滴加可溶性材料，在4°C下将RBP4重折叠。反应在4°C下持续5小时，并剧烈混合。通过超速离心（120000×g，1小时，4°C）去除沉淀物，在4°C下用10 mM Tris-HCl（pH 8.0）透析上清液过夜，过滤，并加载在DE53离子交换色谱柱上。用NaCl（0–300 mM）在10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中的线性梯度洗脱复性holo-RBP4。收集的组分通过SDS-PAGE和紫外可见光谱进行检测。将在280/330 nm处吸光度比为0.9或更高的RBP4组分汇集在一起，用十管Amicon Centriprep浓缩器浓缩至6 mg/ml，并储存在−80°C下。
用RA加载RBP4
全部-反式-如前所述，用乙醚从holo-RBP4中提取视黄醇(Cogan等人，1976年). 通过记录水相和有机相的光谱来监测视黄醇的释放效率。将apo-RBP4（2 mg/ml）在20 mM Tris-HCl（pH 8.0）中的溶液与在乙醇中递送的1 mM RA在甘油（10%）存在下在4°C下孵育2小时。样品用20mM Tris-HCl（pH 8.0）稀释，离心，并在Uno Q离子交换柱（Bio-Rad）上重新纯化。经HPLC纯化后，其吸收光谱证实了RBP4结合RA的存在。
维甲酸摄入分析
实验前20小时，表达LRAT、STRA6或STRA6/LRAT的NIH 3T3细胞在6孔培养板中以1×10的密度培养6每个孔的细胞数。去除生长培养基后，用PBS清洗细胞，并添加含有holo-RBP4的无血清培养基。培养后，用PBS清洗细胞两次，收获细胞，然后用1体积的甲醇和2体积的己烷萃取。收集有机相，在SpeedVac中干燥，并在250μl己烷中再溶解，在配备二极管阵列检测器的Hewlett-Packard 1100系列HPLC系统上通过正相HPLC分析维甲酸的组成。使用安捷伦SI柱（4.6×250 mm，5μm）和乙酸乙酯在己烷中的阶梯梯度（流速为1.4 ml/min时，15分钟为0.5%，30分钟为20%）分离视黄酯。用于RA的萃取程序和反相HPLC条件如前所述(Moise等人，2005年).
视黄醇释放试验
在实验之前，表达LRAT或STRA6/LRAT的细胞用10μM的所有培养液培养-反式-在生长培养基中放置视黄醇16小时。然后用PBS清洗细胞，并添加含有8μM apo-RBP4的新鲜培养基。培养16小时后，收集培养基，并在上述条件下通过HPLC分析维甲酸成分。
鱼类维护和菌种
斑马鱼（AB/TL菌株）在28.5°C的标准条件下繁殖和保持(韦斯特菲尔德，1994年). 为了分析心脏形态学，我们使用TG（飞行1:EGFP）Y1型应变，应变(劳森和温斯坦，2002年). 形态学特征用于确定hpf或dpf中胚胎的阶段(Kimmel等人，1995年). 如图图例所示，在有或无200μM 1-苯基-2-硫脲（PTU，Sigma-Aldrich）的情况下培养胚胎。
免疫印迹法
将胚胎（每车道五个）均质并进行SDS-PAGE。使用抗人RBP4（ab8609，Abcam）单克隆抗体以1:500稀释度进行免疫印迹分析。使用ECL系统（Amersham Bioscience）开发免疫印迹。
吗啉寡核苷酸敲除
为了靶向敲除Stra6蛋白，使用了以下吗啉寡核苷酸（Gene Tools，LLC）。用于阻塞街道6mRNA翻译，我们设计了覆盖−27至−3的MO1 5′-TGCCCAACCTATACAGCACAGAAG-3′和覆盖−1至+24的MO2 5′-GTTTATTCACAGTTTCAGCACTCATG-3′街道6mRNA。此外，我们使用MO3 5′-TATCTATTGAAGTTATACCTGTGG-3′直接针对街道6前mRNA。用于阻断视黄醇结合蛋白4mRNA翻译，我们设计视黄醇结合蛋白4-MO 5′-CTATACAGAGCCTTAACATACTCC-3′覆盖视黄醇结合蛋白4mRNA。将MO溶解在0.3×Danieau's溶液中（1×Danieu's溶液：5 mM HEPES[pH7.6]，含有58 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.4 mM MgSO4，0.6 mM钙（NO三)2)以获得1 mM（8.4 mg/ml）的储备浓度。8 ng MO1、15 ng MO2、20 ng MO3或20 ng视黄醇结合蛋白4-每个卵母细胞常规注射MO。对于铸币，15 ng MO2和10 ng视黄醇结合蛋白4-每个卵母细胞使用MO。注射量为3 nl。我们使用RT-PCR分析来确认外显子5的缺失。为此，我们根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）从2 dpf变形体和对照胚胎（每个胚胎20个）中分离出总RNA。用70 ng总RNA和SuperScript逆转录酶（Invitrogen）进行逆转录。对于PCR，我们使用Taq聚合酶（Stratagene）和引物MO3-up 5′-TTTTAGACCACACGCAACAAG-3′和MO3-down 5′-CTCAGGCATTGTGTCTC-3′。
斑马鱼幼虫中视网膜类物质的高效液相色谱分析
在提取维甲酸之前，鱼是在黑暗中饲养的。为了测定4只dpf幼虫眼睛和躯干的类视黄醇含量，我们用手术刀进行手解剖，切除头部前部，包括眼睛。如前所述进行HPLC分析(Isken等人，2007年). 对于维甲酸定量，使用规定数量的参考物质缩放峰值积分，并使用32K软件（Beckman Instruments）进行定量。统计分析采用Student t检验。
摄影
对固定在2.5%甲基纤维素/0.02%3-氨基苯甲酸甲酯（Sigma-Aldrich）中的活胚胎进行拍照。在徕卡MZ FLIII解剖显微镜和蔡司AxioCam下，在100%甘油中拍摄着色的全山胚胎。来自3 dpf的心脏共焦图像TG（飞行1:EGFP）Y1型MO2处理3 dpfTG（飞行1:EGFP）Y1型用Zeiss LSM 510 Meta垂直共焦显微镜，Achroplan 40×/0.8 W物镜，取植入1%低熔点琼脂糖中的胚胎（每个胚胎3个）。使用Imaris 3.1软件（Bitplane AG）构建三维图像。
