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基因发育。2008年10月1日；22(19): 2677–2691.
数字对象标识：10.1101/加德1695308
预防性维修识别码：项目经理2559903
PMID：18805989

TAp73基因敲除显示基因组不稳定性与不育和肿瘤抑制功能

理查德·托马西尼,1,2,12 竹原胜也,1,三，12 玛格丽塔·威廉,1 藤谷正史,4 亚历山德罗·鲁菲尼,1,5 卡罗尔·C·张,1,6 法蒂玛·可汗,7 Annick Itie-Youten公司,1 安德鲁·韦克汉姆,1 鸣声曹,8 胡安·利奥瓦纳,2 杰里米·斯奎尔,9 Igor法理学,10 大卫·卡普兰,4 格里·梅利诺,5,11 安德烈亚·尤里西科娃,7和Tak W.Mak公司1,13
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摘要

这个Trp53基因基因家族成员Trp73型编码两大类蛋白质亚型TAp73和ΔNp73，具有相反的促凋亡和抗凋亡功能；因此，它们的相对比例调节细胞命运。然而，p73亚型在肿瘤发生、胚胎发育和细胞死亡等细胞事件中的确切作用尚不清楚。为了确定p73功能的哪些方面可归因于TAp73亚型，我们制作并鉴定了编码TAp73异构体的外显子被特异性删除以产生TAp73缺陷（TAp73）的小鼠−/−)鼠标。在这里，我们表明，特异性缺乏TAp73亚型的小鼠在Trp73型−/−和Trp53基因−/−小鼠自发和致癌肿瘤、不育、衰老以及海马发育不全的发生率。此外，来自TAp73的细胞−/−小鼠表现出与非整倍体增强相关的基因组不稳定性，这可能解释了在这些突变体中观察到的自发肿瘤发病率增加的原因。因此，TAp73亚型发挥肿瘤抑制功能，并表明其在Trp73型在维持基因组稳定性方面。

关键词：第73页、肿瘤易发表型、减数分裂、不育、基因组不稳定

p73属于p53相关蛋白（p53，p63，p73）的一个小而重要的家族。这些蛋白质由Trp53基因,Trp63蛋白、和Trp73型基因分别是所有转录因子，参与发育、细胞死亡、增殖、干细胞更新、细胞命运承诺以及肿瘤发生的调节(Yang等人，2002年;Vousden和Lane 2007年). 像p53一样，已经报道了p63和p73的几种不同的蛋白质亚型，它们的功能可能与p53的功能竞争、协同或无关(Bourdon等人，2005年;Li和Prives 2007).

这个Trp73型基因，1997年发现(Kaghad等人，1997年)，包含两个启动子，通过相反的细胞作用驱动两大类p73亚型的表达：TAp73亚型别包含p73反式激活域（TA）并表现出促凋亡活性(Müller等人，2005年;Wang等人，2007年)而缺乏N末端TA结构域的ΔNp73亚型具有抗凋亡作用(Grob等人，2001年). 因此，由于所有p53家族成员之间的相互作用以及同一基因中p73亚型的相反功能的复杂性Trp73型在各种生物过程中仍有争议(McKeon和Melino 2007;施泰韦2007).

小鼠基因靶向研究表明Trp63蛋白和Trp73型是正常胚胎发生所必需的(Mills等人，1999年;Yang等人，1999年,2000). 相反，大多数小鼠缺乏Trp53基因虽然约30%的p53缺乏女性死于子宫内的神经元缺陷，但仍能存活并看起来正常(Donehower等人，1992年). 此外，Trp53基因−/−两性小鼠比野生型小鼠更容易发生自发性肿瘤(Donehower等人，1992年). 相比之下，对纯合子或杂合子小鼠的研究表明Trp73型产生了相互矛盾的结果。事实上，尽管小鼠中所有p73亚型的失活并不能增强对自发性肿瘤的易感性(Yang等人，2000年),Trp73型单倍体不足会增加自发性肿瘤的发病率，如肺腺瘤、肺腺癌、胸腺淋巴瘤、鳞状细胞增生或血管肉瘤，尤其是当与Trp53基因杂合性(Flores等人，2005年). 然而，这种基因相互作用似乎是组织特异性的Trp73型没有贡献于Trp53基因淋巴腺病中的抑癌活性(Perez-Losada等人，2005年). 很可能Trp73型−/−由于寿命缩短，小鼠模型没有显示自发肿瘤形成增强。尽管研究涉及Trp73型+/−显示肿瘤形成增强Trp73型−/−小鼠模型似乎不能完全反映人类癌症中的分子变化，在人类癌症中，TAp73/ΔNp73亚型的比率经常发生改变，而不是p73亚形的完全缺失或突变(科茨2006). 因此，尽管Trp73型−/−小鼠，异构体选择性敲除Trp73型需要真正评估p73对肿瘤发生和其他细胞过程的影响。

重叠、组合和对立功能的复杂性Trp53基因家族成员及其蛋白质亚型表明存在复杂的功能网络(Deyoung和Ellisen 2007). 在过去的几年里，一些研究表明了特定p73亚型的特殊作用(De Laurenzi等人，1998年;Murray-Zmijewski等人，2006年;Klanrit等人，2008年). 因此，这些数据表明，单个细胞中存在的各种p73亚型的比率决定了p73功能的结果，而不是每个分离的p73亚型态的活性总和。为了研究这一假设并阐明TAp73亚型的生物学作用，我们构建了缺失编码p73（TAp73）TA结构域外显子的小鼠−/−老鼠）。这些突变体仅在TAp73亚型中存在缺陷，并且仍然能够产生ΔNp73亚型别，导致TAp73/ΔNp 73比率严重失衡。我们清楚地证明了TAp73亚型具有肿瘤抑制作用，这可能是TAp73在维持基因组稳定性中发挥明显作用的结果。此外，我们证明TAp73是一种新的母体致死基因，其在小鼠体内的缺失会导致不育，其缺失类似于Trp73型导致下amp发育不全的缺陷。

结果

TAp73缺失的特征及其对Trp53家族成员表达和活性的影响

确定p73的TAp73亚型的特异性作用(图1A)，我们生成了TAp73缺陷小鼠，其中缺失了Trp73型基因(图1B)选择性地消除所有TAp73亚型的表达（补充图S1A-C）。首先，我们确认了TAp73的特异性缺失，并分析了ΔNp73、p53和p63在TAp73不同组织中的表达模式−/−老鼠。尽管p53和p63的表达没有改变（补充图S2A，D；数据未显示），但ΔNp73 mRNA在TAp73的大多数组织中上调−/−老鼠(图1C; 补充图S2B）。肺是个例外，其中ΔNp73 mRNA与野生型小鼠没有显著差异(图1C). 我们还观察到TAp73的ΔNp73 mRNA表达增强−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），即使在切除PGK-neo盒后，这种增加的表达也持续存在（补充图S1D，E），这表明观察到的ΔNp73 mRNA上调是由于缺乏TAp73蛋白，而不是由于PGK-neo-盒插入到ΔNp 73启动子附近。然而，ΔNp73 mRNA水平的增强并未反映在ΔNp 73蛋白水平的显著增加中。事实上，我们分析了TAp73在肺和卵巢中的ΔNp73蛋白水平−/−通过使用两种抗体（一种是ΔN区特异性抗体（IMG-313），另一种是所有p73亚型（C-17）a-C末端特异性抗体），组织与野生型组织进行比较，我们比较了ΔNp73亚型对应的谱带(图1D). 因此，抗体数据表明，ΔNp73转录水平的增加并不伴随ΔNp 73蛋白表达的平行增加。TAp73中ΔNp73 mRNA水平升高−/−小鼠出乎意料，因为TAp73是ΔNp73的已知转录诱导物(Grob等人，2001年). 然而，进一步的检查表明，在野生型小鼠中，DNA损伤后ΔNp73水平的下降速度比TAp73水平的下降速度更快(Maisse等人，2004年;Toh等人，2004年)由于ΔNp73的泛素化和蛋白酶体降解由as-y特征化泛素连接酶引起（B.S.Sayan、C.Piro、A.L.Yang和G.Melino，未解释）。这些数据表明，有多种机制在转录后操作以控制各种p73亚型的水平，从而导致TAp73和ΔNp73之间的复杂相互作用。尽管如此，我们的TAp73−/−敲除似乎是一只纯TAp73缺乏的小鼠，在蛋白质水平上，令人想起在人类肿瘤中观察到的TAp73/ΔNp73失衡。

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TAp73的生成−/−小鼠和上调ΔNp73表达。(A类)小鼠的结构Trp73型显示TAp73和ΔNp73亚型家族的基因。领域：（蓝色）交易激活；（橙色）DNA结合；（黄色）齐聚；（绿色）无菌α基序。(B类)目标战略。指示靶向载体与野生型的同源重组Trp73型该基因导致～1.5 kb被新基因和TAp73同种型特异性外显子2和3的缺失。显示了LoxP位点和用于Southern印迹的探针。(C类)TAp73组织中ΔNp73表达的定量+/+和TAp73−/−老鼠。TAp73中ΔNp73 mRNA水平的倍增−/−组织与野生型组织进行实时PCR比较。(**)P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。(D类)10月龄野生型和TAp73缺乏小鼠肺和卵巢中ΔNp73水平的Western blot分析。C-17抗体来自α-C末端亚型，IMG-313抗体来自ΔNp73亚型。（Ab）抗体。(E类)胸腺细胞死亡。来自TAp73的胸腺细胞+/+，TAp73−/−和p53−/−用指定浓度的指定药物处理小鼠24小时，并通过annexinV染色和流式细胞术检测细胞死亡率。数据表示两个实验的平均值±SD。

因为ΔNp73是p53和TAp73亚型的功能抑制剂(Grob等人，2001年;Deyoung和Ellisen 2007)当我们观察到ΔNp73 mRNA水平增加时，我们想确定没有诱导ΔNp 73活性，这可能会干扰p53功能。我们发现野生型和TAp73中的p53激活是可比较的−/−MEF（补充图S2C，D）。此外，我们检测到野生型和TAp73之间没有差异−/−胸腺细胞(图1E)γ射线照射、足叶乙甙、顺铂或阿霉素诱导的p53依赖性细胞死亡中的主要MEF（补充图S2E）或E1A-转化MEF（增补图S2F）。TAp73的正常死亡敏感性−/−胸腺细胞特别有趣，因为发现与TAp73启动子结合的E2F是TCR诱导野生型小鼠外周T细胞死亡和癌细胞死亡所必需的(Irwin等人，2000年;Lissy等人，2000年;Stiewe和Pützer 2000). 我们的数据表明，在TAp73缺乏小鼠的大多数组织中观察到的ΔNp73 mRNA的增加与△Np73蛋白水平正常无关。在TAp73缺陷小鼠中可能已诱导了一种补偿机制，以确保正常或生理条件下ΔNp73蛋白的正常表达。

TAp73缺失导致胚胎早期发育缺陷导致不育

TAp73的显著百分比−/−小鼠在胚胎发生期间死亡，导致混合或纯背景小鼠出生时孟德尔比率异常（+/+，29%；+/-，52%；−/-，19%）（补充图S3A）。理论上，这种部分胚胎致死可能是由于潜在增强的ΔNp73蛋白在胚胎发育的特定阶段未被TAp73平衡所致。事实上，在ΔNp73转基因小鼠中，由于p53活性的抑制，强烈放松对ΔNp 73表达的调控，导致100%的胚胎致死率(Erster等人，2006年;Huttinger-Kirchhof等人，2006年).

我们无法从涉及TAp73交配的交配试验中获得幼崽−/−雄性或雌性野生型小鼠，表明两性都是不育的（补充图S3B）。与…对比Trp73型−/−小鼠，其感觉和激素途径的缺陷导致生殖和行为表型导致雄性和雌性不育，TAp73−/−小鼠正常交配，雌性表现出正常的周期性（补充图S3B；数据未显示）。调查TAp73的性质−/−女性不育，我们诱导了3至4周龄TAp73的超排卵−/−使用外源性促性腺激素的雌鼠及其野生型同卵姐妹。与野生型雌性相比，TAp73的输卵管中没有卵母细胞−/−雌性大鼠服用hCG（人绒毛膜促性腺激素）后16小时。当TAp73的卵巢和输卵管−/−对雌性进行解剖后，我们发现排卵卵母细胞被困在囊下，没有向输卵管推进(图2A，右侧）。收集这些卵母细胞后，很明显TAp73−/−雌性也排卵较少的配子(图2B).

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TAp73生殖缺陷的特征−/−雌性小鼠。(A类)正常TAp73−/−卵巢结构。(左侧和中心面板）4周龄TAp73卵巢切片+/+和TAp73−/−苦味酸和甲基蓝染色的小鼠。放大倍率，5×10。(赖特面板）虽然未检测到卵巢大体形态的明显差异，但排卵卵母细胞被困在TAp73的囊下−/−卵巢。放大倍数，40×10。(B类)TAp73缺乏的雌性排卵较少。不成熟TAp73+/+，TAp73+/−和TAp73−/−对雌性小鼠进行超数排卵，计算每只小鼠的卵母细胞数。结果显示，所示数量的平均排卵卵母细胞数±SE(n个)小鼠/基因型。(**)P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(C类)卵巢储备因TAp73缺乏而减少。超排卵未成熟TAp73卵巢的连续切片+/+和TAp73−/−对小鼠进行组织形态计量学分析。结果显示，每组5只小鼠的平均非滋养卵泡数/小鼠±SE。(*)P（P）< 0.01; (**)P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。原始（Prd）卵泡和初级（Prm）卵泡的数量均显著减少，但具有两到三层颗粒细胞（Sec-2/3）的次级卵泡数量所证明的生长速度没有改变。(D类)排卵卵母细胞数量减少是由排卵障碍而非卵泡发育不足引起的。在3周龄TAp73中测定了排卵前（46h/PMSG）带有卵母细胞的格拉夫卵泡数和排卵后（14h/HCG）带有卵子的黄体化卵泡数+/+和TAp73−/−雌性小鼠。结果显示Graffian卵泡/小鼠的平均数±SEn个=每组5只小鼠。(**)P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。

确定卵泡发育改变是否是TAp73中卵母细胞缺陷的原因−/−雌性小鼠，我们对从青春期TAp73获得的卵巢进行了形态计量分析（基于非滋养卵泡的计数）+/+和TAp73−/−女性。虽然在静止（原始）卵泡或早期生长（初级）卵泡的数量上观察到显著差异，但早期次级卵泡的数目是可比较的(图2C). 为了检查后期依赖于促性腺激素的“涂鸦卵泡”阶段，我们对青春期前的TAp73进行了治疗+/+和TAp73−/−雌性用单剂量怀孕母马血清促性腺激素（PMSG）同步卵泡发育。46小时后收集的卵巢显示TAp73的活性没有显著差异−/−性腺形成大腔排卵卵泡(图2D，左）。然而，当我们评估这些卵泡的排卵能力时，我们发现更多的卵母细胞仍滞留在TAp73的黄体化颗粒细胞中−/−卵巢与野生型女性的比较(图2D，右侧）。为了证实ΔNp73与该表型无关，我们测定了来自TAp73的MII卵母细胞中ΔNp 73 mRNA的表达水平甚至降低−/−小鼠与野生型MII卵母细胞的比较（补充图S4A）。这些结果表明TAp73中排卵卵母细胞数量减少−/−小鼠可能是由于卵巢内保留了一些生殖细胞。

接下来我们研究了卵母细胞质量是否有助于TAp73−/−雌性不育。3-4周龄TAp73的胚泡卵母细胞和排卵卵母细胞+/+和TAp73−/−体外诱导小鼠成熟。在这两种情况下，两种基因型的卵母细胞在中期II的阻滞率相同(图3A、B，左）。然而，TAp73−/−卵母细胞纺锤体异常显著增加(图3A、B，右），其中包括多极主轴、主轴松弛和伴随不同程度失准的主轴散射(图3C). 接下来，我们比较了排卵TAp73的发育能力+/+和TAp73−/−通过评估卵母细胞进行体外受精（IVF）和体外植入前发育的能力。虽然受精率相同，但只有28%的合子来源于TAp73−/−卵母细胞变成囊胚，而来自TAp73的受精卵中有75%+/+卵母细胞(图3D). 从TAp73获得的大多数胚胎−/−卵母细胞在早期卵裂过程中受阻，导致胚胎具有多核卵裂球，胚泡质量较差，细胞数量异常(图3E、F). 因此，Trp73型是一种母体致死基因，因为发育中的卵母细胞中缺乏TAp73会导致植入前胚胎发育失败。

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TAp73缺乏对卵母细胞质量的影响。(A类,B类)TAp73纺锤异常的定量+/+和TAp73−/−体外成熟卵母细胞(A类)或体内(B类). 虽然在进行减数分裂和中期II（MII）阻滞的能力上没有观察到差异，但在TAp73卵母细胞中检测到更多的纺锤体异常。(**)P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(C类)具有代表性的示例B类.放大倍数，40×10。(D类)IVF程序显示，TAp73缺陷导致的受精率没有差异，但受精卵通过着床前发育的进展是异常的。TAp73的百分比−/−受精后在适当的发育日达到四至八细胞、桑椹胚和囊胚阶段的卵母细胞数量大大减少。(*)P（P）< 0.01; (***)P（P）< 0.0001. 使用X（X）2测试。(E类)从TAp73获得的IVF衍生囊胚质量较差−/−用总细胞数评价卵母细胞(左边)和内细胞质量（ICM）评分(正确的). (**)P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(F类)胚泡DAPI染色(顶部，放大倍率，20×10）和八世纪停滞胚胎(底部，放大倍数，40×10）B类（白色箭头）有丝分裂细胞；（白色箭头）正常核；（红色箭头）多核细胞；（红色箭头）精子头。(G公司)出生后第4天TAp73的表达+/+用H79抗体免疫组化染色检测卵巢。(H（H）)TAp73上调基因的网络可视化+/+和TAp73−/−新生儿卵巢。节点颜色表示GO（基因本体）功能，如图例所示。节点形状代表不同的目标：指向上的三角形是TAp73中上调的目标−/−卵巢；指向下方的三角形是TAp73中上调的靶点+/+卵巢。用红色圈出的菱形和三角形代表网络中的关键蛋白质。较粗的线条表示靶点之间的直接相互作用。红线代表网络中的关键相互作用。所有其他线代表次级相互作用蛋白质。

卵母细胞质量差导致胚胎发育异常也与母亲衰老有关，是人类不育最重要的预后因素之一。因为年轻TAp73的卵母细胞−/−小鼠表现出与老龄野生型小鼠卵母细胞相似的纺锤体异常谱(Tarin等人，2001年)，我们评估了8岁和55岁野生型小鼠卵巢中TAp73的表达。我们发现自然老化会消除卵母细胞中TAp73的表达（补充图S4B，C）。这一观察结果表明，TAp73的缺失可能是老化正常卵母细胞发育能力受损的原因。

为了确定可能参与发育能力调节的TAp73转录靶点，我们决定对卵巢组织进行基因微阵列分析。我们首先使用免疫细胞化学来确定卵子发生的哪个阶段最可能受到TAp73缺乏的影响。从原始卵泡期开始生长的野生型卵母细胞仅表现出TAp73的细胞质表达，但野生型原始卵泡的卵母细胞通常表现出核染色(图3G; 补充图S4B）。因此，我们使用在发育阶段富含卵母细胞的新生儿卵巢作为微阵列分析的目标组织。我们的结果表明，由于TAp73的缺失，新生儿卵巢中79个注释基因的表达至少改变了1.8倍。我们证实了一些基因对TAp73表达的调节−/−卵巢与野生型卵巢的比较（补充图S5A，B；数据未显示）。在这79个基因中，许多基因通过控制RNA加工参与转录和翻译的调节（参见表1,​,2).2). 我们确认，大多数这些基因是潜在的或已知的p53靶点（补充图S5C）。为了确定差异调节靶点之间的功能联系，我们将其映射到I2D蛋白质相互作用数据库(布朗与法理学2007). 广泛的分析确定了几个与TAp73强烈相互作用的蛋白质，还表明所有这些蛋白质都处于网络断开点，这表明它们对该网络内的信号传递至关重要(图3H). 事实上，其中一些基因（例如：聚乙二醇10和密码9)在动物模型中被破坏，导致胚胎死亡或不育(小野等人，2006年;Akanuma等人，2007年). 综上所述，这些数据表明，这些靶基因通常可能由TAp73调节，或者是TAp73的物理相互作用体，例如，在PIAS1的情况下，PIAS1通过对TAp73进行sumoylation调节细胞周期检查点进展(Munarriz等人，2004年)因此，在缺乏TAp73的情况下，它们的失调可能会导致植入前死亡。

表1。

.%TAp73中靶基因上调−/−卵巢与野生型卵巢的比较

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表2。

TAp73中靶基因下调−/−卵巢与野生型卵巢的比较

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TAp73对海马发育是必需的，但对神经细胞的维持不是必需的

之前的分析Trp73型−/−小鼠已经证明p73对神经系统的发育和维持至关重要(Yang等人，2000年). 的确，Trp73型−/−小鼠表现出海马发育不全，出生后神经元逐渐但持续丢失，脑室（脑积水）大大扩大，皮层组织大大减少(Yang等人，2000年;Pozniak等人，2002年). 为了研究这两种表型是否是由于TAp73亚型的丢失所致，我们对10周龄野生型和TAp73的大脑进行了冠状切片−/−老鼠。前脑Nissl染色显示TAp73−/−在侧脑室的大小和皮层的厚度方面，大脑与野生型大脑相似(图4A、B)但海马解剖结构异常。尤其是齿状回的下叶完全缺失或严重截断，这取决于该部分的水平(图4C-F). 这种海马发育不全与Trp73型−/−小鼠出生后第14天，即心室扩大和神经组织丢失进一步扰乱成年海马形态之前Trp73型−/−老鼠。TAp73之间的相似性−/−小鼠和p73−/−这种特殊表型的小鼠表明，这是由于TAp73丢失，而不是ΔNp73丢失。因此，我们的数据支持以前的工作(Pozniak等人，2000年,2002;Walsh等人，2004年)表明TAp73对海马正常发育至关重要，而ΔNp73似乎可以防止成年期神经组织丢失和心室扩大。

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TAp73对海马正常发育至关重要。来自使用七个TAp73的多个实验的代表性图片+/+和七个TAp73−/−4个月龄TAp73小鼠冠状前脑切片+/+(A类,C类,E类)和TAp73−/−(B类,D类,F类)用甲酚紫染色的C57B6背景小鼠。(A类,B类)前连合水平的前脑冠状切片被尼氏染色。箭头表示侧脑室。TAp73的皮层厚度（括号）相似+/+和TAp73−/−大脑。(C–F类)前脑头侧海马水平的Nissl染色冠状切片。中方框表示的面积C类和D类以更高的放大倍数显示E类和F类分别是。箭头在D类和F类表示齿状回下叶的位置，该位置在TAp73中缺失−/−大脑。

TAp73−/−小鼠易患肿瘤，对致癌物敏感

而在TAp73中检测到不育和神经异常−/−小鼠并不完全相同，但令人想起Trp73的描述−/−老鼠(Yang等人，2000年)其他方面的表型差异显著。的确，尽管TAp73的寿命−/−小鼠明显短于野生型小鼠(图5A)，仍超过Trp73型−/−老鼠(Yang等人，2000年). 此外，尽管未经治疗Trp73型−/−小鼠不发生肿瘤，TAp73的30%+/−和TAp73的73%−/−混合遗传背景的小鼠自发发生恶性肿瘤(图5B、C). 肺腺癌是TAp73中最常见的癌症−/−小鼠，在所有TAp73的32%中观察到−/−分析了TAp73切除的所有肿瘤中44%的小鼠−/−老鼠。在TAp73的肺部−/−基因敲除后，与野生型相比，ΔNp73 mRNA或蛋白均无变化（见上文）。重要的是，在所分析的任何肿瘤中，均未发现肿瘤发病与p53、p63或ΔNp73蛋白表达之间的相关性（数据未显示），这表明TAp73中肿瘤的出现+/−和TAp73−/−小鼠是由于TAp73缺失而非ΔNp73、p63或p53失调所致。与之前的报告一致(Roman Gomez等人，2006年)TAp73中66%的肿瘤发生了p73的异位性丢失（LOH）+/−老鼠(图5D).

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TAp73−/−小鼠易患肿瘤，对致癌物敏感。(A类)TAp73的Kaplan-Meyer生存曲线+/+(n个=18），TAp73+/−(n个=20）和TAp73−/−(n个=22）只小鼠。P（P）<0.001（对数秩检验）。(B类)TAp73中的自发性肿瘤谱+/+，TAp73+/−和TAp73−/−老鼠。TAp73中的自发性肿瘤发展−/−老鼠是有意义的P（P）-的值P（P）< 0.005 (X（X）2测试）。(C类，箭头）TAp73组织中的H&E染色肿瘤−/−老鼠。（1） 原位结肠癌，10倍放大。（2） 卵巢侵袭性淋巴瘤，10倍放大。（3a–3c）肺腺癌，10倍放大，3b是3c的高倍放大，20倍放大。（4a–4b）子宫浸润性淋巴瘤，10倍放大，4b是4a、40倍放大的高倍放大。虚线表示健康组织和肿瘤组织之间的边界。(D类)六种TAp73的代表性LOH分析+/−荷瘤小鼠（T1-6）；（T） 肿瘤；（N） 正常组织。(E类)DMBA处理的TAp73的Kaplan-Meyer生存曲线+/+(n个=23）和TAp73−/−(n个=23）小鼠在治疗后的几周内。P（P）<0.005（对数秩检验）。

确认TAp73的肿瘤易感表型−/−小鼠，我们通过向TAp73腹腔注射DMBA诱导致癌+/+和TAp73−/−女室友。TAp73肿瘤发生的平均潜伏期−/−小鼠为18.7±7.1 wk，显著短于DMBA处理的TAp73中观察到的32±3.4 wk平均潜伏期+/+老鼠(图5E). 然而，DMBA处理的TAp73之间没有差异+/+和TAp73−/−位于肿瘤发生部位的小鼠，包括结肠、肠道、肝脏和胃（数据未显示）。这些结果表明TAp73亚型介导肿瘤抑制功能Trp73型TAp73的缺失足以促进肿瘤转化。

考虑到TAp73−/−小鼠主要发展为肺腺癌，我们决定研究p73亚型在人类肺癌中的表达。对来自18名肺癌患者的匹配正常和肿瘤肺组织样本中TAp73和ΔNp73的表达进行检查后发现，大多数肿瘤肺样本都表现出TAp73下调和ΔNp73上调，TAp73/ΔNp 73比值随之降低（补充图S6）。值得注意的是，在TAp73表达上调的两个样本（患者133和177）中，也表达了更多的ΔNp73。这些结果与假设的人类肺癌中p53失活相一致(Haruki等人，2001年).

TAp73参与维持基因组稳定性

自从我们观察到TAp73的卵母细胞中自发肿瘤的发生率增加以及纺锤体异常形成以来−/−接下来，我们研究了TAp73缺陷对维持基因组稳定性的可能影响。在减数分裂和有丝分裂期间准确的染色体分离对真核细胞保持整倍性至关重要(Yuen等人，2005年)调控分离的分子机制的错误会导致非整倍体(Hassell和Hunt 2001;Thomas等人，2001年). 我们分析了TAp73缺陷细胞进行有丝分裂阻滞的能力，并观察到TAp73−/−MEF显示诺可唑诱导的有丝分裂阻滞显著减少。事实上，在诺可唑作用25小时后，TAp73中G1和>G2/M的细胞百分比增加−/−与TAp73相比的MEFs+/+MEF公司(图6A; 补充图S7A）。细胞周期蛋白B1和安全蛋白等有丝分裂相标志蛋白的免疫印迹显示，TAp73发生了有丝分裂“滑移”−/−MEF（数据未显示）。TAp73中有丝分裂提前退出−/−MEFs通过免疫染色确认，以检测磷酸孕酮H3阳性细胞(图6B)通过计算有丝分裂图(图6C，右侧）。因此，在诺卡唑存在的情况下，TAp73缺陷导致细胞有丝分裂进程异常，否则不允许进入G1期。我们在p73中观察到类似的有丝分裂提前退出−/−用诺卡唑处理的MEF细胞，强烈表明TAp73亚型是有丝分裂调节中的功能亚型，而不是ΔNp73亚型别（补充图S7B，C）。

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在没有TAp73的情况下，基因组稳定性的维持有缺陷。(A类)TAp73流式细胞术细胞周期分析+/+(顶部)和TAp73−/−(底部)用诺卡唑治疗MEF达指定小时数。该图是使用FlowJo 7.2.2软件创建的。(B类)磷酸化组蛋白H3的百分比+TAp73培养物中的细胞+/+（TAp73野生型）和TAp73−/−用诺卡唑治疗MEF指定时间。(*)P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。(C类)多核百分比(左边)和有丝分裂(正确的)TAp73中的细胞+/+和TAp73−/−如图所示，用紫杉醇或诺卡唑处理的MEF。(底部)DAPI染色的多核TAp73−/−MEF；放大40倍。所示数据代表三个不同实验的平均值±SE。(**)P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(D类)H1299培养物中过度表达空载体（EV）或含有所示TAp73亚型的载体并用紫杉醇处理24小时的多核细胞百分比（**）P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(E类,F类)G2/M期或>G2/M相的细胞百分比（非整倍体细胞）。从肺部提取细胞(E类)或胸腺(F类)野生型TAp73−/−、和Trp53基因−/−小鼠，并用诺可达唑治疗12小时。结果显示为三个独立试验的细胞平均百分比±SE。(**)P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。(G公司)非整倍体增加。(顶部)TAp73中的细胞百分比+/+和TAp73−/−3T3培养物显示二倍体（2N）、近二倍体、四倍体（4N）、近四倍体（±4N）和非整倍体（>4N）DNA含量。(底部)a±4N TAp73的代表性核型−/−3T3电池。

诺康唑治疗25小时后，TAp73中经常出现8N个多倍体细胞群−/−与TAp73比较时的MEF+/+MEF公司(图6A). 事实上，约14%的TAp73−/−MEF显示非整倍体，而TAp73中的细胞为5%+/+MEF文化。TAp73中多核细胞的百分比也增加−/−用紫杉醇或诺可唑治疗的MEF(图6C，左）。当H1299细胞被改造成过表达TAp73β亚型时，它们受到保护，免受紫杉醇诱导的多核细胞的形成(图6D). 相反，ΔNp73α或ΔNp 73β在Trp73型−/−MEF并没有减少多核细胞的增强形成（数据未显示）。

接下来，我们检测了TAp73中的肺和胸腺细胞群−/−,Trp53基因−/−和野生型小鼠，分别接受或不接受诺卡唑治疗12小时TAp73−/−肺成纤维细胞显示>G2/M细胞的频率较高，显示出整倍性的丧失，这可能是非整倍体Trp53基因−/−或野生型肺成纤维细胞，而TAp73之间没有观察到差异−/−,Trp53基因−/−和野生型胸腺细胞(图6E、F). 因此，TAp73对非整倍体的影响似乎是组织特异性的，也许可以解释为什么TAp73−/−小鼠优先发生肺腺癌。我们的结果表明，至少在肺组织中，TAp73的缺失与基因组稳定性降低有关。

为了更直接地证实TAp73缺陷与DNA含量改变有关，我们对TAp73进行了核型分析−/−和TAp73+/+3T3细胞，并观察到与野生型对照组相比，突变培养物中含有异常核型细胞的百分比明显较高(图6G). 受影响的细胞表现出单个染色体的丢失或增加，表明非整倍体。这些数据进一步支持TAp73在维持基因组稳定性中的作用。

讨论

如上所述，具有所有p73亚型缺失特征的小鼠模型(Yang等人，2000年)，或p73缺失与Trp53基因不足(Flores等人，2005年;Perez-Losada等人，2005年)或特异性p73亚型的过度表达(Huttinger-Kirchhof等人，2006年)，都有助于剖析Trp73型在各种生物过程中。然而，这些小鼠模型无法区分TAp73和ΔNp73亚型的作用，因此这些亚型在特定生物过程中的相对重要性尚不清楚，甚至相互矛盾。在我们的研究中，我们产生并分析了TAp73亚型选择性缺失的影响。我们对Trp73型−/−和TAp73−/−小鼠已明确识别出需要TAp73而不是ΔNp73的几个功能。然而，单亚型缺失模型、所有亚型的完全缺失，甚至部分缺失和亚形态模型都需要完全理解p53家族成员介导的复杂功能网络。

两者都有Trp73型−/−和TAp73−/−小鼠是不孕的，但这种不孕的根本原因不同。Trp73型−/−老鼠有感觉缺陷，无法正常交配(Yang等人，2000年). 相反，TAp73−/−雌性小鼠正常交配，但卵母细胞发育能力降低，导致早期胚胎发育受损。TAp73中主轴缺陷的增加频率−/−排卵卵母细胞也可能导致TAp73的不育−/−女性，符合该参数与人类不育的强相关性(Baird等人，2005年). 重要的是，我们的工作已经确定Trp73型作为少数突变产生母体致死效应表型的基因之一。从母体到胚胎控制胚胎发生的过渡需要属于这一组的基因。因此，在源于TAp73的胚胎中观察到的细胞缺陷谱−/−卵母细胞与接受IVF的不育患者，特别是老年患者中观察到的胚胎缺陷范围非常相似(Hardarson等人，2001年;Hardy等人，2001年). 这些数据也与老年患者卵母细胞中p73转录物的下调相一致(Steuerwald等人，2007年). p53家族成员在控制衰老中起关键作用，如p63所示(Keyes等人，2005年;Suh等人，2006年)，p53突变(Tyner等人，2002年)，或缺乏小鼠(Ohkusu-Tsukada等人，1999年). 关于我们的结果，值得关注的是，由于衰老或功能丧失突变导致的TAp73下调可能是人类女性不育病例的潜在预后因素。

除了不育，TAp73−/−小鼠表现出轻微的脑形态学缺陷。在TAp73中观察到海马发育不全−/−小鼠，但没有出现神经组织丢失或心室扩大的迹象Trp73型−/−老鼠。根据我们的研究和Trp73型-我们认为，缺乏ΔNp73亚型而非TAp73是导致大脑神经组织丢失和心室扩大的原因，而海马发育不全伴齿状回丢失或严重截断则与TAp73缺乏特别相关。为了彻底解决这个问题，需要产生并鉴定一只选择性缺失ΔNp73的小鼠。

我们的研究首次明确证明TAp73亚型具有Trp73型，从而解决以前的冲突结果(McKeon和Melino 2007). 以前有人提出p73功能丧失可能导致肿瘤发生(Flores等人，2002年,2005)在某些肿瘤中，TAp73下调可能与ΔNp73上调相结合(Zaika等人，2002年). 我们发现，TAp73选择性缺乏的小鼠会发生自发性肿瘤，尤其是肺腺癌，并且对化学致癌物更敏感。TAp73自发性肿瘤的发展−/−小鼠，但不在Trp73型−/−小鼠阐明了Trp53基因家庭成员和癌症。

有趣的是，TAp73中检测到的肿瘤类型−/−小鼠，以及在Trp63蛋白+/−和Trp73型+/−小鼠的恶性程度与Trp53基因−/−小鼠（甚至考虑到菌株差异）(Flores等人，2002年,2005). 此外，尽管p63和p73在体内对p53介导的小鼠淋巴瘤的抑制没有贡献(Perez-Losada等人，2005年)、等位基因丢失和遗传不稳定性Trp73型与非霍奇金淋巴瘤有关(Martinez-Delgado等人，2002年). 这些潜在的相互矛盾的数据以及这些不同模型中肿瘤光谱的多样性可能是由于多种p53、p63和p73亚型的复杂表达模式。人类肿瘤细胞可以表达p73的特殊剪接异构体，如Δ2p73和Δ2,3p73(Pützer等人，2003年;Concin等人，2004年)，包括选择性删除Trp73型外显子2和3。这些癌细胞表现出TAp73亚型的消除和ΔNp73变体的上调，与我们的TAp73相似−/−小鼠，并发展出惊人相似的表型。因此，我们的小鼠模型强调了TAp73和ΔNp73亚型的复杂相互调节，并密切反映了许多人类癌症中p73表达的异常模式。

越来越多的证据表明p53及其家族成员可以预防基因组不稳定、非整倍体和癌症，尽管其分子联系的细节尚不清楚(Duensing和Duensing 2005). p53家族成员失活可能导致染色体不稳定表型，这是特定有丝分裂蛋白失调的癌症的标志(Carter等人，2006年; 有关查看信息，请参阅Tomasini等人，2008年). 最近的一份报告显示Trp73型和Trp53基因导致严重的基因组不稳定和多倍体和非整倍体的快速增加，这明显超过了Trp53基因独自一人(Talos等人，2007年). 此外，Trp73型似乎是异常有丝分裂细胞死亡的必要条件(Niikura等人，2007年). 这些结果与我们TAp73中描述的异常生存率一致−/−DNA含量升高（超过4N）的细胞。这些遗传不稳定细胞的持续存在可能为肿瘤的发生奠定基础。

我们的数据表明，TAp73亚型是真正的肿瘤抑制因子，有助于越来越多的证据表明基因组不稳定性和非整倍体与肿瘤发生有关(Pérez de Castro等人，2007年;2007年韦弗和克利夫兰). 具体而言，我们的发现指出TAp73亚型在维持基因组稳定性方面发挥着关键的新作用，从而防止肿瘤形成和不育。事实上，就像p53一样(Hu等人，2007年)和p63(Suh等人，2006年)，整个p53家族似乎扮演着“女性生殖系的守护者”的角色

材料和方法

TAp73的生成−/−小鼠和LOH分析

突变小鼠缺乏Trp73型TAp73亚型的特异性外显子2和3是通过Sv129Ola胚胎干细胞的常规基因靶向程序产生的。将囊胚转移至假孕C57BL/6J雌性小鼠。TAp73野生型（野生型，+/+；TAp73+/+)，杂合子（+/-；TAp73+/−)和纯合子（−/−；TAp73−/−)通过交叉TAp73制造同窝小鼠（Sv129Ola×C57BL/6J）+/−老鼠。通过PCR分析，使用特定引物对后代进行基因分型，以检测野生型Trp73型和Trp73型ΔTA等位基因。野生型正反义引物Trp73型等位基因分别为5′-CTGGCCAGGAGGTGAGACTGAG GC-3′和5′-CTGCCCTCCAGCTTGCCACTTC-3′。基因靶向的正、反义引物Trp73型ΔTA等位基因分别为5′-GTGGGGGGTGATTAGATAAT GCCTG-3′和5′-CTGGCCCTCCAGCTTTGCCACTTC3′。野生型的预测PCR产物大小分别为1.0 kb和1.2 kbTrp73型和Trp73型ΔTA等位基因。除孟德尔比率分析外，所有实验均使用F4混合背景小鼠，我们还使用了C57B6背景中的第五代回交动物。所有动物均按照安大略癌症研究所动物护理委员会（加拿大安大略省多伦多市）批准的NIH实验动物护理和使用指南进行治疗。使用基因分型引物和PCR扩增进行LOH分析Trp73型肿瘤和肿瘤携带TAp73的正常（尾部）组织基因组DNA中的外显子2和3+/−老鼠。

自发和诱发肿瘤分析

测定未经治疗的TAp73的寿命和自发性肿瘤发病率+/+和TAp73−/−老鼠。检测到肿瘤可见的小鼠和体重减轻或行动困难的垂死小鼠后，将其处死。剩下的存活小鼠在26个月龄时被处死。用于诱导肿瘤发生，TAp73+/+和TAp73−/−小鼠（23只/组）从产后63天开始，每周1次，持续6周，腹腔注射1 mg/kg二甲基苯并[a]蒽（DMBA；Sigma-Aldrich）。该剂量足以诱导对照组100%的肿瘤发生率。收集对照和突变小鼠的肿瘤和组织，并按照标准程序进行组织病理学和RNA/DNA分离。

卵母细胞采集、体外成熟和体外受精

对雌性小鼠（3-7周龄）进行超排卵，并按前述方法收集成熟卵母细胞(Perez等人，2005年). 为了进行体外成熟，3周龄雌性的生发泡期卵母细胞被诱导进行自发体外成熟(Yao等人，2004年)，并按照前面所述进行体外受精(Acton等人，2004年). 每天评估胚胎发育能力。第4天，固定胚胎，如前所述测定细胞数量、细胞死亡和有丝分裂率(Jurisicova等人，1998年). 使用χ获得统计数据2或学生的t吨-测试。

微阵列研究

对来自两对兄弟姐妹的TAp73的第4天卵巢组织进行微阵列分析+/+和TAp73−/−由应用基因组学中心（多伦多儿童医院）使用Affymetrix平台（Mouse MOE 430 2.0）和两个周期扩增步骤对雌性进行扩增。使用RMAExpress 1.0 beta 3预处理数据(Bolstad等人，2003年)，日志2转换，然后使用SAM版本3.0进行分析(Tusher等人，2001年). 利用FDR（错误发现率）=0.603%，我们鉴定了2538个差异表达的基因（1178个在TAp73中上调，1360个下调+/+卵巢）。为了进一步减少假阳性，我们通过仅考虑大于1.8的倍数变化对基因进行优先排序，这导致野生型卵巢中16个基因上调，60个基因下调。

为了确定已识别的靶基因之间的功能联系，我们将它们映射到互作数据库I2D版本1.71(http://ophid.utoronto.ca/i2d). 在TAp73上调的7个靶点上形成了一个包含531个蛋白质和977个相互作用的网络+/+TAp73中卵巢和26个靶点上调−/−卵巢。使用NAViGaTOR版本2.0对所得蛋白质相互作用网络进行进一步的可视化和分析(http://ophid.utoronto.ca/navigator网站). 最短路径计算用于确定关键蛋白质和相互作用。简单地说，计算网络中所有节点之间的最短路径，并计算单个蛋白质的包含频率和相互作用。最频繁的节点和线条构成网络中的关键子图。我们应用混合来降低网络复杂性（NAViGaTOR 2.0版）。

免疫组织化学分析

为了对小鼠大脑进行组织学分析，用4%多聚甲醛灌注处死的动物，并按照前面所述对其大脑进行冷冻保护、切片和尼塞尔染色(Pozniak等人，2002年). 对于卵母细胞的组织学分析，如前所述进行卵母细胞固定和免疫细胞化学(Yao等人，2004年). 样品在反褶积荧光显微镜上观察。对取自3周龄雌性的固定卵巢组织进行卵泡组织形态学检查(Canning等人，2003年)如前所述，对卵巢切片进行免疫细胞化学(Matikainen等人，2001年). 用于卵母细胞和/或卵巢切片分析的抗体为大鼠单克隆抗管蛋白（YL1/2；Abcam）、兔多克隆抗p73（H79；圣克鲁斯生物技术）和山羊抗p73α（C17；圣克鲁兹生物技术）。对于纺锤体分析，将第二抗体与俄勒冈绿（Molecular Probes）缀合。对于卵巢切片，使用生物素化抗兔抗体检测试剂盒（DAKO）进行可视化。

细胞系和过度表达实验

胚胎第13.5天（E13.5）TAp73获得的MEF+/+，TAp73−/−和第73页−/−胚胎或3T3细胞在补充有10%FCS而不含抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。对于过表达实验，在转染前一天，将人肺癌细胞株H1299以60%的密度进行电镀。根据制造商的方案，使用FuGENE试剂（罗氏应用科学公司）进行质粒的瞬时转染。控制载体pcDNA3-HA来自Clontech。编码TAp73α和TAp73β亚型的DNA序列均在pcDNA3-HA中克隆。

流式细胞术分析

TAp73−/−MEF种子为3×105每100-mm板的电池。然后让培养物未经处理或用诺卡唑（200 ng/mL；Sigma-Aldrich）处理。立即（对照组）或在诺康唑治疗后16、21、25或48小时，收集细胞并在4°C的PBS/70%乙醇中固定至少1小时。将固定细胞重新悬浮在含有100μg/mL RNase A和50μg/mL碘化丙啶（Sigma-Aldrich）的PBS中，并立即使用FACSCalibur（Becton Dickinson Biosciences）进行分析。使用CellQuest Pro（BD Biosciences）和FlowJo 7.2.2数据分析软件收集和分析数据。根据制造商的方案，使用抗磷甾体H3抗体（#9708；细胞信号）进行磷组蛋白H3染色。新鲜TAp73总细胞群的细胞周期分析+/+，TAp73−/−和p53−/−胸腺或肺组织的检查如前所述(Yamamoto等人，2003年).

如前所述，使用碘化丙啶染色和AnnexinV-FITC通过流式细胞术进行细胞死亡分析。

蛋白质印迹

蛋白质提取物（100μg）通过SDS-PAGE进行分级，并通过标准程序进行蛋白质印迹。使用Odyssey红外成像系统（LI-COR Biosciences）通过带密度测定法定量蛋白质印迹。对于免疫沉淀，根据标准方案分析MEF中的蛋白质提取物。用于Western blot的抗体为小鼠抗ΔNp73（IMG-313；Imgenex）、山羊抗p73（C-20；Santa Cruz）、兔抗磷酸p53 ser15（#9284L；Cell Signaling）和兔抗p53总抗体（CM5；Vector Laboratories）。

致谢

我们感谢H.Okada和R.A.Knight提供的技术建议和有益的讨论，P.Berthezene提供的统计分析，S.K.Lau提供的人类实时PCR分析技术帮助，M.E.Saunders提供的科学编辑。这项工作得到了AIRC、EU（Active-p53，Epistem）、FIRB、MIUR和MinSan向G.M.R.T.提供的资助，并得到了l'Association pour la recherche contre le cancer的支持。R.T、K.T.和A.J.得到了加拿大卫生研究院的支持。R.T.、K.T.、M.W.、M.F.、A.R.、C.C.C.、F.K.、A.I.-Y.、A.W.、P.B.和A.J.对论文进行了研究。R.T.、G.M.、A.J.和T.W.M.撰写了这篇论文。我们都讨论了结果并阅读了论文。

脚注

补充材料可在网址：http://www.genesdev.org.

文章提前在网上发表。文章和发表日期在线http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.101/1695308.

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社