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RNA。2008年10月；14(10): 2115–2124.
数字对象标识：2012年10月26日/月11日
预防性维修识别码：PMC2553732型
PMID：18755840

Mir-302将人类皮肤癌细胞重新编程为多能干ES细胞样状态

林世龙（Shi-Lung Lin）,1 唐纳德·C·张,1 萨曼莎·昌林,1 林春红,2 大卫·T·S·吴,三 大卫·T·陈,三和邵耀英1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在自我控制的细胞分裂中，干细胞的更新不同于癌细胞的生长。mir-302 microRNA（miRNA）家族（mir-302s）在生长缓慢的人类胚胎干细胞中表达最丰富，在细胞分化和增殖后迅速减少。因此，在本研究中，mir-302s被认为是维持ES细胞更新和多能性的关键因素之一。基于Pol-II的内含子miRNA表达系统被用于将mir-302s转基因到几个人类癌症细胞系中。mir-302转染的细胞，即miRNA-induced multipropotent stem（mirPS）细胞，不仅表达了许多关键的ES细胞标记，如2004年10月3日,上海证券交易所-3,上海证券交易所-4,Sox2系统、和纳克但也有一个高度去甲基化的基因组，类似于重新编程的合子基因组。微阵列分析进一步表明，mirPS与人类ES H1和H9细胞之间的全基因组基因表达模式具有86%以上的相似性。通过体外分子引导，这些mirPS细胞可以分化为不同的组织细胞类型，如神经元、软骨细胞、成纤维细胞和精原细胞样原始细胞。基于这些发现，我们得出结论，mir-302s不仅可以将癌细胞重新编程为类ES-多能状态，还可以在无饲料培养条件下保持这种状态，这可能为治疗干预提供了一个很好的机会。

关键词：miRNA，mir-302，胚胎干细胞，诱导多能干细胞，干细胞生成，更新，多能干，类胚体，无饲养细胞培养，表观遗传重编程，细胞分化

简介

肿瘤干细胞的概念表明，肿瘤中转化的干细胞能够自我更新并分化为异质性肿瘤人群(Reya等人，2001年). 然而，这种干细胞-癌细胞转化或反之亦然，并没有明确的机制。在临床上，经常观察到癌症进展通常与人类肿瘤细胞分化不良（高分化）有关。最近的研究还表明，低分化肿瘤优先过度表达通常富集于人类胚胎干细胞（ES）的基因，例如Oct3/4、Sox2和Nanog转录因子的靶点。然而，这些转录因子本身的同时表达在低分化肿瘤中并不常见(Ben-Porath等人，2008年). 可以想象，替代Oct3/4、Sox2和Nanog的另一组转录调控因子可能在低分化肿瘤细胞中发挥作用，以促进其“干细胞”特征。因此，寻找干细胞替代这些与癌症相关的转录调控因子的方法可能会导致癌症治疗和干细胞生成方面的突破。为此，我们在此报告，目前对mir-302功能的研究首次揭示了人类癌细胞反向转化为ES-like多能干细胞的机制。

mir-302家族（mir-302s）由四个高度同源的microRNA（miRNA）成员组成，它们被转录为一个非编码RNA簇，在5′-3′方向上包含mir-302b、mir-302c、mir-202a、mir-32d和mir-367(Suh等人，2004年). 它们在生长缓慢的人类ES细胞中表达最丰富，在细胞分化和增殖后迅速减少(Suh等人，2004年). 鉴于miRNAs的特点是具有小的抑制性RNAs，能够以高度互补性抑制目标基因的翻译(巴特尔2004)mir-302s可能是早期胚胎发育中早期细胞分化的候选合子抑制剂。如miRBaseŞSequences程序所示(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences网站/)，mir-302s可以靶向445多个人类基因，其中大多数靶向是发育信号，涉及在早期人类胚胎发生过程中启动和/或促进谱系特异性细胞分化。这些靶基因列在Sanger网站上与miRBase｜Sequences程序相关的靶预测位点中，包括TARGETSCAN(http://www.targetscan.org/vert_42/)和PICTAR-VERT(http://pictar.bio.nyu.edu/cgi-bin/pictar_脊椎动物.cgi？). 因此，我们假设mir-302s是ES细胞维持所必需的关键因素，可能能够将癌细胞重新编程为更像ES细胞的状态。

为了测试mir-302s的功能，我们开发了一个基于Pol-II的逆转录病毒内含子miRNA表达系统，即：，pLNCX2-rT-SpRNAi基因(图1)，并成功地将其用于产生多个转基因miRNA-表达细胞系和动物(林和英2006;Lin等人，2006年). 同样的转基因方法也被用于生产基因敲除小鼠以用于人类疾病研究(Xia等人，2006年). 内含子miRNA表达在哺乳动物中普遍存在，因为约50%的哺乳动物miRNA编码在蛋白编码基因的内含子中(罗德里格斯等人，2004年). 这些miRNAs由II型RNA聚合酶（Pol-II）转录，并被剪接体和其他RNase III内切酶切除以形成成熟的miRNAs(Danin-Kreiselman等人，2003年;Lin等人，2003年). 然而，德罗莎此过程可能不需要(Ruby等人，2007年). 这种mir-302表达的成分pLNCX2-rT-SpRNAi基因矢量如所示图2A利用这种基于载体的转染策略，我们分别从人类Colo黑色素瘤和前列腺癌PC3细胞中产生了两种表达mir-302的mirPS细胞系，即mirPS-Colo和mirPS-PC3，并证实mirPS-Colo细胞在干细胞更新和多能性方面与人类ES H1和H9细胞高度相似。

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基于逆转录病毒的mir-302s转基因表达mirPS细胞系的生成策略pLNCX2-rT-SpRNAi基因载体转染。使用逆转录病毒传递方法整合巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的SpRNAi-RGFP公司将基因转入受试细胞基因组，以稳定表达手动重新设计的mir-302前miRNA簇（mir-302s）。Mir-302s被放置在SpRNAi-RGFP公司并作为转基因转录RNA（pre-mRNA）的一部分生成，包含RGFP蛋白编码外显子和非编码内含子。内含子从pre-mRNA中剪接出来，进一步切割成小的miRNA-like mir-302分子，能够触发靶基因沉默，而RGFP公司将外显子连接在一起以形成用于合成红色荧光标记蛋白RGFP的成熟mRNA。RGFP的存在可作为mir-302s表达和处理的指标。

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利用逆转录病毒介导的mir-302s转染将人类癌Colo和PC3细胞重新编程为ES-like mirPS细胞。(A类)mir-302s-expressing的结构SpRNAi RGFP基因位于巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的XhoI/AflII克隆位点的转基因pLNCX2型逆转录病毒载体（Clontech），即，pLNCX2-rT-SpRNAi基因. (B类)构建mir-302前miRNA簇（mir-302s），插入SpRNAi-RGFP公司转基因。(C)利用FACS流式细胞术结合RGFP和Oct3/4分选筛选mirPS细胞。(D类)mirPS细胞形态和细胞分裂率的变化。第一个(左边)和第二个(正确的)DNA密度流式细胞术图的峰值分别代表整个受试细胞群中静止G0/G1和有丝分裂M期细胞群的水平。mir-gfp-miRNA与人类基因没有同源性。(E类)与原来的PC3细胞相比，mirPS-PC3细胞失去迁移能力。(F类)mirPS细胞衍生EB的形成及其分化为具有Tuj1和ABCA2标记物表达的神经元样原始细胞。

结果

人ES-like mir-302诱导的多能干细胞系和类胚体的产生

在pLNCX2-rT-SpRNAi基因预先设计的mir-302前miRNA簇转基因逆转录病毒转染(图2B)，～95%–98%的转染细胞发生凋亡，其余2%–5%的细胞转化为ES-like mirPS细胞。用mir-302标记物RGFP和ES标记物Oct3/4抗体进行FACS流式细胞术筛选，mir-302s转染Colo和PC3细胞的转染率分别为99.8%和99.4%(图2C). 这些mirPS细胞可以在DMEM/F12或RPMI 1640/B27培养基中生长，该培养基中添加了10%炭化FBS、4 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、5 ng/mL激活素、5 ng/mL noggin、3 ng/mL bFGF以及0.5μM Y-27632和0.5μM GSK-3抑制剂XV的等量混合物，温度为37°C，CO浓度为5%2在这种无饲料培养条件下，mirPS细胞的平均细胞周期为～20–24小时，表明与癌细胞相比，细胞更新速度非常慢（每个细胞周期～4–6小时）。

流式细胞术分析将DNA含量与细胞周期相比较，显示mirPS有丝分裂细胞群减少了67%以上(图2D). mirPS-Colo细胞的有丝分裂细胞数量（M期）从36.5%下降到11.5%，mirPS-PC3细胞从38.4%下降到12.6%，而转染空白细胞的对照细胞没有变化pLNCX2-rT-SpRNAi基因载体（cell+vector）或编码非靶点mir-gfp前miRNA构建物（cell+mir-gfp）的载体。然而，编码突变mir-302s的载体的转染消除了mir-302对细胞周期抑制和2004年10月3日基因激活（补充图1）。突变的mir-302s是通过用所有四种亚型中的AUUAAUUA替换mir-302种子序列（UAAGUGCU）的前八个核苷酸而形成的。因此，mirPS细胞形态（下面板）从纺锤形或星号形变为更圆的形状，表明mirPS电池可能已失去迁移能力。如所示图2E随着时间的推移，转移的PC3细胞迅速迁移，而mirPS-PC3细胞保持稳定。在所有其他对照中均未观察到形态学变化。因此，这种转基因mir-302s的表达足以将人类癌细胞转化为更类似于ES-的细胞形态和细胞分裂率，这表明其在癌症治疗中具有非常有益的用途。

MirPS细胞能够形成紧凑的菌落，让人想起源自人类ES细胞的胚胎体（EB）(图2F; 补充图2）。当用胶原酶IV分离，然后在添加10%FBS的RPMI 1640培养基中培养，但没有GSK和ROCK/Ras抑制剂时，许多EB样细胞根据阳性神经元标记物Tuj1和ABCA2的存在分化为神经元细胞。我们进一步注意到，mirPS-PC3 EB细胞只能分化为神经元细胞类型，而mirPS-Colo EB细胞在免疫功能受损的SCID米色小鼠中形成畸胎瘤样原始组织囊肿(图3)这表明不同的癌干细胞可能具有不同的多潜能。鉴于mirPS-Colo细胞具有广泛的多能性，因此我们评估了mir-302和mirPS-Colo细胞内ES标记表达之间的相关性。如所示图4A和补充图3，miRNA微阵列分析表明，mirPS-Colo细胞中每个mir-302成员的表达显著增加八倍以上。由于四个mir-302成员具有很高的同源性，并且靶向几乎相同的细胞基因，这一结果表明，mir-302s的整体基因沉默效应可能在mirPS细胞中增加30倍以上。基因组PCR和荧光原位杂交分析进一步显示，所有mirPS细胞携带一个或两个mir-302s转基因副本（补充图4）。因此，mir-302s的浓度可能会影响mirPS细胞的多能性和存活率。

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来自mirPS EB植入雌性假孕免疫缺陷SCID-米色小鼠子宫或腹腔的畸胎瘤样原始组织（n/total=6/6）。这些分化组织包括所有三个胚胎胚层——外胚层、中胚层和内胚层，这是由苏木精和伊红（H&E）染色后的不同细胞形态决定的。使用尼康TE2000显微镜系统在200倍放大率下拍摄照片。

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mir-302转染、ES标记表达和mirPS细胞基因组DNA去甲基化之间的相关性。(A类)miRNA表达的微阵列分析表明，所有mir-302家族成员（mir-302s）在mirPS-Colo细胞中高度表达，而不是在原始Colo细胞中（n=3，对< 0.01). (B类)Western blot分析显示，mirPS细胞表达高水平的人类ES细胞标记物，包括Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2和Nanog，但不表达致癌Klf4（n=4，P<0.01). (C)HpaII裂解显示mirPS细胞中全基因组范围的CpG甲基化缺失。(D类)未甲基化ACGT的亚硫酸氢盐修饰成AUGT位点，位于2004年10月3日启动子，显示mirPS细胞中非甲基化ACTG（AUCT）位点增加。(E类)亚硫酸氢盐DNA测序，显示了转录起始位点两侧的详细甲基化图2004年10月3日发起人。黑色和白色圆圈分别表示甲基化和非甲基化胞嘧啶位点。

人类ES细胞标记物的鉴定

根据Western blot分析，与mir-302表达升高一致，在mirPS细胞中强烈检测到许多人类ES细胞标记(图4B; 补充图5）。这些ES标记物，包括Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2和Nanog，在原始Colo癌细胞和转染空白细胞的细胞中几乎没有检测到pLNCX2-rT-SpRNAi基因载体（Colo+载体）、表达mir-gfp-miRNA的载体（Colo+mir-gfp）或表达非同源mir-434-5p前miRNA（Colo+mir-434-5p）的载体。研究表明，许多ES特性的中央调节器，如Oct3/4、Sox2和Nanog，在高级别癌症中没有广泛表达(Ben-Porath等人，2008年)Oct3/4、SSEA-3和SSEA-4的同时表达是人类ES细胞特性的关键决定因素(汤姆森等人，1998年). 因此，mirPS-Colo细胞中这些ES标记物的激活表明，mir-302s可能提供一定的“干性”，以将癌性Colo细胞重新编程为人类ES细胞样状态。正如TARGETSCAN和PICTAR-VERT程序预测的那样，甲基-CpG结合蛋白、MECP2和MECP1组分p66（MECP1-p66）都是mir-302s的强靶点，抑制核DNA甲基化似乎是该重编程过程的一个非常可能的机制。

重编程相关基因组去甲基化的评估

表观遗传修饰的改变突显了ES细胞的另一个独特特征，特别是基因组去甲基化(Hochedlinger和Jaenisch 2006). 为了将细胞重新编程为ES状态，许多胚胎基因需要通过DNA去甲基化重新激活，例如2004年10月3日为了评估mirPS细胞中的这种影响，我们首先用HpaII进行全基因组消化，HpaII是一种对CpG甲基化敏感的限制酶，只裂解非甲基化CCGG，而不是甲基化CCG位点。图4C显示来自对照Colo细胞的消化DNA片段是来自mirPS-Colo细胞的两倍多，表明mirPS基因组高度去甲基化。进一步评估2004年10月3日基因启动子区使用亚硫酸氢盐PCR和基因组DNA测序(高桥和山中2006)将所有非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。由于亚硫酸氢盐也将未甲基化的ACGT位点转变为AUGT位点，因此混合ACGT切割限制酶的消化无法将该分离区域从mirPS细胞中分离出来(图4D). 亚硫酸氢盐测序显示的详细去甲基化图进一步证明，90%以上的甲基化位点2004年10月3日mirPS细胞中基因启动子区缺失(图4E)表明表观遗传重编程过程确实发生了，重新激活了2004年10月3日表达式。这种表观遗传重编程与mir-302s的表达相关，因为与对照癌细胞相比，使用空mir-302-free载体转染的细胞中未发现DNA去甲基化。

全基因组基因表达谱的微阵列分析

需要全基因组基因分析来确定与mir-302介导的重编程事件相关的遗传改变。利用微阵列分析筛选mir-302s转染前后细胞内以及mirPS细胞与人ES H1和H9细胞之间全基因组基因表达模式的变化。使用Affymetrix基因微阵列（基因芯片U133A&B和U133+2.0阵列）评估47000多个人类基因表达模式的变化。我们首先使用相同的mirPS样本重复了微阵列测试，并从其中一个测试中选择了200个最可变的基因进行进一步比较。如所示图5A在重复试验中，这些选定的基因表达的变化都小于一倍，表明背景变化是有限的。基于所有微阵列识别基因的散射模式，我们计算了两个比较转录组文库结果之间的相关系数（CC）。CC率表示全基因组基因表达模式的相似性百分比，阈值仅为单一变化。在如此严格的CC率定义下，我们发现mirPS-Colo细胞的基因表达模式与ES H1（89%）和H9（86%）细胞非常相似，而Colo和mirPS-Colo细胞之间的CC率仅为53%。人类ES和mirPS细胞之间的这种强烈遗传相关性表明，mir-302s可能会改变数千种细胞基因表达，这些基因表达参与了癌症细胞重新编程为类ES-mirPS细胞的过程。例如，在mirPS和人类ES结果中，一致且同时观察到许多ES基因表达的升高和许多致癌、发育和mir-302靶向细胞周期相关基因的关闭，如图5，B–E。

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Colo、mirPS-Colo和人类ES WA01-H1（H1）和WA09-H9（H9）细胞之间的全基因组基因表达分析。(A类)使用人类基因组基因芯片U133A&B和plus 2.0阵列（Affymetrix）对改变的基因表达模式进行比较，显示mirPS-Colo和H1（89%）以及H9（86%）细胞之间的高度相似性，但不是原始Colo（53%）细胞。与稳定表达的基因（绿点）相比，白点表示高度可变的基因。(B类–E类)微阵列的功能聚类鉴定了差异表达的基因，表明ES细胞标志物的显著增加(B类)黑色素瘤致癌基因显著减少(C)，发育信号(D类)和mir-302s靶向细胞增殖和DNA甲基化基因(E类)在mirPS细胞中检测到，与H1和H9细胞（n=4，对<0.01). 在总共36535个（红色）信号中，任何超过23000个的信号都被认为是基因表达列表中的阳性信号。显示的所有差异基因C–E类是TARGETSCAN和PICTAR-VERT程序预测的mir-302s的靶基因。

在图5E我们注意到，细胞周期检查点基因，即CDK2、细胞周期蛋白D1和D2，以及DNA甲基化促进剂，即MECP2和MECP1-p66，均被证实为mir-302s的强靶点（补充图5）。众所周知，细胞周期蛋白E依赖性CDK2是进入S期细胞周期所必需的，抑制CDK2可导致G1期检查点阻滞，而细胞周期蛋白D1可通过DNA损伤覆盖G1期阻滞(谢尔和罗伯茨2008). 基于这一原理，mirPS细胞中CDK2和cyclin D1的抑制揭示了一个事实，即mir-302转染的癌细胞的细胞周期可以达到非常缓慢的细胞分裂率，如图2D这种癌症-干细胞周期转换的结果可能会在癌症治疗中带来重大益处。此外，MECP2和MECP1-p66活性的抑制与图4，C–E这表明恶性肿瘤细胞的表观遗传重组为良性mirPS细胞。可以想象，从患者身上获得的mirPS细胞可能进一步有助于修复癌症的组织损伤。

mirPS细胞分化的体外分子导向

多能性定义了ES细胞最重要的特征。通过不同因子和/或激素的体外操作，人类ES细胞可以分化为三个胚胎胚层（外胚层、中胚层和最终内胚层），这三个胚层是所有成人组织的创始者。在没有任何治疗的情况下，将mirPS-Colo-derived EBs异种移植到假孕、免疫功能低下的SCID-米色雌性小鼠的子宫或腹腔内，形成畸胎瘤样原始组织囊肿(图3). 这些畸胎瘤样结构的生长在植入后约2.5周终止。似乎有一种自我调节机制限制了这些mirPS EB细胞在体内的随机生长。然而，使用各种生长因子和/或激素的体外治疗，我们可以引导mirPS-Colo细胞体外分化为多种组织细胞类型，包括成纤维细胞(图6A-E)，软骨细胞(图6F–J)和精原细胞样(图6K–O)原始细胞。材料和方法中提供了这些体外条件和异种移植方法的协议。特殊组织谱系的标记也通过免疫组织化学检测进行了鉴定，分别显示生殖系特异性Dazla和EE2、成纤维细胞特异性atlastin1和I型前胶原（COL1A1）以及软骨细胞特异性原弹性蛋白和II型原胶原（COL2A1）。这些发现证实了mirPS细胞的多能性。可以想象，使用不同的分子干预，这些mirPS细胞可以诱导更多的组织细胞类型。

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mirPS细胞的多能性。DHT、TGF-β1和BMP4的治疗分别来自顶部到底部，诱导mirPS-Colo细胞分化为精原细胞样(A类–E类)，成纤维细胞样(F类–J型)和软骨细胞样(K（K）–O（运行）)免疫低下小鼠体内的原始细胞。使用免疫功能受损的裸鼠是为了提供一种模仿移植治疗的体内环境。显微照片显示自左边到正确的差异干涉对比显示苏木精染色(A类,F类,K（K）)，亮场标记转基因mir-302标记RGFP（红色）(B类,G公司,我)，用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（蓝色DAPI）标记的第一个组织标记物的免疫染色(C,H（H）,M（M）)用荧光素（绿色EGFP）标记的第二个组织标记物的免疫染色(D类,我,N个)，并合并所有三个荧光标记(E类,J型,O（运行）). RGFP亮场中的小窗口显示了高倍镜（600×）下分化的mirPS细胞的形态。

讨论

自从第一次从人类囊胚中分离出人类ES细胞系以来(汤姆森等人，1998年)有人担心人类胚胎的破坏、饲养细胞抗原的污染以及畸胎瘤的形成。最近关于诱导多能干细胞（iPS）的报道开辟了一条新途径，可以直接从成人体细胞中生成类ES-多能干电池，而不必使用人类胚胎作为起始材料(高桥和山中2006;Takahashi等人，2007年). 使用四种转录因子基因的逆转录病毒传递（即10月4日–Sox2系统–c-Myc公司–Klf4公司或10月4日–Sox2系统–纳克–第28行)在小鼠胚胎成纤维细胞中，获得的iPS细胞在许多遗传和行为特性上与小鼠ES细胞相似(Okita等人，2007年;Wernig等人，2007年). 使用类似的方法，从人类胚胎成纤维细胞和原代皮肤成纤维细胞培养物中继续开发出更多的iPS细胞系(Yu等人，2007年;Park等人，2008年). 然而，iPS细胞生成过程中出现了两个问题；一种是使用逆转录病毒转基因，另一种是利用致癌基因（例如。，c-Myc公司和Klf4公司). 逆转录病毒转染是将四个全长基因同时转基因传递到靶向体细胞的唯一有效手段，而逆转录病毒载体随机插入转染细胞基因组也可能影响其他非靶向基因并产生意想不到的结果。这是一个问题，因为同时将四个大的转基因传递到单个细胞中是很难控制的，特别是当一个或多个转基因是致癌基因时。

与以前的iPS细胞技术不同，mir-302家族的每个成员都能够同时调节445个以上的细胞基因，并且它们几乎共享相同的靶基因。许多mir-302靶基因是活跃的发育信号，参与胚胎早期发育中谱系特异性细胞分化的启动或促进。通过抑制这些发育基因，mir-302s可以将细胞重新编程为更像ES-的状态。或者，mir-302s也可以减弱其预测的靶转录因子的表达，例如SP3、HMG-box、叉头盒和LIM-homeobox基因家族，以提供细胞重编程效应。因此，mir-302s的功能更有可能减弱发育信号和/或转录因子的全球产生，而不是直接对某些胚胎信号通路产生转录刺激。通过抑制胚胎发育和细胞分化所必需的细胞基因，mir-302s不仅能够将分化的癌细胞重新编程为ES-like多能干细胞，而且能够在无饲料培养条件下保持其多能性和更新。然而，mir-302s可能不是参与该机制的唯一miRNA家族，因为正如TARGETSCAN程序预测的那样，它们的靶基因也被人类ES细胞中的mir-93、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373和mir-520组冗余沉默。了解为什么这些靶基因必须在癌症的重编程过程中同时沉默——ES细胞转化可能有助于阐明这种miRNA介导的作用对ES细胞维持和更新的机制。

利用内含子mir-302转染为人类ES-like多能干细胞的生成提供了一种安全而有力的新工具，尤其是从癌细胞和原代培养的体细胞中获得的干细胞。由于内含子miRNA途径受到多种细胞内监测系统的严格调控，如mRNA转录、RNA剪接、外泌体消化和无义介导的衰变（NMD）机制，因此它被认为比siRNA/shRNA途径更有效、更特异、更安全(Lin等人，2008年). 有利的是，这种mir-302介导的mirPS细胞生成方法有五项突破。首先，单个mir-302s表达转基因的转染提供了一种非常简单、高效和安全的方法，用于生成均质的类ES-多能干细胞，如先前的iPS方法所示，防止将所有四个大转录因子基因冗长地逆转录病毒插入到一个单一靶细胞中。其次，由于mir-302s转基因的大小仅为～1kb，转染效率极高（～100%），并且通过一次流式细胞术可以很容易地选择阳性的mirPS细胞，这是一个非常节省时间的过程。第三，mirPS细胞的转染和培养可以在无饲养条件下进行，而不会有饲养者抗原污染的风险。第四，无癌基因用于mirPS细胞的生成。最后，我们可以使用电穿孔代替逆转录病毒转染来传递单个mir-302转基因，防止病毒随机插入宿主细胞基因组的风险。鉴于这些优势已经解决了当前干细胞研究中发现的大多数问题，学习如何使用这些mirPS细胞来开发其在移植和细胞治疗中的潜力将是近期的一个挑战。

材料和方法

细胞培养和治疗

人类癌症细胞系、Colo和PC3细胞购自美国类型培养物收集中心（ATCC），并在添加有10%胎牛血清（FBS）、4 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和100μg/mL庆大霉素（Sigma Chemical）的RPMI 1640培养基中培养，培养温度为37°C，浓度为5%CO2通过将细胞暴露于胰蛋白酶-EDTA溶液中1分钟并用RPMI冲洗一次，培养物以约80%的汇合度传代，分离的细胞以1:10的稀释度重新放置在新鲜生长培养基中。mir-302转染后，将mirPS-Colo和mirPS-PC3细胞分别培养在聚鸟氨酸/层粘连蛋白涂层的培养皿中，培养基为新制的mirPS细胞培养基，该培养基含有无酚红DMEM/F12（1:1；高糖）或添加10%炭化裂解FBS、4 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640/B27培养基（Invitrogen），37°C、5%CO条件下，1 mM丙酮酸钠、5 ng/mL激活素、5 ng/mL noggin、3 ng/mL bFGF（BD Biosciences）以及0.5μM Y-27632和0.5μM GSK-3抑制剂XV（EMD Bioscinces）的等量混合物2将mirPS细胞暴露于胰蛋白酶-EDTA/胶原酶IV（1 mg/mL）溶液中1 min，然后用DMEM/F12培养基冲洗一次，以85%～90%的融合率传代。将分离的细胞以1:3的稀释度重新放置在新鲜生长培养基中，补充30%（v/v）的条件培养基，在传代前将其暴露于细胞24小时。

建造SpRNAi-RGFP公司编码内含子mir-302前miRNA簇插入物的转基因

这个SpRNAi-RGFP公司转基因是按照补充材料和方法中的报告生成的(林和英2006;Lin等人，2006年). 内含子mir-302前miRNA簇由四部分组成：mir-302a、mir-302b、mir-32c和mir-302d前miRNA。合成寡核苷酸如下：

  • mir-302a-sense，5′-GTCCGTCCCACACCTTAAACGGATGTACTTGTTGAAACTAAAGAGTAAGTGCTTCCATGTTGTGTGTGGATGCATCTCGAGCTC-3′；
  • mir-302a-反义，5′-GAGCTCGAGACACCATCAAAACATGGAGCACTTTTTAGTTAGTTAGCACACGTTAGTTGGGACGGAC-3′；
  • mir-302b-sense，5′-ATCTCGAGCTCCCTTCAACTTTACATGGAAGTGCTTTTGACTTGAAAGTGCTCCCACTTTAGGAGTGCTAGCTAGCGCTA-3′；
  • mir-302b-反义，5′-TAGCGCTAGCGACTCCTACTAAAAACAGACTACTCTCTCAAGACTAGCACTCAAAGACACTCCATGTTAGAGAGCGAGCGCGAGCTCGAGAT-3′；
  • mir-302c-sense，5′-CGCTACGCTGCTACCTTGCTTTAACATGAGGTACTGTGTGAAACAGAGTAAGTCG TTCATGTTTCAGTGGCGTTAGACAT-3′；
  • mir-302c-反义，5′-ATGTCTAGACGCCCCACTGAACTGAAACATGAACGACTTACTGTTCCACACAGCAGTCATGTTAAAGCAGGCTAGCG-3′；
  • mir-302d-sense，5′-CGTCTAGACATAAACACTCAACACATGAAGACCTAGCTAGCTACTGTAAGCTCTTCCATGTGAGTTCGACGTCAT-3′；和
  • mir-302d-反义，5′-ATGACGCGTCGGAACACTCAAACATGCAGAGACTAGCTGCTTAGCTAAGTCCATGTGAGTTAGTCTAGACG-3′。

（Sigma-Genosys）。我们首先在1×PCR缓冲液中，在94°C下杂交2分钟，在70°C下杂交10分钟，然后在4°C下杂交。然后，分别用PvuI/XhoI、XhoI/NheI、NheI/XbaI和XbaI/MluI限制性内切酶在37°C下消化相同数量的mir-302a、mir-302b、mir-32c和mir-302d的每个杂交种4小时。所有消化的杂交种用凝胶萃取过滤器收集在35μL高压灭菌的ddH中2O（Qiagen）。紧接着，通过将T4 DNA连接酶（20 U）和缓冲液添加到混合混合物中，并在12°C下孵育反应12小时，形成mir-302前miRNA簇。对于内含子插入，我们将等量（1:1）的mir-302-premi-miRNA簇与SpRNAi-RGFP公司转基因，然后用PvuI和MluI限制性内切酶在37°C下消化混合物4小时。用micron-30过滤器收集消化后的混合物，并与T连接在一起4DNA连接酶（20 U）在12°C下持续12小时。这就形成了SpRNAi-RGFP公司内含子mir-302前miRNA簇插入的转基因。

成立SpRNAi-RGFP公司将基因转入pLNCX2-rT-SpRNAi基因逆转录病毒载体

我们修改了VSV-G型-阳性泛向逆转录病毒载体，即。，pLNCX2-rT型，以转基因方式传递mir-302编码的SpRNAi-RGFP公司转基因(Lin等人，2006年). 这个pLNCX2-rT型该载体来源于改良的假型Moloney小鼠白血病病毒，pLNCX2型（Clontech）。如所示图1，我们首先将SpRNAi-RGFP公司将基因转入pLNCX2-rT型然后将mir-302前miRNA簇构建物插入SpRNAi-RGFP公司转基因，从而形成逆转录病毒pLNCX2-rT-SpRNAi基因能够转基因表达mir-302s的转基因载体。在实验中，我们将等量（1:1）的核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸核糖核酸转基因与pLNCX2 rT基因逆转录病毒载体，然后在37°C下用XhoI和AflII限制酶消化混合物4小时。用micron-30过滤器收集消化后的混合物，并与T连接在一起4DNA连接酶（20 U，罗氏生物化学公司）在12°C下培养12小时。按照相同的方案，除了使用PvuI/MluI消化外，我们将mir-302前miRNA簇合并到pLNCX2-rT-SpRNAi基因矢量。前miRNA插入pLNCX2-rT-SpRNAi基因矢量在中传播大肠杆菌含有100μg/mL氨苄西林（Sigma）的DH5αLB培养物，并按照制造商的建议用QIAprep自旋迷你制剂试剂盒（Qiagen）纯化。对于病毒生产pLNCX2-rT-SpRNAi基因用等量的pVSV-G病毒载体进入GP2-293包装细胞（Clontech）以产生具有感染性但不可复制的泛向逆转录病毒。GP2-293细胞在添加10%FBS、4 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠的无酚红DMEM培养基中生长。按照制造商的建议，使用FuGene 6试剂（Roche）进行联合转染。

使用pLNCX2-rT-SpRNAi基因转基因载体

在GP2-293细胞培养物的DMEM培养基中，共转染后约36–48小时释放出高滴度病毒pVSV-G病毒和pLNCX2-rT-SpRNAi基因向量。在细胞转染前，按照逆转录-X qRT-PCR滴定试剂盒（Clontech）的方案，病毒滴度被测量为超过感染多重性（MOI）30。然后，我们将高滴度病毒培养基转移到Colo或PC3细胞培养物中，并在37°C和5%CO下培养细胞12小时2然后，用新鲜的mirPS细胞培养基代替病毒培养基，每隔3天更换一次。感染后24小时，用抗mir-302表达标记物RGFP（Clontech）的单克隆抗体进行FACS流式细胞术分选，分离并收集阳性转染细胞。这些分离的细胞在上述mirPS细胞培养基中生长。

mirPS细胞分化的体外分子导向

在除无饲料mirPS培养基外无任何治疗的情况下，将mirPS EB异种移植到6周龄假孕、免疫功能低下的SCID-米色小鼠的子宫或腹腔，而不是其他组织中，可形成充满畸胎瘤样原始组织的囊肿。使用免疫缺陷裸鼠是为了提供体内环境模拟移植治疗。通过腹腔注射1IU人更年期促性腺激素（HMG）2d，然后再注射人绒毛膜促性腺素（hCG）1d，制备假孕小鼠。为了对精原细胞谱系进行体外分子指导，将mirPS细胞保存在DMEM/F12（1:1；高糖）培养基中的聚鸟氨酸/层粘连蛋白涂层培养皿上，该培养基补充有炭黑状的10%FBS、4 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、5 ng/mL激活素和50 ng/mL二氢睾酮（DHT），37°C，5%CO下培养12小时2然后将细胞胰酶化，用1×PBS洗涤，收集在四等分冷却的Matrigel（每100μL）和一等分100μL 1×PBS中。然后立即将细胞移植到后肢肌肉、腹膜、子宫、颈部皮下皮肤（用Matrigel）和尾静脉（用PBS）中6周龄无胸腺免疫受损SCID-米色裸鼠。在实验过程中，用乙醚麻醉小鼠。一周后，仅在子宫区域发现精原细胞样细胞。对于成纤维细胞分化，我们遵循与上述相同的程序，除了在异种移植前使用补充有10%FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5ng/mL诺金和100ng/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）的常规无酚红DMEM培养基6小时。1周后子宫内发现成纤维细胞样细胞。对于软骨细胞分化，我们进行了与之前相同的程序，但使用补充有10%FBS、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和100ng/mL骨形态发生蛋白4（BMP4）的常规RPMI 1640培养基6小时。仅在肝脏区域发现软骨细胞样细胞。

补充数据

补充材料可在网址：http://www.rnajournal.org.

脚注

缩写：miRNA，microRNA；mir-302s，mir-302家族；ES，胚胎干；诱导多能干；mirPS、mir-302诱导的多能干；EB，类胚体；肿瘤干细胞；Pol-II，RNA聚合酶II型；NMD，非传感介导的衰变。

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.rnajournal.org/cgi/doi/10.1261/rna.1162708.

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