野生型和突变型卵泡抑素对激活素、肌抑素和生长分化因子11的差异拮抗作用

摘要

ACTIVIN、MYSTATIN和生长分化因子-11（GDF11）是TGFβ超家族的一个分支，这些生长因子共享一个共同的信号成分核心，包括I型和II型激活素受体以及Smad2和3（Smat母亲对抗十脑停搏-2和-3）第二信使(1,2). 激活素与发育过程中的细胞脂肪测定和器官发生有关，观察到激活素-A缺失小鼠出生后不久死于骨骼和肌肉异常，强调了其重要性(三). 在成年人中，激活素影响生殖(1)，伤口愈合(4)，成骨(5)，免疫反应(6)和胰腺β细胞增殖(7). 肌生长抑制素调节胚胎肌肉发育和成人肌肉质量(8)和肌肉生长抑制素无效小鼠的肌肉组织显著增强(9). 此外，肌肉生长抑制素影响脂肪生成，因为肌肉生长抑素表达的过度表达和基因断裂都会导致脂肪量减少(10). GDF11基因缺失小鼠在胰岛发育方面存在严重缺陷，导致胰岛祖细胞数量增加，但成熟β细胞分化减少(11). 综上所述，这些发现表明，这组配体在胚胎发育和成人体内平衡中都具有关键作用。

卵泡抑素（FST）和类卵泡抑素酶（FSTL）-3（FLRG，FSRP）形成了一组相关的卵泡抑制素结构域（FSD）蛋白质，这些蛋白质具有重叠的生化、分子、生物合成和结构功能属性，尽管它们之间也有重要的差异(12). TGFβ超家族配体的中和作用是其唯一已知的生物活性。这两种蛋白质都不可逆地结合和中和激活素，并以3-5倍的低亲和力结合肌抑制素(13,14,15). FST阴性小鼠出生后立即死于肌肉和骨骼形成缺陷(16)，而FSTL3缺失小鼠是可行的，但改变了葡萄糖代谢并增强了胰腺β细胞的形成(17). 性腺中FST过度表达导致性腺结构异常和生育能力降低(18)而FSTL3过度表达导致睾丸变小，男性生育能力降低(19)表明FST和/或FSTL3对激活素活性的调节对正常生殖很重要。此外，肌肉中FST的转基因过表达导致肌肉组织增加，可能是由于FST的拮抗作用降低了肌抑制素活性(20). 这些观察结果表明在体外和体内FST和FSTL3的功能是调节激活素和肌抑制素的活性，它们的缺乏或过量会导致发育和/或功能异常。

肌肉生长抑制素过量的实验状态导致体重减轻和恶病质(21)是一种常见的与癌症、艾滋病、肾衰竭和胃肠道疾病等慢性疾病相关的身体组织消耗状态，并导致这些疾病的发病率和死亡率(22,23). 此外，体重减轻10%以上的艾滋病患者的循环肌抑制素水平显著升高(24). 这些观察加速了对肌肉生长抑制素抑制剂的研究，该抑制剂可能成为治疗肌肉铸型疾病的新型治疗策略的基础。

最近报道了与激活素结合的FST的晶体结构，其中FSD2在每个FST分子和激活素同二聚体的一个亚单位之间的接触中起着重要作用(25). 使用点和结构域突变对FST结构-功能关系进行的额外分析已确定FSD1、FSD2和N末端结构域中的许多残基对FST的结合活性有重要影响(26,27). 此外，这些研究表明FST域的顺序也很关键(26). 综上所述，这些研究表明FST中的特定残基，尤其是FSD2中的特定残留物，对于FST和激活素之间的高亲和力相互作用至关重要。

虽然目前还没有直接的结构证据，但理论上可能激活素和肌抑制素与FST和FSTL3结合的关键决定因素并不完全重叠，这表明选择性激活素或肌抑制蛋白拮抗剂可能是通过天然蛋白的突变而获得的。开始破译FST中对结合和中和肌抑制素至关重要的部分与.激活素，我们测试了先前制备的激活素活性改变的FST点和结构域突变体(26,27)抑制肌抑制素活性的能力在体外我们的结果表明，FSD1突变对肌抑素结合的影响最大，而减少或消除激活素结合的FSD2突变对肌肉抑素结合几乎没有影响。此外，鉴于肌生长抑制素和GDF11之间的密切结构关系，我们还通过野生型（WT）和突变FST检测了GDF11的结合和中和。这些结果证实了FST主要接触激活素和肌肉生长抑制素的概念(28)并证明可以改变FST突变体的选择性，以减少激活素结合，同时保持肌抑制素的中和作用。我们的结果还表明，这些突变体将结合GDF11，需要进一步实验来分离肌肉生长抑制素和GDF11结合决定簇。

材料和方法

数据分析

报告者的活性结果表示为每个配体的最大（无FST）百分比。每个实验还包括WT FS 288作为阳性对照。对激活素和肌抑制素抑制之间存在显著差异的突变体进行了至少三次测试。

用于比较FST突变体在200 ng DNA/孔的激活素和肌抑制素结合活性（图1​1),)在该分析中，每个突变体对激活素和肌抑制素的抑制被归一化为WT FST的活性。用于比较激活素和肌抑制素对增加剂量的WT或突变FST的抑制作用（图2​2),)、ED₅₀按50%最大刺激被抑制的剂量估算。这一点与突变FST进行了比较与WT FST并比较肌抑制素和激活素抑制活性。

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图1

激活素和肌抑制素对FST突变体拮抗作用的比较。在单剂量（200 ng/ml）下测试FST突变体对抗激活素（5 ng/ml在体外生物测定，结果与在同一测定中测试的WT FST相关，因此比率为1表示与WT FST具有相同的拮抗作用。第一组代表整个FST结构域的缺失、变位或重排，而第二组和第三组的突变分别代表FSD1或-2的点突变。进一步研究了激活素拮抗作用减弱但肌抑制素拮抗活性基本保持不变的突变体。所示为至少三个实验之一的代表性结果。

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图2

激活素和肌抑制素对六个激活素选择性最大的FST突变体的拮抗作用比较。根据图1的结果​1,在剂量反应分析中，研究了六种激活素和肌肉生长抑制素拮抗作用不同的突变体，或表现出结构域顺序或数量的显著改变的突变体。WT FST的抑制作用如所示实线和突变FST虚线。Activin在闭合圆肌肉抑制素在闭合三角形删除FSD 2的dFSD2突变体（A）在肌抑制素抑制（仅比WT FST略微降低）和激活素抑制（除最高剂量外未检测到）之间的差异最大。B-F，其他突变体也进行了类似的研究。所示为三个实验之一的代表性结果。

结果

之前描述的20个FST突变体（表1​1))检测FSD1、FSD2、N末端结构域中含有单氨基酸取代或改变FSD数量或顺序的突变的肌抑素和激活素抑制活性。先前显示抑制激活素抑制的N末端结构域突变(27)还将myostatin活性降低到类似的程度（未显示），因此未进行进一步研究。其余13个对至少一种配体保持拮抗活性的突变体通过在体外在单个最大剂量下进行生物测定，以比较激活素和肌抑制素相对于WT FST的拮抗作用。我们发现FSD1的完全缺失减少了肌肉抑制素和激活素的抑制，表明这两种活性都需要这个结构域（图1​1).). 然而，剩余的FST突变体显示了激活素的差异抑制与肌抑制素，有六个突变体，主要集中于FSD2，保留了大量或完全的肌抑制蛋白拮抗作用，同时激活素抑制作用减弱（图1​1))并进行了进一步调查。

对6个差异活性突变体进行多剂量检测，以更详细地比较它们与WT FST的激活素和肌抑制素拮抗剂的相对活性。有趣的是，FSD2（dFSD2）的完全缺失对肌抑制素抑制几乎没有影响（图2A​2安；; 比较三角形,实线与虚线)而激活素活性的抑制几乎完全消除（图2A​2安；; 比较圆圈,实线与虚线). 改变FST域的顺序，使FSD3先于FSD1和-2（图2B​2B；; FSD3/1/2）对激活素活性有类似的影响，但也将肌抑制素抑制作用降低了近10倍。将FSD2放置在FSD1之前（FSD2/1/3），在降低激活素抑制方面效果不佳，但对肌抑制素抑制没有影响（图2C​2C）。). 这些结果表明，FSD2对激活素拮抗作用更为关键，而FSD1似乎对肌肉生长抑制素抑制作用更为关键。

因此，我们用额外的FSD1副本（FSD1/1/3）替换FSD2，这比WT FST在拮抗肌抑制素方面更有效，但失去了其大部分激活素拮抗活性（图2D​2D）。). 相反，用额外的FSD2（FSD2/2/3）拷贝替换FSD1，使肌抑制素抑制降低近10倍（图2E​2E），)与假设的FSD1相比，FSD2对激活素生物活性的影响更大。FSD2中的点突变，如Y185A，对肌生长抑制素抑制几乎没有影响，但使激活素拮抗作用降低了10倍以上，这与该结构域对激活素抑制更为重要一致。综上所述，这些结果表明，影响FSD2的突变对激活素拮抗作用有更大的影响，而FSD1似乎对抑制肌抑制素活性更为关键。

为了确定突变体活性的改变是否是由于配体结合的改变，我们研究了与固相配体直接结合活性差异最大的三个突变体。尽管WT FST与固相激活素结合良好，但即使在测试的最大剂量下，也没有任何突变体结合激活素（图3A​3A）。). 相反，WT FST和所有FST突变体按秩顺序与固相肌抑制素结合，符合生物活性（WT>dFSD2>FSD3/1/2>FST Y185A；图3B​3B）。). 因此，差异活性似乎是由于与FSD2突变体的结合亲和力的差异，FSD2突变体保留了肌生长抑制素的结合，但表现出激活素结合大大降低。这些结果还表明，通过删除FSD2，改变其在FST分子中的位置，或将突变引入FSD2选择性地降低激活素（相对于肌抑制素抑制），选择性肌抑制酶拮抗剂被创造出来。

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图3

WT或突变FST与激活素和肌抑制素的直接结合。A、 将激活素（50 ng/孔）吸附到平板上，并增加WT或突变FST蛋白的量，持续2 h。没有任何突变与激活素结合，而WT FST在所有剂量下均可检测到。B、 WT FST和突变体与肌抑制素结合的顺序与其生物活性一致（见图2​2),)这表明突变体与肌抑制素的差异结合是其差异活性的原因。显示了三个实验之一的代表性结果。

由于GDF11和myostatin的序列高度保守，我们检测了FST是否可以以相似的亲和力结合这两个配体。我们无法获得功能性的放射性碘化肌抑制素或GDF11，但与竞争性抑制放射性标记激活素与FST结合的激活素相比，我们发现GDF11的活性大约比激活素低6倍（图4A​4A），)，相当于FST与肌抑制素结合与激活素在类似试验中的差异(15). 然后，我们检测了dFSD2，激活素和肌抑制素之间差异拮抗作用最大的FST突变体，是否会同样差异拮抗GDF11。而dFSD2大大降低了激活素抑制活性（图4B​4B），)，该突变体在抑制GDF11方面与WT FST具有相同的活性在体外生物测定（图4C​4C）。). 此外，这种差异活性与肌抑制素的差异活性相同（图2A​2A）。). 这些结果表明，与肌抑制素一样，具有2域缺失的FST突变体对GDF11相对于激活素具有选择性。此外，他们证明这种突变体将以类似方式对抗肌抑制素和GDF11，因此对这两种配体没有选择性。

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图4

WT和突变FST与GDF11结合。A、 比较了未标记的激活素或GDF11与结合固相WT FST的放射性碘化激活素竞争的能力。与激活素的结合约为GDF11的6倍，但GDF11与肌抑制素的结合相似。B、 WT FST抑制激活素活性，而dFSD2突变体如图2A所示不活跃​第二章。.C，在相同的测定中，WT和dFSD2突变体FST在GDF11活性的中和方面基本上没有差异，类似于肌肉生长抑制素的结果（图2A​2A）。). 因此，肌抑制素选择性突变体也将结合和中和GDF11。

讨论

多年来，卵泡抑素被认为是激活素的高亲和力结合和中和蛋白(1,15). 最近报道了其他TGFβ家族配体的高亲和力结合和中和，包括肌抑素和骨形态发生蛋白，尽管与激活素的亲和力较低(15,29). 然而，这些亲和力差异表明，FST和激活素之间的关键接触区域对于相关TGFβ家族配体可能并不相同。本文报道的实验旨在验证以下假设，即与激活素关系最密切的TGFβ家族配体（即肌抑素和GDF11）之间FST接触的差异可能导致识别具有肌抑素相对于激活素选择性结合的FST突变体。这些突变体作为药物制剂很有价值，可以抑制肌肉生长抑制素的活性，以促进肌肉缺乏状态下的肌肉生长，如恶病质或肌营养不良，并避免由于同时抑制激活素而产生的潜在副作用。

与最近解决的与FST结合的激活素晶体结构一致，该晶体结构表明FSD2与激活素之间存在广泛接触(25)以及我们之前的突变分析，将FSD2确定为关键的激活素结合区(26)目前的结果表明，FSD2的缺失、其在FST分子中位置的改变或FSD2内的点突变都会降低激活素拮抗作用。相反，消除FSD1或改变其位置的突变通常会改变肌抑制素抑制。值得注意的是，那些减少激活素拮抗作用的FSD2突变对肌抑制素抑制作用几乎没有影响，这表明这些配体确实受到FST的不同结合和拮抗。该观察结果表明，有可能产生选择性抑制肌抑制素的FST突变体。最具选择性的突变体是dFSD2，其中第二个FST结构域被删除，留下N结构域和FSD1，然后是FSD3。该突变体与WT FST类似地拮抗肌抑制素，但其激活素抑制活性降低了250倍以上。此外，未检测到与激活素的直接结合，而肌抑制素的结合仅略有减少。这些结果表明，dFSD2突变体可能作为肌抑制素选择性突变体体内从而构成了开发具有治疗价值的选择性肌肉生长抑制素抑制剂的起点。

Nakatani最近证明了这种拮抗剂的价值等. (28)在转基因模型中。肌肉中含有N结构域和FSD1（FS I-I）两个拷贝的FST突变体的过度表达导致肌肉质量和力量增加，这是由增生和肥大引起的(28). 此外，这种突变体在中密度纤维板小鼠（Duchene肌营养不良模型）至少部分缓解了这种疾病(28). 尽管本研究清楚地证明了一种选择性FST突变体逆转肌肉变性的潜力，但所研究的唯一另一种FSD1或-2突变体是一种含有FSD1和FSD3两个拷贝的构建物（FS I-I-3）。发现该蛋白与激活素和肌抑制素的结合类似于FS I-I突变，因此没有进一步研究(28). 有趣的是，FS 1–1-3突变体在结构上似乎与我们的FSD 1/1/3突变体相同，但在我们的试验中，FSD 1/1/3突变体的选择性低于我们的dFSD2突变体，因为FSD1/1/3中保留了大量激活素抑制活性。虽然我们使用的是同一个报告人，但我们使用的却是人类胚胎肾293细胞，而不是Nakatani使用的A204细胞等.，这可能是不同结果的一个来源。然而，这两项研究都清楚地表明，可以构建FST突变体，以选择性抑制与激活素结合相关的肌抑制素活性。

GDF11最近被证明是胰腺β细胞发育和分化的关键调节因子(11). 鉴于其与肌生长抑制素的广泛结构一致性，我们研究了FST是否可以中和其生物活性，以及对肌生长抑素具有选择性的FST突变体是否对GDF11具有类似的选择性。我们发现GDF11抑制激活素与FST的结合，其效价约低6倍，与肌抑制素与激活素的结合有可比性(15,28). 此外，WT FST拮抗了两种激活素的生物活性（图4B​4B）)和GDF11（图4C​4C），)这种拮抗作用相当于突变的dFSD2（图4C​4C）中，)也拮抗肌抑制素（图2A​2A）。). 然而，虽然结合结果表明相对于GDF11，激活素的抑制效力更强，但生物测试结果表明相对于激活素，GDF11的抑制作用更强。这种差异可能是由于GDF11制剂的生物活性低于100%，从而在生物测定中降低了其相对于FST或dFSD2的有效浓度，这将使结合曲线向右移动，生物测定曲线向左移动。然而，这些结果表明FST是TGFβ超家族激活素分支所有成员的结合和中和蛋白，对肌抑制素和激活素具有选择性的突变体对GDF11具有类似的选择性。这一观察结果表明，虽然可以创造相对缺乏激活素中和的FST突变体，但它们可能同时抑制肌抑制素和GDF11。由于GDF11在成人体内的活性目前尚不清楚，我们的研究结果表明，肌抑制素选择性FST突变体的潜在副作用需要进一步研究。

在本研究中，我们已经证明，结合和中和激活素和肌抑制素所需的FST表面至少部分不同，FSD1对肌抑制蛋白结合更为关键，FSD2对激活素中和更为重要。激活素拮抗作用相对于肌肉生长抑制素下降最大的突变体dFSD2对肌肉生长抑制素的抑制作用相对于激活素至少高250倍。我们还发现WT FST和dFSD2突变体都与GDF11结合。综上所述，我们的结果证实了FST中激活素和肌抑素/GDF11的差异结合位点的存在，并支持开发具有降低激活素抑制作用的选择性拮抗剂。尽管这些拮抗剂可能仍然无法区别中和肌抑制素和GDF11，但对FST拮抗剂的进一步突变分析可以确定允许其功能区分的残基或区域。

致谢

脚注

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