Kismeth：通过亚硫酸氢盐测序分析植物甲基化状态
审核人,#1 ,#2 ,#1 ,1 ,1和
三 埃亚尔·格伦特曼
1美国纽约州纽约市冷泉港邦顿路1号冷泉港实验室，邮编11724
齐义军（Yijun Qi）
2中国北京市中关村生命科学园科技园路7号北京国家生物科学研究所，邮编102206
R基思·斯洛特金
1美国纽约州纽约市冷泉港邦顿路1号冷泉港实验室，邮编11724
特德·罗德
1美国纽约州纽约市冷泉港邦顿路1号冷泉港实验室，邮编11724
罗伯特·马丁森
1美国纽约州纽约市冷泉港邦顿路1号冷泉港实验室，邮编11724
拉维·萨奇达南丹
三美国纽约州纽约市麦迪逊大道1425号西奈山医学院遗传与基因组科学系，邮编：10029
1美国纽约州纽约市冷泉港邦顿路1号冷泉港实验室，邮编11724
2中国北京市中关村生命科学园科技园路7号北京国家生物科学研究所，邮编102206
三美国纽约州纽约市麦迪逊大道1425号西奈山医学院遗传与基因组科学系，邮编：10029
通讯作者。 #贡献均等。
收到日期：2008年6月2日；2008年9月11日接受。
版权©2008 Gruntman等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
人们对探索各种生物体基因组中胞嘧啶甲基化状态的时间和空间模式非常感兴趣。希望这将阐明DNA甲基化在基因表达的表观遗传控制中的生物学作用。亚硫酸氢盐测序是指用亚硫酸氢钠处理分离的DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用PCR将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，然后对所得DNA进行测序，以检测DNA甲基化。对于DNA甲基化的研究，植物提供了一个极好的模型系统，因为它们能够容忍DNA甲基化模式的重大变化，并且长期以来一直在研究DNA甲基化对转座子和表观突变的影响。然而，与动物的情况相反，没有很多工具可以分析植物中的亚硫酸氢盐数据，这些数据可以在各种序列上下文（CG、CHG和CHH）中显示胞嘧啶的甲基化。
结果
基斯梅特网址：http://katahdin.mssm.edu/kismeth是一个基于网络的亚硫酸氢盐测序分析工具。Kismeth被设计用于植物，因为它考虑了任何序列上下文（CG、CHG和CHH）中潜在的胞嘧啶甲基化。它为亚硫酸氢盐引物的设计提供了一种工具，也为亚硫酸氢盐测序结果的分析提供了多种工具。Kismeth不限于植物数据，因为它可以用于任何物种的数据。
结论
Kismeth简化了亚硫酸氢盐序列分析。它是设计植物亚硫酸氢盐引物的唯一公开工具，也是分析植物甲基化模式的少数工具之一。它有助于在全球和局部范围内进行分析，如文中引用的示例所示，允许解剖DNA甲基化所涉及的遗传途径。Kismeth也可用于研究不同组织和疾病细胞中甲基化状态与参考序列的比较。
背景
DNA甲基化涉及胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶，这是DNA甲基转移酶（DNMT）作用的结果[1]. DNA甲基化发生在不同生物体的不同序列环境中。在智人和其他哺乳动物一样，DNA甲基化主要发生在CG二核苷酸的胞嘧啶中[2].
在植物中，DNA甲基化对亲本印记、胚胎发生调控、转座子沉默和种子活力至关重要[三-5]. 研究表明，在三种不同的情况下，胞嘧啶甲基化涉及不同的途径；CG、CHG（C后跟一个非G，然后是一个G）和CHH（C后继两个非G）[1]. 植物与哺乳动物共享DNA甲基化机制的一些关键元素，但还包含植物特异性途径。植物可以耐受DNA甲基化途径中的突变，这对哺乳动物来说是胚胎致死的（例如DNMT1），因此为甲基化研究提供了一个强大的模型系统。
高效准确地测量DNA甲基化的能力对于理解导致DNA甲基化过程的机制至关重要。已经开发了各种技术来检测和量化DNA甲基化。亚硫酸氢盐测序正在成为甲基化研究的金标准，因为它既提供了序列的高分辨率，又提供了特定位点DNA甲基化的定量测量[6,7].
亚硫酸氢盐测序涉及亚硫酸氢处理单链DNA，将未甲基化的胞嘧啶（C's）转化为尿嘧啶，而甲基化的C's保持不变。处理后，对感兴趣区域进行PCR扩增，并对PCR产物进行克隆和测序。转化C（变成尿嘧啶）的PCR扩增将导致尿嘧啶被胸腺嘧啶取代。通过比较亚硫酸氢盐处理的DNA和未处理的DNA的序列，确定了甲基化情况：C到T的转换表示非甲基化的C；相反，C到T转换的缺失表明C的甲基部分受到保护，因此甲基化。因此，在标准亚硫酸氢盐处理中，对每个序列进行多个测序运行/克隆取样。这使得数据分析变得复杂。
现有的大多数基于网络的工具都是专门为哺乳动物设计的，因此无法检测CG上下文之外的甲基化。目前，分析植物中亚硫酸氢盐转化DNA的唯一可用工具是CyMATE[8]. 尽管该工具提供了充分的分析，Kismeth还提供了其他有用的功能，例如能够设计引物以PCR扩增亚硫酸氢盐处理的DNA，分析单个测序读数，并有助于对与亚硫酸氢处理甲基化检测相关的多个序列进行批量分析。
结果和讨论
任何特定位置的C在任何给定组织中都可能没有完全甲基化，这是内在变异性的一种度量。此外，亚硫酸氢盐处理可能导致不完全转换，这是测量行为引入的外部噪声。因此，为了测量DNA甲基化水平，需要分析来自多个生物复制的大量PCR产物的单个克隆。Kismeth是少数几个可以执行此类分析的基于网络的程序之一，尤其是针对植物。
在本节中，我们介绍了Kismeth，然后介绍了它在两个试点研究中的应用，最后将其与可用于分析亚硫酸氢盐测序的其他工具进行了比较。
工具描述
我们在这里描述了Kismeth中包含的两个工具，亚硫酸氢盐测序数据的分析仪和亚硫酸氢酯测序引物的设计者。
亚硫酸氢盐测序分析仪
Kismeth需要两个fasta格式的文件，一个包含参考序列，另一个包含亚硫酸氢盐测序结果。参考序列应为侧翼PCR引物之间的最小序列（不包括PCR引物）。除了测序技术设置的限制外，对序列长度没有其他限制，该软件可以很好地处理数百个序列，但数量过大可能导致网站停滞[6,7].
这两个文件都上传到如图所示的首页上。通过Kismeth首页上的链接可以获得应用程序部分中描述的试点研究的示例文件。首页上的问号提供了该工具的手册（或问题答案）。Kismeth将执行分析并返回如图所示的简要表和图表和，总结整个序列的统计信息。该图显示了参考序列中每个胞嘧啶位置的甲基化分数，可以快速估计不同区域的甲基化率（图). 图表的基础数据，序列中各种胞嘧啶的甲基化状态，也可以在网上浏览（查看链接）或作为可下载的逗号分隔值（csv）文件（下载链接），可以导入电子表格程序。
网站首页。参考序列文件和包含亚硫酸氢盐测序结果的文件上传到此页面。结果如图2和图3所示。文本中描述的示例数据集可以从此页面下载。程序中使用的参数也可以通过此页面上的文本框进行修改。
结果概要（顶部）。这是结果页的上半部分。该表显示了所有序列读取的每种类型胞嘧啶（CG、CHG和CHH）的总统计数据。每个职位的数据可以在网页（查看链接）中以表格的形式查看，也可以作为电子表格（下载链接）查看。单个序列的分析链接允许查看详细比对（匹配链接，如图4所示）或显示序列中胞嘧啶的点图（点图链接，如表5所示）。
结果概要（底部）。这是结果页的下半部分。该图显示了三条信息，即感兴趣序列中各种类型C的位置（如图底部的彩色条）、在测序读数中对每个胞嘧啶采样的次数（如x轴下方的彩色条）以及每个位置的胞嘧啶甲基化的次数，作为x轴上方的彩色条。颜色代表序列中的三种C，红色代表CG，蓝色代表CHG，绿色代表CHH。这些控件允许放大图形区域以进行更仔细的查看。
此外，可以通过比赛和圆点图摘要页面上的链接（如图所示). 详细的比赛视图突出显示了亚硫酸氢盐处理过程中的各种胞嘧啶序列和结果（图)允许用户研究单个比对，以评估可能导致不匹配的测序工作的质量（除了C到T转换）。这个圆点图仅将胞嘧啶显示为圆形，根据胞嘧啶的类型进行着色（红色代表CG，蓝色代表CHG，绿色代表CHH），填充的圆圈代表甲基化胞嘧啶，空圆圈代表非甲基化胞苷（图). 可以在Kismeth的首页更改算法部分中描述的程序参数。Kismeth还为各种图形生成postscript文件，这些文件可以下载用于出版物。
每个序列结果的详细视图。匹配的详细视图突出显示了各种类型的胞嘧啶（CG、CHG和CHH）及其在亚硫酸氢盐处理下的每个序列读取的命运。第一行，标记为在里面每组的，是参考序列，胞嘧啶的颜色代表胞嘧啶的类型（如图3所示）、CG（红色）、CHG（蓝色）和CHH（绿色）。第二行，标记为外面的，显示了用彩色T进行亚硫酸氢盐测序的结果，红色对于未转化的C（受甲基化保护）和棕褐色的用于转化的C（非甲基化）。每个序列上方的失配数给出了所显示序列的失配数量（除了C到T转换）和特定序列的总长度。这提供了对序列质量的估计。
圆点图点图是一种快速总结各种胞嘧啶在每个测序读取中的命运的方法。颜色编码的圆圈用于表示类型（如图3和图4所示）、CG（红色）、CHG（蓝色）和CHH（绿色）。当胞嘧啶甲基化时，圆圈被填满。此视图用于检测群体中可能被平均值掩盖的相似克隆组（见正文）。提供了一个克隆名称表来标识克隆。
亚硫酸氢盐底漆设计
Kismeth还提供了为特定区域的甲基化分析设计引物的选项。首页上的底漆设计程序链接（图)引导至底漆设计首页（图). 在这里，用户可以上传参考序列文件，指定PCR产物的长度和所需的Tm（近似值），Kismeth将根据其预测效率提供可选引物列表。用户还可以选择为输入序列的反向补体设计引物，从而询问两条DNA链。结果以表格形式显示（图).
亚硫酸氢盐测序引物的设计。通过此页面，用户可以上传参考序列文件，确定结果产品的长度和所需的Tm，Kismeth将提供根据预测效率排序的可选引物列表。引物的设计考虑了亚硫酸氢盐的限制，如文中所述。用户还可以选择为输入序列的反向补体设计引物，从而询问两条DNA链。
Kismeth的底漆设计。每个链的引物对以表格的形式给出，如图所示。我们显示了在Mu1来自示例数据集的序列。
Kismeth的应用
我们使用Kismeth分析了拟南芥第一项研究表明在Mu1突变背景中的转座子，导致表观遗传重新激活[9]. 第二项研究是关于ARGONAUTE-4型是CHG DNA甲基化所必需的拟南芥[10]. 我们在这些试点研究中的目的是证明Kismeth有能力以有意义的方式分析这些数据。与这些试点研究相关的生物学在其他出版物中有更广泛的描述。
AtMu1转座元件的DNA甲基化
我们的第一个试点研究是使用Kismeth研究甲基化数据在Mu1轨迹拟南芥（见4g08680）。这种转座子因DNA甲基化而表观遗传沉默[9]. A类DNA甲基化减少1(ddm1型)突变背景诱导全基因组DNA甲基化降低[11]. 这个在Mu1基因座显示在ddm1型突变背景[9].
我们从野生型中生成亚硫酸氢盐数据拟南芥植物（Columbia-0、Col-0）和ddm1型突变体AtMu1型使用Kismeth中引物设计工具生成的PCR引物进行5’末端反向重复。如图所示，在所有序列上下文的胞嘧啶之间的整体甲基化变化是明显的ddm1型突变体。
WT Col-0和ddm1型突变体在Mu15'末端反向重复序列（MULE DNA转座子，At4g08680）所有胞嘧啶的甲基化水平在ddm1型样本与WT进行比较，在所有克隆中取平均值。图约定与图3相同。
使用比赛我们可以看到，尽管我们的一些克隆有一两个不匹配，但总体质量还是令人满意的。如图所示，的圆点图表明尽管甲基化在ddm1型突变体，在ddm1型背景显示DNA甲基化的wt样水平。
WT Col-0和ddm1型突变体在Mu15'终端反向重复尽管总体甲基化不同，但两个克隆似乎保留了WT水平的DNA甲基化（框区）。图约定与图5中的相同。
甲基化的总体下降如图所示可能是每个植物或细胞中甲基化水平普遍降低的结果，也可能是某些植物/细胞甲基化完全丧失而其他植物/细胞中WT水平保持不变的结果。图显然，后者是正确的。
为了评估我们的背景非转化水平，我们使用了At2g20610，这是一种已知在WT中未甲基化的基因。我们在可以从网站下载的示例数据集中提供了数据，这确实表明我们看到的效果不是实验性的。
精氨酸-4在DNA甲基化中的作用
作为第二项先导性研究，为了研究DNA甲基化途径的全球效应，我们从拟南芥野生型（Landsberg erecta，拉伊尔)和一个RNAi突变体会前4-1处理后的DNA用于重复元件MEA-ISR的PCR扩增[12].
在我们的实验中，拉伊尔和会前4-1分别测序了35个和36个克隆。然后使用Kismeth分析这两组序列。Kismeth生成的分析与之前显示的完全一致[10].
在野生型植物中，在CG、CHG和CHH环境中观察到高水平的甲基化Cs（示例数据集称为雷尔可从Kismeth网站下载）；而那些会前4-1（Kismeth网站上提供的示例数据集，标记为会前4-1)CHG和CHH甲基化减少，CG甲基化不变（图). 图中所示的点图与图中的观察结果一致通过比较两个数据集的曲线图，CHG和CHH甲基化降低。因此，Kismeth可以快速评估生物相关的全球甲基化变化。
WT Laer与对照组甲基化的比较会前4-1使用Kismeth的突变体这是WT-Laer甲基化曲线与会前4-1重复元件MEA-ISR的突变体[12]. 顶部图形显示WT，而底部面板显示ago4-1突变体。CHG和CHH胞嘧啶的甲基化在会前4-1与WT相比，突变体，而CG胞嘧啶不受影响。
WT-Laer与会前4-1使用Kismeth的突变体这显示了WT-Laer甲基化曲线的点图比较会前4-1突变体。顶部点图显示WT，而底部面板显示会前4-1突变体。CHG和CHH胞嘧啶的甲基化在会前4-1与WT相比，突变体，而CG胞嘧啶不受影响。
Kismeth的优势
有几个程序设计用于分析亚硫酸氢盐测序数据，CyMATE[8]是一个基于网络的程序，在功能和电厂数据适用性方面与Kismeth最接近。我们列出了Kismeth与CyMATE的一些用户友好特性。
•准备输入序列。Kismeth不需要预对准，参考序列必须与克隆序列分开上传。CyMATE将向量修剪序列的ClustalW对齐作为输入，参考序列始终是第一个序列。
•交互式使用浏览器。Kismeth在浏览器上显示结果并提醒用户出现问题，而CyMATE通过电子邮件发送结果，一些错误，例如错误的数据格式，通过网站显示。
•组织报告和图表。Kismeth以可下载的电子表格兼容文件的形式为各种聚合度量以及原始数据文件提供图形输出，而CyMATE仅提供点图，并将一些表格保留在日志文件中。
•分析个人阅读。Kismeth提供了一个自定义查看器（通过比赛为了研究克隆与参考序列的比对，发现非C/T错配并分别对每次读取的质量进行评分，CyMATE中不存在此类设施。
•底漆设计。Kismeth是为植物设计亚硫酸氢盐底漆的唯一工具。
结论
在动物中，DNA甲基化参与各种发育过程，其失调可导致发育异常和包括癌症在内的疾病[13]. 在植物中，它对亲本印记、胚胎发生的调控、转座子沉默和种子活力至关重要[14]. 检测和测量DNA甲基化已经成为研究这些过程生物学的一个重要组成部分。Kismeth是一种处理亚硫酸氢盐测序数据的便捷工具，亚硫酸氢氢盐测测序是检测DNA甲基化最常用的方法。在所有情况下，还需要研究未甲基化的适当控制，以确保实验中没有系统性偏差。
虽然高通量技术正在开发用于检测DNA甲基化，但其验证在很大程度上仍依赖于传统的亚硫酸氢盐测序[15]. 因此，像Kismeth这样的工具对于DNA甲基化的研究仍然是必不可少的。
方法
我们在这里描述了Kismeth底层的软件以及算法。我们还提供了试点研究中使用的实验方法的详细信息。结果和讨论部分介绍了该工具的使用。
Kismeth算法和软件
Kismeth的中心分析是将亚硫酸氢盐处理的读数与参考序列对齐。这要求允许引用序列中的C与亚硫酸氢盐处理的读取中的T对齐，而不会受到惩罚。如果使用标准BLASTn型比对，那么含有大量非甲基化C的区域将不会与参考序列对齐，因为它们将在亚硫酸氢处理下转化为T。
一种可能性是使用带有自定义评分矩阵的蛋白质比对程序带状的基于史密斯-沃特曼的校准程序，交叉匹配[16]通过修改评分矩阵，使参考序列中的C与处理序列中的T对齐。
顺序读取及其反向补码与参考序列对齐，只有其中一个会正确对齐，除非读取质量较差。分析中不考虑不良比对，无论是匹配长度（长度小于参考序列长度的50%）还是匹配质量（比对中小于80%的正匹配）。这些参数（称为最小长度分数和正匹配的最小分数)可以在Kismeth网站上进行修改。
用于分析的参考序列部分可以使用比赛开始和比赛结束变量。序列末端的采样可能较差，因为末端的读取质量通常低于中间，因此在推断位置依赖性甲基化时必须小心。程序首先识别参考序列上的各种C（CG、CHG和CHH）。cross_match的输出由程序解析，并生成一个报告，其中包含接受的每个对齐、对齐以及对齐中各种C的标识的概要。这是用于生成各种报告和图形的中心报告文件。
第一个报告是对序列中三种类型C的总体分析，它是从中央报告文件编译而来，并显示在结果页面上。这样可以快速评估甲基化C的种类是否存在任何特定的偏差。
一个特殊的显示程序使用中央报告文件生成单个匹配项的可浏览视图。这可以通过比赛结果页面上的链接。使用适当的颜色突出显示各种C，并在顶部列出不匹配的数量，以指示匹配的整体质量。还显示了参考序列上匹配的开始和结束。这样可以访问各个路线。
另一个特殊的显示程序，再次使用中心报告文件，生成一个圆点图点图使用适当颜色的圆圈仅显示参考序列中的C。每行代表一次读取。开放的圆圈用于表示非甲基化的C，而填充的圆圈表示甲基化的C。中央报告文件还用于生成用于图中所示绘图的数据文件。绘图是使用gnuplot（一个开源程序）生成的http://www.gnuplot.info。我们设计了一个程序，可以放大图形来研究在图形的大视图中可能不明显的细节。不同的程序使用相同的文件为每个站点的详细报告生成表格和excel视图。
亚硫酸氢盐底漆设计
熔化温度(百万吨)使用粗略近似计算引物的数量，
哪里N个是底漆的长度。
引物采用亚硫酸氢盐限制设计。该软件最小化了正向底漆中的C和反向底漆中的G，并且不允许正向底漆3'端的五个碱基中有任何C（或反向底漆3'末端的五个碱中有G）。
正向引物按C的数量排序，排名最高的引物是C数量最少的引物。此外，C的数量必须少于三个，并且不能出现在3'端的五个碱基中。如果两个引物具有相同数量的C，则具有较高数量的C百万吨排名较高。对于反向引物，G的数量是有限的，它们的排列方式与正向引物类似。正向引物中的C替换为Y（C/T），反向引物中G替换为R（A/G）。然后从每组中选择一对引物，使其位于用户输入的产品长度范围内。
试剂
关于在Mu1根据制造商的指示使用QIAGEN EpiTech亚硫酸氢钠试剂盒。使用Kismeth设计引物序列；正向读取引物对是AATTTTATGGAATGAAGTAGTTATATG和TTCTCATACARTRRCTTCAATTTT，而对于另一条链，引物对则是ATAYAGTGYTTYAATTTGGTT和RAAAAATATTRAAAATAAAAATATAAT。使用Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒将扩增的序列克隆到载体中。
对于Argonaute-4对DNA甲基化影响的初步研究，根据制造商的说明，使用EZ DNA甲基化金试剂盒对基因组DNA进行亚硫酸氢处理（ZYMO Research）。我们使用了MEA-ISR、JP1026 AAAGTGGTTAGTTTATAAAGGTTTAT和JP1027 CTTAAAAAATTTCAACTCATTTTTTAAAAAA的已发表引物序列[12]. 将PCR产物克隆到pGEM-T easy vector（Promega）中。
控制基因（At2g20610）的引物用于在Mu1研究是GTTGYTGTATATATGAYYGAGATYTT（正向）和TTAATTACAACCATARCARTCARTTTCTC（反向）。
作者的贡献
YQ建议需要一种植物专用工具，并帮助进行初步设计，会前4-1数据、测试和写作。EG建议需要点图，帮助解决了许多问题，大大改进了工具和书写。RKS编辑了手稿，提出了引物设计程序以及对工具的几项改进，此外还对AtMu1型5'TIR英寸ddm1型和WT.RAM帮助完成了手稿，并为亚硫酸氢盐分析工具的开发提供了最初动力。TR设计了网站的几个方面。RS设计了工具，创建了软件并编写了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
致谢
米洛斯·塔努尔季奇、弗拉基米尔·格鲁博、朱利叶斯·布伦内克和罗伯·卢西托以多种方式帮助改进了论文。匿名审稿人帮助改进了工具和论文。
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