美国国家科学院院刊。2008年2月12日；105(6): 2169–2174.
Bcl-x公司L（左）诱导培养海马神经元依赖Drp1的突触形成
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陈应北
†约翰·霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系、分子微生物学和免疫学系，马里兰州巴尔的摩市北沃尔夫街615号，邮编21205；
理查德·桑格
‡生物流研究中心，分子生理学项目，海洋生物实验室，伍兹霍尔，马萨诸塞州02543；
利昂·P·科利斯
‡生物流研究中心，分子生理学项目，海洋生物实验室，伍兹霍尔，马萨诸塞州02543；
汀溪语
†约翰·霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系、分子微生物学和免疫学系，马里兰州巴尔的摩市北沃尔夫街615号，邮编21205；
罗伯特·施瓦岑巴赫
§佛罗里达州奥兰多市佛罗里达州中部大道4000号中佛罗里达大学生物医学科学中心，佛罗里达州32816；
布莱斯·博西
¶萨尔茨堡大学结构生物学系，奥地利萨尔茨堡Billrohstrasse 11，5020；和
埃拉·博西·韦策尔
¶萨尔茨堡大学结构生物学系，奥地利萨尔茨堡Billrohstrasse 11，5020；和
迈克尔·V·L·贝内特
‖纽约州布朗克斯市莫里斯公园大道1300号阿尔伯特·爱因斯坦医学院神经科学系，邮编：10461
马克·皮帕特
††耶鲁大学医学院细胞生物学，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06520；
约翰·希克曼
‡‡法国塞纳河畔克罗西78290 Chemin de Ronde，125 Chemin de Recherches Servier研究所；
彼得·J·S·史密斯
‡生物流研究中心，分子生理学项目，海洋生物实验室，伍兹霍尔，马萨诸塞州02543；
J.玛丽·哈德威克
†约翰·霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系、分子微生物学和免疫学系，马里兰州巴尔的摩市北沃尔夫街615号，邮编21205；
*内科和
††耶鲁大学医学院细胞生物学，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06520；
†约翰·霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系、分子微生物学和免疫学系，马里兰州巴尔的摩市北沃尔夫街615号，邮编21205；
‡生物电流研究中心，分子生理学项目，海洋生物实验室，Woods Hole，MA 02543；
‡‡塞尔维尔研究所，125 Chemin de Ronde，法国塞纳河畔克罗伊西78290；
§佛罗里达州奥兰多市佛罗里达州中部大道4000号中佛罗里达大学生物医学科学中心，佛罗里达州32816；
¶萨尔茨堡大学结构生物学系，奥地利萨尔茨堡Billrohstrasse 11，5020；和
‖纽约州布朗克斯市莫里斯公园大道1300号阿尔伯特·爱因斯坦医学院神经科学系，邮编：10461
作者：Michael V.L.Bennett，2007年12月11日
。作者贡献：Y.C.、E.B.-W.、J.A.H.、P.J.S.S.和E.A.J.设计研究；H.L.、A.F.J.、R.H.S.、L.P.C.、R.F.、E.C.M.、T.Y.、R.S.、B.B.、M.P.和P.J.S.进行了研究；Y.C.、R.S.和E.B.-W.贡献了新的试剂/分析工具；H.L.、A.F.J.、M.V.L.B.、J.M.H.和E.A.J.分析数据；H.L.、M.V.L.B.、J.M.H.和E.A.J.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
神经元突触的成熟被认为与线粒体有关L（左）该蛋白抑制线粒体介导的凋亡，但在健康成年神经元中可能具有其他功能，其中Bcl-xL（左）资源丰富。在这里，我们报告了Bcl-x的过度表达L（左）突触后增加培养的大鼠海马神经元自发微突触电流的频率和幅度。Bcl-x公司L（左）突触前或突触后过度表达，增加突触数量、突触囊泡簇的数量和大小，以及线粒体定位于囊泡簇和突触，这可能是微型突触电流变化的原因。相反，Bcl-x被击倒L（左）或用ABT-737抑制它会降低这些形态学参数。线粒体裂变蛋白，动力相关蛋白1（Drp1），是一种GTPase，已知定位于突触并影响突触功能和结构。Bcl-x的影响L（左）似乎是通过Drp1介导的，因为Drp1的过度表达会增加突触标记，而显性负性dnDrp1-K38A的过度表达则会减少突触标记。此外，Bcl-xL（左）在组织裂解物和重组系统Bcl-x中与Drp1共免疫沉淀L（左）该蛋白刺激Drp1的GTPase活性。这些发现表明Bcl-xL（左）正调控Drp1以刺激突触形成的方式改变线粒体功能。
关键词：Bcl-2，突触传递，线粒体，细胞死亡，ABT-737
在突触发育的初始阶段，含有神经递质的小泡在突触前轴突内聚集成簇(1). 虽然神经递质可以在接触突触后细胞之前释放(2)突触后接触后突触前小泡簇的扩大和稳定是神经递质高保真释放的基础(三——5). 尽管有这样的理解，但突触发育中的许多分子参与者和机制尚不清楚。在这里，我们详细介绍了Bcl-2家族成员Bcl-x对突触形成的影响L（左）我们认为动态蛋白相关蛋白1（Drp1）是Bcl-x的下游效应器L（左）。
抗凋亡和促凋亡Bcl-2家族蛋白调节凋亡期间线粒体外膜的通透性，这是死亡途径扩增的关键控制点(6——8). 抗凋亡成员（如Bcl-xL（左）人们普遍认为，Bcl-2和Mcl-1）通过直接或间接对抗促凋亡家族成员（如Bax和Bak）来防止细胞死亡(9). 此外，许多研究表明，Bcl-2家族蛋白调节未发生凋亡的细胞的活动，特别是可能控制神经元中突触传递的强度(10). Bcl-x的数量L（左）发育中大脑中的蛋白质大约与突触前囊泡簇的大小增加同时增加(11——13). 突触球通常含有线粒体，内源性Bcl-xL（左）已本地化(14). 注射重组Bcl-xL（左）蛋白质进入鱿鱼巨型突触的突触前末端，在几分钟内增强突触传递，并加速破伤风诱导的抑郁症神经传递的恢复(15). 虽然机制尚不清楚，但Bcl-x的作用L（左）乌贼突触的突触增强被认为是线粒体释放ATP增加的结果，这与向突触前末端注射ATP模拟重组Bcl-x的作用的观察结果一致L（左）蛋白质(15，16). 增加ATP可促进突触小泡的循环(17)并加强囊泡“储备库”的开发，以在长时间或高频放电期间保持传播。
突触发育的一个重要方面是突触附近线粒体的定位(17，18). 这一过程部分是通过线粒体分裂蛋白Drp1的活性发生的，该蛋白促进线粒体分裂，生成新的线粒体，插入发育中的突触位点(17，19). 在哺乳动物神经元的树突中，通过转染显性阴性突变体dnDrp1-K38A抑制Drp1抑制线粒体定位于树突棘(19). Drp1是一种大型GTPase，在线粒体生长发育过程中正常分裂所必需(20，21)但它也在促进哺乳动物、苍蝇、蠕虫和酵母的程序性细胞死亡中起作用(22——25). Drp1在线粒体上与Bax共定位，并据报道与Bcl-2家族蛋白相互作用。
通过电生理测量和光学和电子显微镜，我们在这里证明了Bcl-xL（左）培养的海马神经元过度表达会增加线粒体、突触囊泡簇和突触的数量。此外，Bcl-xL（左）增加线粒体和突触囊泡簇的共定位。相反，内源性Bcl-x的耗竭/抑制L（左）使用shRNA或Bcl-x小分子抑制剂治疗L（左）ABT-737减少轴突囊泡簇和线粒体的数量L（左）可能通过线粒体裂变蛋白Drp1发挥作用，增加突触形成。生化研究表明Bcl-x的形成L（左）-Drp1复合物增加了Drp1 GTPase活性，这可能在线粒体定位到成熟突触部位中发挥作用。
结果
Bcl-x的过度表达L（左）增强培养中大鼠海马神经元的突触活性。
为了扩展我们在鱿鱼中的早期发现，我们确定了Bcl-xL（左）影响哺乳动物细胞的突触活动。在第5天转染大鼠海马神经元的低密度培养物在体外（DIV5）与表达Bcl-x的质粒L（左）在N末端标记绿色荧光蛋白（GFP-Bcl-xL（左）)或线粒体GFP控制，其中COX4的线粒体靶向序列与GFP融合。在转染后12天（DIV17），在1μM河豚毒素存在下，以静息电位对具有绿色躯体的神经元进行电压捕获，以阻断动作电位(26)，并记录微型突触后电流(A类). 转染效率较低（1-5%），因此记录的（转染）细胞上的大多数轴突突触可能来自未转染细胞，突触前轴突的作用是转染细胞的逆行作用。在表达GFP-Bcl-x的细胞中L（左）与转染Mito-GFP的对照组相比，兴奋性和抑制性自发事件的振幅均增加，表明Bcl-xL（左）增加每个突触的突触后受体数量，或者可能增加突触前小泡中的递质数量(B类). 突触后Bcl-xL（左）同时也减少了微兴奋性和抑制性突触后电流（mEPSCs和mIPSC）之间的间隔；C类)，表明Bcl-xL（左）导致囊泡融合事件的频率增加，这归因于突触数量的增加（见下文； H（H）和我).
Bcl-x公司L（左）改变神经递质的自发释放。(A类)转染Mito-GFP（对照）或GFP-Bcl-x的大鼠海马神经元（DIV5）自发mEPSCs和mIPSC在−70 mV下的代表性记录L（左）. (B类)所有实验的mEPSC和mIPSC的记录和量化振幅，如A类（第17部分）(n个=GFP-Bcl-x的6个细胞L（左）;n个=8（对于Mito-GFP）。(C类)所有实验事件之间的量化间隔。*，P（P）<0.05，由学生确定t吨测试。
Bcl-x公司L（左）诱导培养海马神经元形成突触。(A类)与Mito-RFP（红色）和GFP-Bcl-x共转染（DIV5）的培养海马神经元轴突（DIV13）的荧光显微镜观察L（左）（绿色）和两个图像的合并。(B类和C类)转染神经元轴突中突触素的免疫荧光显微镜观察。用平均值±SEM表示轴突相对荧光单位（rfu）中puncta的荧光强度及其单位长度（≈35μm）的数目n个=三个独立实验中每组15个神经元。*，P（P）< 0.05; **,P（P）<0.01，学生的t吨测试。(D类和E类)巴松管的免疫荧光显微镜B类和C类. (F类和G公司)PSD-95的免疫荧光显微镜B类和C类. (H（H）和我)转染神经元树突旁突触素点的免疫荧光显微镜观察B类和C类.突触的形成很可能发生在H（H），但树突可能存在于B类，D类、和F类。
Bcl-x公司L（左）过度表达诱导培养神经元突触的形成。
追求Bcl-x的角色L（左）在调节突触活动方面，我们量化了几个突触参数。在转染后7-8天，共转染的GFP-Bcl-x的荧光模式L（左）和Mito-RFP呈点状，轴突几乎完全重叠(A类)和枝晶中[支持信息（SI）图7]，确认Bcl-x的线粒体定位L（左）在胚胎发育和培养成熟过程中，突触前囊泡簇首先可以是可移动的前体或“孤儿”，在形成成熟兴奋性突触之前，与对侧细胞的突触后密度（PSD）无关(4，27). 检查突触前Bcl-x的作用L（左）在形成前体小泡簇或突触时，将GFP-Bcl-x在DIV5处转染海马神经元的平行培养物L（左）或Mito-GFP和免疫染色（DIV13）检测突触前蛋白。在三个独立的实验中，轴突表达GFP-Bcl-xL（左）突触素（突触囊泡膜的一种成分）的免疫荧光染色显著增强(12) ( B类和C类)对于支架蛋白巴松管，也存在于前体囊泡簇和突触前活动区(4) ( D类和E类). 未转染的轴突突触在未转染树突上未显示突触素和巴松管的增加，在表达GFP-Bcl-x的轴突附近L（左）（未显示）。荧光定量为每单位长度轴突的点状物数量和平均荧光强度（参见材料和方法和参考。27). Bcl-x的影响L（左）在转染后2天（DIV7），突触素染色已明显，但在突触成熟后14天和21天培养时更明显(SI图8). 通过该参数，控制似乎达到了较低的稳态水平，没有赶上Bcl-xL（左）-在培养物的生命周期中过度表达细胞。这些数据表明突触前Bcl-xL（左）过度表达会增加囊泡簇和巴松管免疫反应性点刺的数量和大小。
确定突触前Bcl-xL（左）轴突的过度表达诱导邻近未转染（GFP-阴性）细胞树突的突触后成熟，培养物染色以检测PSD-95，PSD-95是兴奋性突触突触后密度的主要蛋白(4). 沿着GFP-Bcl-x的轴突，PSD-95染色的点状突起的数量和荧光强度显著增加L（左）-转染细胞( F类和G公司)表明在相邻未转染细胞的树突中存在成熟的PSD。相比之下，未转染轴突与未转染树突的并置显示出比Bcl-x并置更少的突触素和PSD-95点L（左）-向未转染树突表达轴突（未显示）。GFP-Bcl-x的表达L（左）树突中与未转染轴突接触的突触数量和大小也增加（基于突触素染色）( H（H）和我). 这一差异可能解释了mPSP的频率增加了≈2倍，如我们得出结论，Bcl-x的过度表达L（左）在培养的海马神经元中，轴突或树突中的突触形成显著增加。
内源性Bcl-xL（左）增加突触前囊泡簇的数量和大小。
验证内源性Bcl-xL（左）促进突触形成，过表达的GFP-Bcl-x也是如此L（左）1μM ABT-737是一种小分子抑制剂，旨在通过占据Bcl-x的BH3结合沟来抑制抗凋亡活性L（左）(28，29). 在DIV14时，这些培养物显示突触素染色强度和轴突点状物数量降低，表明内源性Bcl-xL（左）是囊泡簇正常发育所必需的(A类). 此外，即使在5μM的浓度下，ABT-737也没有增强通过碘化丙啶染色测得的细胞死亡，这大大超过了K（K）我≤1 nM(SI图9) (28).
Bcl-x公司L（左）是突触形成所必需的。(A类)免疫荧光显微镜检测未转染海马神经元（DIV14）轴突中突触素，DIV5处添加或不添加1μM ABT-737。数据量化如下C类用于三个独立的实验(n个=每组6个细胞）。*，P（P）< 0.05; ***,P（P）<0.001，学生t吨测试。白点表示轴突的走向。(B类)转染（DIV5）的海马神经元（DIV14）轴突中突触素的免疫荧光显微镜观察bcl-x公司发夹状RNA（pCAG-lacZ-shRNA-Bcl-xL（左）)或控制向量（pCAG-lacZ）。对三个独立实验中的突触体素强度（rfu）和每20μm轴突的突起数量进行了量化（平均值±SEM；n个=每组12个神经元）。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001，学生t吨测试。
尽管Bcl-xL（左）据报道，是成熟神经元和出生后大脑中表达最丰富的Bcl-2家族成员(11)，ABT-737还与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-w结合（但不与抗凋亡蛋白质Mcl-1结合）(29). 验证内源性Bcl-x的具体作用L（左）突触形成中，Bcl-xL（左）通过使用短发夹RNA（shRNA）有效抑制内源性Bcl-x，蛋白质被耗尽L（左）在小鼠IMCD细胞中(SI图10) (30). 海马神经元轴突转染bcl-x公司表达LacZ标记转染细胞的shRNA质粒（1μg），而非对照LacZ质粒，在14天的培养中显著降低了突触素点的染色强度和数量(B类). 枝晶，其中Bcl-xL（左）被击倒的突触素点也显著减少，这归因于这些树突上的突触形成减少(SI图11). 使用Hoechst染色标记细胞核，碘化丙啶标记死细胞，我们证实Bcl-xL（左）敲低不会损害细胞活力（shRNA-Bcl-x为90.9%L（左）对照组92.2%，n个=每组110个细胞）。ABT-737和RNAi结果强烈表明内源性Bcl-xL（左）在培养的海马神经元成熟过程中参与突触形成。
Bcl-x公司L（左）诱导线粒体定位于突触前部位。
形态学研究表明，大约一半突触前终末含有线粒体(31，32). 然而，线粒体是可移动的，可以以活动依赖的方式沿着树突移动并进入树突棘(19). 线粒体向突触募集的机制目前尚不清楚。鉴于其线粒体定位，Bcl-xL（左）线粒体可能在突触前和/或突触后定位到突触中起作用。Bcl-x治疗L（左）抑制剂ABT-737显著减少每单位轴突长度的线粒体数量(A类，中间). 相反，GFP-Bcl-xL（左）过度表达显著增加线粒体数量(底部). 这些数据表明内源性Bcl-xL（左）和Bcl-xL（左）轴突中的过度表达增加了轴突中线粒体的数量(A类)以及上述证据表明突触前Bcl-xL（左）诱导突触形成( F类和G公司)，建议Bcl-xL（左）诱导轴突线粒体靶向突触。
Bcl-x公司L（左）增加单位长度轴突的线粒体数量及其与突触前部位的共定位。(A类)海马培养物中转染轴突的荧光显微镜用MitoTracker Red染色。神经元要么按指示转染，要么用ABT-737处理（两者均用DIV5）。轴突图像旁边的白点显示轴突轨迹。对对照组和ABT-737组每6μm轴突的线粒体线粒体数量（平均值±SEM）进行量化(n个=每组6个神经元）和GFP-Bcl-xL（左）(n个=总共15个神经元的三个独立实验中的每一个都是5）。*，P（P）< 0.05; ***,P（P）< 0.001. (B类)通过仅表达GFP或GFP-Bcl-x的神经元（DIV13）之间的突触密度确定的突触轮廓的代表性电子显微图L（左）数据量化C–E类.V，囊泡；SD，突触密度；M、 线粒体。（比例尺：500 nm。）(C类)包含线粒体的突触轮廓的百分比。(D类)每个突触轮廓的囊泡数量。(E类)如果存在线粒体并且神经元表达GFP-Bclx，则每个突触轮廓的囊泡数量更大L（左）. *,P（P）< 0.05; ***,P（P）< 0.001.
测试Bcl-xL（左）增加线粒体对突触前位点的定位，编码GFP-Bcl-x的慢病毒L（左）或单独使用GFP以≈100%的效率转导神经元（DIV5），并用电子显微镜检查这些固定在DIV13的培养物。GFP-Bcl-x使突触中含有突触前线粒体的节段百分比从<20%增加到≈40%L（左）( B类和C类). 此外，GFP-Bcl-x突触轮廓中存在的小泡数量增加了2倍L（左）-包含轴突(D类)和GFP-Bcl-xL（左）如果突触处有线粒体，对照突触则有更多的囊泡(E类). 我们得出结论Bcl-xL（左）刺激线粒体定位于突触泡并增加囊泡数量，线粒体的存在增加了囊泡簇的大小，这与突触形成和电生理数据的增加一致().
Bcl-x公司L（左）-Drp1促进突触诱发的变化。
Drp1是线粒体分裂所需的一种大型GTPase(20)线粒体靶向新发育的突触线粒体位点(17，19，20). 因此，我们探讨了Bcl-x的作用L（左）轴突线粒体和突触的形成是通过Drp1介导的。绿色荧光蛋白-Bcl-xL（左）与主要阴性抑制剂Drp1，dnDrp1-K38A（HA-标记）共转染(33)海马神经元（DIV5），轴突（DIV13）进行突触素染色和线粒体数量评估( A类和B类和SI图12). dnDrp1-K38A显著降低GFP-Bcl-x的作用L（左）过度表达增加突触素阳性点的强度和数量以及线粒体数量( A类和B类、前三个小节，以及SI图12). dnDrp1-K38A还降低了内源性Bcl-x的作用L（左）根据与Mito-GFP控制的比较（第一和第四小节以及SI图12). 这些结果表明，Drp1作用于内源性Bcl-x的下游L（左）调节突触小泡和线粒体数量。然而，在dnDrp1-K38A的存在下，GFP-Bcl-x的过度表达L（左）相对于内源性Bcl-x增加了这些参数L（左）在Mito-GFP转染的细胞中（bars 3，4）。与Drp1在线粒体分裂中的作用一致，dnDrp1-K38A转染细胞的线粒体更长(SI图12).
Bcl-x的Drp1依赖性功能L（左）突触形成和线粒体定位。(A类)定量免疫荧光强度（rfu，左侧)以及每20μm轴突突触素点的数量（平均值±SEM，赖特)用于三个独立的实验，如(n个=每组共12个神经元）。*，P（P）< 0.05; **,P（P）与Mito-GFP对照组相比<0.01，学生t吨测试。Mito-GFP和GFP-Bcl-x差异的意义L（左）还指示了每个带有dnDrp1-K38A的。(B类)三个独立实验中每6μm轴突的线粒体数量（平均值±SEM；n个=每组10个神经元）。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001，学生t吨测试和比较A类. (C类)定量免疫荧光法检测转染Drp1-HA（DIV5）和/或ABT-737（DIV 5）的海马神经元（DIV13）每20μm轴突的突触素强度（rfu）和突触点数量以及每6μm轴轴突的线粒体数量（平均值±SEM，n个=三个独立实验中每组6个细胞）。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）与对照组相比<0.001。
对这些数据的一种解释是Bcl-xL（左）是Drp1的正调节器。然而，在没有Bcl-x的情况下可能存在一些Drp1活性L（左）（请参见C类). 如果是这样，ABT-737抑制Bcl-x引起的突触效应L（左）可能通过Drp1的过度表达而逆转(A类和C类). Drp1的过度表达确实逆转了ABT-737诱导的突触素标记减少，并增加了高于对照的线粒体数量，这与Drp1下游的作用模式一致(C类).
Bcl-x公司L（左）和Drp1相互作用。(A类) (顶部和中间)用病毒载体（DIV5）转导的海马神经元（DIV13）相互共免疫沉淀实验的免疫印迹(n个= 2). 显示了用于沉淀（IP）和免疫印迹的抗体。(顶部)Drp1与GFP-Bcl-x共沉淀L（左）被GFP抗体击倒。(底部)上述免疫沉淀起始裂解物中的内源性Drp1斑点。(B类)内源性Bcl-x的免疫印迹L（左）和成年大鼠脑内内源性Drp1经免疫沉淀后显示抗体。每个面板显示起始裂解物、控制IgG沉淀物以及用Drp1和Bcl-x探测的指示沉淀物L（左）抗体。(C类)GTPase活性在1小时内与纯化的重组蛋白产生的磷酸盐的相对量。显示了三个独立实验的结果（平均值±SEM）。BSA在背景值以上没有GTPase活性，该信号从其他值中减去。***，P（P）< 0.001. (D类)Bcl-x模型L（左）-诱导突触功能。黑色箭头表示本工作中解决的步骤。
Bcl-x公司L（左）结合Drp1并调节其GTPase活性。
确定Bcl-xL（左）我们对编码GFP-Bcl-x慢病毒转导的海马神经元裂解物进行了共免疫沉淀L（左）或仅GFP。GFP-Bcl-x的免疫沉淀L（左）与抗GFP抗体共沉淀内源性Drp1(A类，顶部). Drp1并非仅从GFP样品中共沉淀。在交互实验中，内源性Drp1共沉淀GFP-Bcl-x的免疫沉淀L（左）但不仅仅是GFP(A类，中间，和未显示的数据），尽管两种裂解物中的Drp1水平相似(A类，底部). 内源性Bcl-x验证了这种相互作用L（左）成年大鼠全脑。抗Drp1抗体共沉淀内源性Bcl-xL（左）来自脑裂解物的蛋白质，相反，抗Bcl-xL（左）抗体共沉淀内源性脑Drp1(B类).
Drp1与线粒体外膜结合，诱导依赖GTP的线粒体分裂。调查Bcl-x的可能性L（左）可以改变Drp1的GTPase活性在体外GTPase分析（参见材料和方法)用纯化的重组全长Bcl-x进行L（左）和全长人类Drp1（氨基酸1-699加上提纯用的His标签）。Bcl-x公司L（左）与对照蛋白BSA相比，本身几乎没有GTPase活性的Drp1 GTPase的活性增加了约60%(C类，前两个栏）。BSA本身对Drp1没有影响（数据未显示）。这些发现表明Bcl-xL（左）导致Drp1的GTPase活性显著增加，但在缺乏Bcl-x的情况下，Drp1具有显著的基础活性L（左）.B分类-xL（左）可能是Drp1的一种新型GTPase激活蛋白。
讨论
我们已经证明内源性和过度表达的Bcl-xL（左）在培养成熟的海马神经元中，诱导突触形成，增加轴突线粒体数量，突触囊泡簇的大小和数量，以及线粒体向突触的募集。此外，dnDrp1-K38A是Drp1的主要负性抑制剂，它大大降低了Bcl-x的作用L（左）突触囊泡簇和线粒体数量，表明Bcl-xL（左）-诱导的突触形成至少部分由Drp1介导。含Bcl-x的内源性复合物L（左）Drp1和Bcl-xL（左）增加Drp1的GTP酶活性在体外因此，Bcl-xL（左）可能通过激活Drp1增加轴突中线粒体的数量，并增加其在突触前区域的定位。这些活动可能是突触成熟的速率限制。
Bcl-x公司L（左）如PSD-95在邻近树突中的诱导所示，突触前轴突的过度表达也影响突触后神经元。Bcl-x公司L（左）树突中的过度表达也增加了接触树突的突触素点的大小和数量，并增加了mEPSCs和mIPSCs的振幅，这与Bcl-x的可能性一致L（左）通过对突触后受体插入的影响增加对递质释放的反应。mPSC的频率也随着突触数量的增加而增加。我们用Bcl-x观察到的突触结构和功能的增强L（左）过度表达可能由突触发育增强或其他形式的突触可塑性机制引起。
死亡因子具有不同于细胞死亡的神经功能。
尽管Drp1对细胞死亡有贡献(22)，我们发现用Drp1转染可以促进突触小泡簇的形成，并可能在不降低细胞活力的情况下促进突触的形成。虽然下调Drp1产生的线粒体分裂减少可以保护细胞免受死亡(34)，上调Drp1也可以抑制细胞凋亡(33)在树突中，它诱导树突棘数量增加(19). Drp1的下调也改变了线粒体对突触的靶向性，并在高速传播期间损害突触功能(17). 我们的数据表明，Drp1可能有助于在发育中的突触中形成囊泡池。一些研究还表明，促死亡和抗死亡Bcl-2家族蛋白除了调节程序性细胞死亡外，还具有其他生理功能(15，35——38).
线粒体靶向可能调节突触的形成和稳定。
最近研究表明，在一段频繁的突触活动后，线粒体可以调节神经递质释放的短期增强(10)并在剧烈运动后影响小泡的补充(17). 线粒体通过微管运输到达远离细胞体的位置(39)并对刺激线粒体向生长因子刺激部位运动的生长因子受体的局部轴突激活作出反应(40，41). 在生长中的神经突起中，线粒体定位可能发生在突触形成过程中，线粒体将处于为未来和正在进行的突触活动提供能量的位置。线粒体生物发生、分裂和随后分布的改变可能在突触功能的代谢支持中发挥关键作用(42，43)和Bcl-xL（左）–Drp1复合体可能将新的线粒体分布到发育中的突触部位。
Bcl-x公司L（左）可能规定突触传输的ATP可用性。
突触活性增加糖酵解和呼吸的速率(44)，可能为递质合成、囊泡制备和再循环中依赖ATP的多个步骤提供能量(45——47). Bcl-x公司L（左）可能通过增加线粒体外膜的通透性或其他机制增加ATP的可用性(15，16). 我们推测线粒体优先定位于活性增强的部位，部分是通过Bcl-x的作用L（左）–Drp1复合物，ATP的产生是形成新突触和维持活动所必需的。此外，沿着轴突的线粒体长度和单位长度的数量可能只是线粒体功能的近似度量，突触传递和突触形成的长期变化可能取决于Bcl-x介导的线粒体生物能量学和蛋白质相互作用的变化L（左）。
材料和方法
此处和中描述以外的详细信息结果在中给出SI材料和方法。
如参考文献所述，制备大鼠海马神经元的低密度培养物。27和48并且含有很少的神经胶质细胞。
在22-25°C下，通过全细胞膜片钳记录静息膜电位（−70 mV）下的自发突触后电流。记录电极包含120 mM葡萄糖酸钾、8 mM氯化钠、0.5 mM EGTA、10 mM Hepes、2 mM MgATP（pH 7.3）和KOH。外溶液[1μM河豚毒素，150 mM NaCl，5 mM KCl，2.5 mM CaCl2、5.5 mM肝酸、4.5 mM肝素-Na和10 mM葡萄糖（pH 7.3），含NaOH，285–300 mosmol−1]在细胞上持续灌注。在这些溶液中，mEPSCs和mIPSP在静息电位下向内。根据参考文献，它们通过mIPSP的较慢衰减时间进行区分，并使用pClamp 9.0（分子器件）在基于计算机的模板上进行分类。26。
通过相位对比识别轴突(SI图13). 轴突比树突长，不分枝，直径较小。如参考文献所述，使用mIPLab软件（Scanalytics）进行图像分析。27减去每个图像的背景荧光。面积高达0.29μm的荧光点2（10像素）的轮廓和测量。对于每个点，软件确定了一个最大包含10个像素（0.29μm）的感兴趣区域2)具有最高荧光强度。总荧光与面积相关（高达0.29μm2)和标记结构的深度(27). 不包括小于5像素的点滴。使用线粒体追踪红（25 nM；分子探针）或编码线粒体靶向荧光肽（Mito-RFP）的质粒转染线粒体图像。在Adobe Photoshop中对转染树突的轴突中的突触素免疫荧光进行分析。免疫荧光强度，in H（H）和我在每个点上画一个预定像素数的小方框，并测量方框内的平均荧光。
请参见SI材料和方法用于免疫标记和免疫印迹的抗体。如参考文献所述，进行蛋白质印迹和免疫沉淀。49。
对于透射电子显微镜，将培养中的病毒转导细胞固定在2.5%戊二醛中，用2%乙酸铀酰（SPI Supplies）染色，在乙醇中脱水，并嵌入Embed 812环氧树脂（EMS）中。用2%醋酸铀酰和1%柠檬酸铅对超薄（60nm）切片进行染色，并在Tecnai 12 Biotwin电子显微镜（FEI公司）中进行检查。
测定Drp1 GTPase活性在体外用重组Bcl-xL（左）和Drp1通过磷酸细胞磷蛋白测定（细胞骨架）。
致谢。
我们感谢R.Fitzsimonds、S.Krueger、A.Kolar和L.K.Kaczmarek的讨论和手稿准备；以及S.Krueger和A.Kolar、P.Casara和T.Le Diguarher提供技术援助。这项工作得到了美国心脏病研究者奖（授予E.A.J.）、美国老龄研究联合会（授予E.A.J.）和美国国立卫生研究院（授予M.V.L.B.）NS037402、NS045876、NCRR P41 RR001395（授予P.J.S.）和NS037402[授予J.M.H.）的支持。
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