表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶域的突变最近被确定为非小细胞肺癌的病因(1–7). 最常见的致癌突变是外显子19中的小的框内缺失和用精氨酸（L858R）替代Leu-858的点突变。这些突变可能通过破坏自抑制构象的稳定性而引起激酶的结构性激活(8,9)通常在没有配体刺激的情况下保持。重要的是，激活突变也被发现对小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）吉非替尼和厄洛替尼具有敏感性(1–三). 正如Carey首次报道的那样等。(10)在厄洛替尼的研究中，突变激酶比WT-EGFR更紧密地结合抑制剂，此外，缺失和L858R突变显著降低了激酶对ATP的亲和力(8,10)抑制剂与之竞争结合。这两种效应结合在一起，产生了吉非替尼和埃洛替尼对肿瘤和对激活的EGFR“上瘾”以生存的细胞株的显著疗效(5,11,12).
临床上，这些TKI的疗效往往持续时间有限，因为出现了第二种突变产生的耐药性：用蛋氨酸（T790M）替代苏氨酸790(13–15). T790M突变约占对吉非替尼和埃洛替尼所有耐药性的一半(16,17). 苏氨酸790是EGFR中的守门人残基，之所以这么命名是因为它的关键位置位于ATP结合间隙后部疏水囊的入口，这使得它成为蛋白激酶抑制剂特异性的重要决定因素。用大量蛋氨酸取代EGFR中的这种残基被认为通过对包括吉非替尼和埃洛替尼在内的TKIs结合的空间位阻而引起耐药性(13–15). 然而，T790M突变激酶对不可逆抑制剂仍然敏感，包括CL-387785、EKB-569和HKI-272(14,15,18–20). 这些化合物与可逆苯胺喹唑啉抑制剂非常相似，但含有一个反应性Michael受体基团，该基团在ATP结合间隙边缘与Cys-797形成共价键(). 不可逆抑制剂设计仅针对EGFR中的半胱氨酸，因为它们在ATP结合囊中的特定非共价相互作用类似于可逆苯胺喹唑啉化合物。因此，这些不可逆的TKI仍然抑制T790M突变体的事实与作为抵抗机制的空间位阻相矛盾：可逆抑制剂吉非替尼和不可逆抑制剂EKB-569具有相同的苯胺取代基，预计它们将结合在门卫口袋中()因此，阻断吉非替尼结合的相同立体效应也应阻止EKB-569（以及相关化合物HKI-272）的初始结合。
选定EGFR抑制剂的化学结构。所有化合物都以一致的方向和构象绘制，这反映了它们在EGFR激酶中的近似结合模式。HKI-272和EKB-569是不可逆抑制剂的例子。拉帕替尼和HKI-272被认为需要EGFR的非活性构象来结合，因为它们有额外的苯胺取代。
大量观察表明，除了产生耐药性外，守门人突变还可能降低EGFR和其他激酶的催化活性。在一个具有肺癌遗传倾向的家族中发现了一种种系T790M突变，这表明这种突变在没有TKI选择压力的情况下具有生长优势(21). 与这个想法一致，在NIH 3T3细胞中引入T790M和L858R突变体可增加EGFR活性并增强转化表型(22). 经肺特异性表达T790M突变体的转基因小鼠发展为肺腺癌(23)尽管与携带L858R或L858R+T790M突变的人相比，潜伏期更长(23,24). 在一例未经治疗的巴雷特食管和相应的腺癌中也发现了EGFR T790M突变(25). 有趣的是，BCR-Abl（T315I）的相应突变在慢性粒细胞白血病的治疗中产生了对伊马替尼和其他TKI的耐药性，并且也发现在未经治疗的CML中预先存在(26,27). 在v-Src（T338I）中发现了等效突变，长期以来人们都知道它能赋予c-Src转化活性(28). 尽管长期以来人们对酪氨酸激酶活性控制中的关键残基感兴趣，但对其作用的结构了解还不够。为了更好地理解其在抑制剂耐药性和激酶失调中的作用，我们研究了T790M突变在WT和L858R突变EGFR激酶中的结构和酶学效应。
结果
T790M突变体以低纳米摩尔亲和力结合吉非替尼。
我们首先通过直接结合试验测定了吉非替尼与WT、L858R、T790M和L858R/T790M突变体的结合，其中EGFR的固有荧光通过抑制剂滴定猝灭(8). 引人注目的是，T790M突变仅轻微影响L858R突变背景下吉非替尼的结合(). 抗药性L858R/T790M双结合吉非替尼K（K）d日=10.9 nM，仅比敏感的L858R突变体弱约4倍(K（K）d日=2.4 nM）。T790M突变体将吉非替尼与K（K）d日=4.6 nM，几乎与L858R突变体一样紧密，比WT激酶紧密得多。引入二级T790M突变导致吉非替尼亲和力的微小差异与携带L858R的细胞系与携带L85 8R/T790M或T790M突变的外显子19缺失的细胞系在敏感性上观察到的大约两个数量级差异形成鲜明对比(13–15,29)因此不能解释临床观察到的耐药性。我们还检查了吡咯嘧啶化合物AEE788（诺华制药）的结合，尽管化学支架不同，但其结合方式与吉非替尼类似(8). T790M突变体对AEE788的亲和力有更显著的影响，但值得注意的是，L858R/T790M双突变体对该化合物的亲和力保持18.6 nM（与之相比K（K）d日=1.1 nM（对于L858R突变体）。与吉非替尼相比，对AEE788的影响更大，这并不意外，因为该抑制剂上的苯乙胺取代基进一步延伸到被门卫残基“保护”的疏水囊中(8).
表1。
| 激酶 | K（K）d日，毫微克
| K（K）d日/K（K）米[ATP], ×10−3
|
|---|
| 吉非替尼 | AEE788型 | 吉非替尼 | AEE788型 |
|---|
| 重量 | 35.3 ± 0.4 | 5.3 ± 0.3 | 6.8 | 1 |
| T790米 | 4.6 ± 0.1 | 27.6 ± 0.7 | 0.78 | 4.7 |
| L858R型 | 2.4 ± 0.1 | 1.1 ± 0.1 | 0.016 | 0.0074 |
| L858R/T790M型 | 10.9 ± 0.6 | 18.6 ± 0.5 | 1.3 | 2.2 |
T790M突变体的晶体结构。
T790M突变体的晶体结构表明，在激酶的活性构象和非活性构象中，抑制剂是如何在看门人突变的存在下被调节的。我们测定了T790M突变体的结构，以及与不可逆抑制剂HKI-272在非活性构象或与AEE788在活性构象中的复合物的结构[参见支持信息（SI）表3晶体统计]。T790M突变体与AEE788复合物的结构如A类该化合物以WT酶中观察到的基本相同的方式结合，吡咯嘧啶核与激酶的铰链区域和苯乙胺取代基延伸到门控疏水囊中形成两个氢键。与AEE788与WT酶的结合相比较，发现苯乙胺取代基仅发生轻微的旋转，该取代基与突变的门卫残基直接接触。将AEE788复合物与无抑制剂（Apo-T790M）的T790M突变体结构进行比较，结果表明Met-790侧链必须采用不同的旋转体来容纳抑制剂(B类).
EGFR T790M突变体的晶体结构表明，抑制剂很容易适应激酶的活性和非活性构象。(A类)EGFR T790M/AEE788复合体（黄色）和WT/AEE788复合物的叠加[浅蓝色；取自PDB ID代码2J6M型(8)]. 虚线表示两种复合物中保存的激酶铰链区域的氢键。指出了T790M突变的位置。(B类)EGFR T790M/AEE788复合物（黄色）和apo-T790M结构（绿色）的叠加。注意Met-790在抑制剂存在下的交替侧链构象。(C类)HKI-272与T790M突变体复合体的晶体结构。激酶采用非活性构象，C-螺旋移位。Cys-797与HKI-272的巴豆酰胺Michael受体之间形成共价键。(D类)与HKI-272复合物中的T790M突变体的结构（黄色）叠加在与拉帕替尼复合物中WT EGFR激酶的结构上[浅蓝色；取自PDB ID代码1个XKK(32)]. 在这两种结构中，激酶采用相同的非活性构象，抑制剂以类似的方式结合，与铰链（虚线）形成单一氢键，苯胺取代基延伸到非活性构像的扩大疏水囊中。
不可逆抑制剂HKI-272是一种4-（芳胺基）喹啉-3-碳腈化合物，是EGFR和ErbB2激酶的有效抑制剂(14,30). 在与HKI-272的复合物中，EGFR激酶采用非活性构象，其中调控C螺旋从其活性位置移位(C类). C螺旋向外旋转产生的增大的疏水囊似乎需要容纳HKI-272中发现的笨重苯胺取代基。HKI-272和拉帕替尼都含有附加在苯胺环上的额外芳香基团（HKI-271中的2-吡啶基和拉帕替尼中的氟苯基；). 因此，与拉帕替尼一样，HKI-272与激酶的非活性构象结合，并且这两种化合物的整体结合模式相似，这并不奇怪(D类). HKI-272的喹啉核以类似于苯胺喹啉化合物的方式与激酶的铰链区域形成单一氢键(31,32). HKI-272的2-吡啶基被膨胀囊中的疏水残基包围，包括C-螺旋中的Met-766、Phe-856和Met-790，即突变体门卫残基。HKI-272的腈取代基也接近门卫残基（从蛋氨酸侧链延伸至≈3Å）。除了HKI-272的这些非共价相互作用外，活性位点裂缝边缘的Cys-797和抑制剂上的巴豆酰胺-迈克尔受体基团之间形成了预期的共价键，使得结合不可逆(C类). 虽然结构的分辨率适中，但抑制剂和共价键的电子密度很清楚(SI图4).
T790M突变体的结构也表明了催化活化的可能机制。我们假设，突变通过与激酶激活环底部的天冬氨酸-β-甘氨酸序列（DFG基序）直接相互作用，促进了非活性构象和活性构象之间的相互转换（参见SI图5和6以及中的相关讨论SI文本). 突变还可能增强活性构象（相对于非活性构象）的稳定性，因为它在活性状态下与Met-766和Leu-777进行有利的疏水相互作用。
L858R/T790M突变株ATP亲和力的增加提示耐药。
结合数据和晶体结构清楚地表明，门卫突变并没有立体阻止可逆抑制剂的结合。为什么T790M突变会产生耐药性？WT和突变EGFR激酶的动力学特征表明迈克尔利斯·门顿常数显著降低(K（K）米)与药物敏感的L858R突变体相比，抗药性L858R/T790M突变体中的ATP(). 如前所述(8,10)L858R突变体激活EGFR，但也降低了对ATP的表观亲和力(). 引人注目的是，T790M突变将L858R/T790M双突变体中的ATP亲和力恢复到接近WT水平(K（K）米[ATP]=8.4μM，与之相比K（K）米[ATP]=148μM（对于L858R突变体）。单独来看，T790M突变并不显著影响ATP亲和力。我们无法从结构上解释为什么T790M突变在L858R突变的情况下增加了ATP亲和力，但在WT酶的情况下没有。
表2。
| 激酶 | K（K）米[ATP]，微米 | k个猫，秒−1 | k个猫/K（K）米[ATP]，微米−1·秒−1 |
|---|
| 重量 | 5.2 ± 0.2 | 0.026 | 5.00E-3号机组 |
| T790米 | 5.9 ± 0.1 | 0.137 | 2.32E-2型 |
| L858R型 | 148 ± 4 | 1.484 | 1.00E-2型 |
| L858R/T790M型 | 8.4 ± 0.3 | 0.456 | 5.43E-2号机组 |
我们还发现，与WT酶相比，T790M突变激活激酶≈5倍(); 这种T790M突变体的催化激活可能解释了其在易患肺癌的家族中作为种系突变的存在(21). 虽然L858R/T790M突变体有轻微的降低k个猫相对于L858R突变体，它仍然比WT酶活性高出5倍k个猫/K（K）米[ATP]比L858R突变体().
由于吉非替尼等TKI必须与ATP竞争结合到激酶活性位点，因此增强的ATP亲和力预计会降低明显的抑制剂效力。在L858R/T790M突变体中，“K（K）米这种效应”结合了吉非替尼结合亲和力的微小差异，显著降低了细胞内ATP浓度下的抑制剂敏感性。吉非替尼的预期效力（计算K（K）我应用程序)绘制为L858R和L858R/T790M突变体ATP浓度的函数A类L858R突变体在细胞ATP浓度（≈1 mM）下对吉非替尼保持低纳米级敏感性，而L858R/T790M突变体则没有。L858R/T790M突变体中抑制剂敏感性的预测损失通过直接在体外吉非替尼在10μM和1 mM ATP浓度下对酶抑制的测量。L858R/T790M突变体在10μM ATP浓度下对吉非替尼敏感，但在1 mM浓度下耐药，而L858R突变体即使在较高浓度下也能有效抑制，接近细胞ATP水平( B类和C类). 我们在使用polyE的其他分析中也观察到了这种效果4Y或信号适配器Shc作为EGFR基板，且存在Mn2+或镁2+（未显示数据）。我们得出的结论是，临床观察到的L858R/T790M突变株的耐药性主要源于其对ATP的亲和力增强（与抑制剂敏感型L858R突变株相比），而不是先前假设的抑制剂结合的空间阻滞。
T790M二次突变的耐药性仅在细胞内ATP浓度下表现出来。(A类)计算的K（K）我应用程序对于L858R单突变体和L858R/T790M双突变体，使用实验测量值绘制了它们与ATP浓度的关系图K（K）米[ATP]()和设置K（K）我=K（K）d日按测量值(). 注意，当ATP浓度接近细胞水平（≈1 mM）时，双突变体（实线）的预期效力损失。(B类)在10μM（黑色方块）或1.0 mM ATP（红色圆圈）存在下，吉非替尼抑制L858R突变EGFR激酶。(C类)在10μM（黑色方块）或1.0 mM ATP（红色圆圈）存在下，吉非替尼抑制L858R/T790M双突变体EGFR。在B类和C类，的在体外使用EGFR Tyr-1173自磷酸化位点肽（ENAEYLRVA）作为底物，在吉非替尼指示浓度的存在下测量指示EGFR突变体的激酶活性。
讨论
目前的工作强调了EGFR突变体的ATP亲和力受损使其易受抑制的程度（至少是迄今为止研究的L858R、G719S和外显子19缺失）(8,10). T790M突变只是将ATP亲和力恢复到WT激酶的水平。实际上，致癌突变体的ATP亲和力降低打开了一个“治疗窗口”，使其相对于WT-EGFR和抑制剂可能具有活性的其他激酶更容易受到抑制。T790M二级突变通过将ATP亲和力恢复到WT水平，有效地关闭了该窗口。
如伊马替尼治疗前对Src的影响及其在慢性粒细胞白血病中的存在所示，门卫突变的激活性质并非EGFR独有。这个K（K）米效果可能更特殊；注意，T790M突变对K（K）米在WT EGFR激酶的背景下(). 对于Abl T315I突变体，我们测量K（K）米[ATP]=1.8μM，与之相比K（K）米[ATP]=6μM的WT Abl激酶（数据未显示），ATP亲和力的这种变化预计对抑制剂的效力只有适度的影响。此外，很明显，BCR-Abl中的T315I门卫突变直接阻断伊马替尼和其他具有类似结合模式的化合物的结合。
我们的发现解释了令人困惑的观察结果，即不可逆的苯胺基喹唑啉抑制剂（以及密切相关的不可逆化合物，此外，它们对于了解耐药性的性质以及开发更有效药物的可能途径也很重要。事实上，T790M替代物通过增加对ATP的亲和力而不是通过简单的空间干扰抑制剂结合来赋予抗性，这意味着T790M是一种“通用”抗性突变体；它往往会对任何ATP竞争性抑制剂产生耐药性。据我们所知，这种耐药机制，即由增加对竞争性生理底物亲和力的突变所赋予的耐药性，以前尚未在临床环境中得到记录。有趣的是，最近在有丝分裂驱动蛋白KSP（也称为Eg5）的突变中描述了一种独特但相关的效应。KSP突变体是在实验室筛选中发现的，通过增强ATP亲和力的变构机制产生耐药性(33).
作为一类，不可逆抑制剂可以通过共价结合克服T790M电阻；一旦共价结合，它们就不再与ATP处于竞争性的可逆平衡。许多此类化合物目前正在肿瘤临床试验中，包括HKI-272，但尚未获得批准。共价抑制剂的一个问题是，其潜在的毒性是由非靶向效应引起的。除EGFR外，至少有10种激酶在EGFR中具有与Cys-797相当的活性半胱氨酸残基，因此了解可用的不可逆试剂对这些激酶的活性尤其重要，其中包括Tec家族激酶、JAK3、，以及其他对造血发育和免疫功能重要的激酶。然而，我们的结果表明，有效抑制T790M突变并不需要不可逆结合。一种具有足够亲和力的可逆抑制剂也应该发挥作用，以战胜ATP。与中所示类似的计算A类表明对T790M突变体亲和力≈200 pM或更紧密的可逆抑制剂应有效。
方法
蛋白质制备和结晶。
使用所述杆状病毒/昆虫细胞系统表达和纯化跨越人类EGFR残基696-1022并带有WT序列或T790M和L858R突变的结构(8). T790M突变体的晶体是在0.1 M Hepes（pH 7.5）、21%PEG6000、0.3 M NaCl和5 mM三（2-羧乙基）膦（TCEP）中获得的，而T790M/HKI-272复合晶体是通过在0.1 M Hepes（pH7.0）、0.2 M Li中共结晶获得的2SO公司428%PEG3350和5 mM TCEP。通过将apo-T790M晶体浸泡在300μM AEE788抑制剂中过夜，制备出T790M/AEE888复合晶体。
结构确定和改进。
衍射数据在阿尔贡国家实验室（伊利诺伊州阿尔贡）APS ID24或ID19光束线100 K下收集。数据用HKL2000进行处理(34). 用PHASER分子替换法求解结构(35)，使用EGFR 696-1022 G719S结构[蛋白质数据库（PDB）ID代码2万亿] (8)用于apo-T790M和T790M/AEE788结构以及EGFR 696-1022 V948R结构（PDB代码2克7) (9)用于T790M/HKI-272结构。CNS/模拟退火(36)然后用于获得偏差较小的2F类o（o）−F类c（c）和F类o（o）−F类c（c）用于手动检查和调整模型的地图。使用COOT进行了多次手动改装和晶体细化(37)和refmac5(38). 抑制剂被建模为紧密拟合的阳性F类o（o）−F类c（c）电子密度，然后包括在以下细化和拟合循环中。使用PRODRG生成抑制剂的拓扑和参数文件(39).
酶动力学分析、抑制分析和数据分析。
如前所述，使用96-well格式的ATP/NADH偶联分析系统，一式三份测定EGFR动力学参数(8). 反应混合物含有0.5 mg/ml BSA和2 mM MnCl2，1 mM磷酸（烯醇）丙酮酸（PEP；Sigma-Aldrich；目录号P7002），1 mM TCEP，0.1 M MOPS 7.5，5 mM聚-Glu4提尔1]肽（Sigma-Aldrich；目录号P7244）、来自兔子肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶最终反应混合物体积的1/50（Sigma Aldrich，目录号P-0294）、0.5 mM NADH和0.5μM EGFR激酶；最后加入不同浓度的ATP开始反应。稳定初始速度数据是从A的斜率中得出的340曲线并拟合到Michaelis-Menten方程以确定V（V）米和K（K）米值。为了确保我们的k个猫参数反映了活性酶的浓度，我们通过用紧密结合抑制剂吉非替尼或AEE788滴定样品来估算每个激酶制剂的活性酶浓度（见下文）。
使用相同的动力学分析方法，使用10 mM MgCl进行抑制分析2和1.25 mM EGFR自磷酸化位点肽（ENAEYLRVA）作为磷酸受体底物。ATP浓度固定为10μM或1 mM，并且在添加ATP之前添加指示的抑制剂浓度。
结合常数的测定和计算K（K）我应用程序价值观。
采用平衡荧光猝灭法获得结合常数并估算活性酶浓度(8). 在含20 mM Tris、0.5%甘油、250 mM NaCl和1 mM TCEP的含氮缓冲液中进行荧光测量。获得的K（K）d日值和K（K）m、 列车自动防护系统用于计算K（K）我应用程序值使用以下公式(40):
假设K（K）d日结合分析中获得的值等于K（K）我在上述动力学分析的条件下。
