暂时或永久限制脑血流量和供氧会导致脑缺血和缺血性中风，这是发达国家的第三大死亡原因，也是最常见的长期残疾原因。溶栓治疗（如重组组织纤溶酶原激活剂）实现早期动脉再通是目前治疗缺血性卒中的唯一选择。但这种治疗的时间依赖性效应（事件发生后3小时内）限制了其临床应用于只有5%的候选患者(1)它增加了颅内出血、再灌注损伤和脑动脉反应性降低的风险(2–5). 脑缺血后的神经死亡和损伤涉及与坏死和延迟凋亡相关的病理变化(6,7). 局灶性、重度卒中梗死核心区的神经元会立即被清除，一旦出现缺血就无法保存。然而，缺血半暗带（即局灶性缺血性中风时围绕核心的脑组织）和全脑缺血时的敏感神经元/网络仍由血供减少维持。脑缺血/中风后，这些缺血脑组织的进一步损伤会延迟发生(8–10)导致临床恶化。因此，延长时间窗口的有效术后治疗仍然是现代医学实践面临的最大挑战之一。
人类和其他哺乳动物脑缺血/缺氧的一贯后果是中枢神经系统功能障碍，其性质取决于损伤的位置和程度。众所周知，全脑缺血/缺氧选择性地损伤或损害背海马CA1区的锥体神经元(11–14)对情景记忆至关重要，为监测缺血损伤和功能恢复提供了一种灵敏的手段。实验性脑缺血通常通过局部诱导，例如大脑中动脉闭塞，或通过永久性闭塞两条动脉（四血管闭塞模型中的双侧椎动脉或颈动脉）整体诱导与其他两条动脉（双侧颈动脉）闭塞、低血压或缺氧的控制期相关(6,15). 在年轻成年动物中，联合程序对于诱导缺血性病理生理后果至关重要(6,16–19).
利用共焦显微镜和电子显微镜，最近发现强效PKC激活剂bryostatin可以精确地增强海马突触中那些对大鼠空间迷宫学习和记忆有特异性影响的结构和超微结构变化(20). 基于该研究和其他研究(21–24)以及之前观察到的CA1海马神经元缺血/低氧损伤(14)我们研究了苔藓抑制素也可能减少或预防缺血后大脑中上述神经元和突触损伤的可能性。
结果
全脑缺血/缺氧损害空间学习和记忆。
永久闭塞双侧颈总动脉引起的全脑缺血/缺氧，再加上手术完全恢复后的短暂缺氧，导致空间学习（缺血与假手术：F类1,127= 79.751,P（P）< 0.001;A类)和记忆（缺血与非手术：F类1,15= 9.451,P（P）< 0.01; B–F类)幼年成年Wistar大鼠。这种全球脑缺血/缺氧模型与涉及氧气和血流量限制的临床情况特别相关，如心脏骤停、冠状动脉搭桥手术和神经血管手术。
慢性苔藓抑制素-1可以挽救大鼠的空间学习和记忆能力，但不影响它们的感觉运动能力。(A类)训练试验期间的逃避潜伏期（平均值±平均值的标准误差）。(B–E类)训练试验后的记忆保持测试结果。象限4是在训练试验期间放置隐藏平台的目标象限。(F类)目标象限比（通过将目标象限游泳距离除以非目标象限中的平均游泳距离计算）。(G公司)可见平台测试结果（在新位置放置可见平台）。Bry，bryostatin-1；缺血，脑缺血；NS，不显著；*，P（P）< 0.05.
Bryostatin-1激活PKC。
而不是干预已经发生在缺血大脑中的病理过程(25,26)，我们使用了bryostatin-1(21,27)，一种具有抗肿瘤药理学特征的强效PKC激活剂，试图从药理学角度促进神经修复活性和突触发生。Bryostatin-1，在外周给药时跨越血脑屏障(28)产生PKCε同工酶的相对选择性激活，这是一种神经保护(29–31)并且在bryostatin-1的易位（从而激活）中的中位有效剂量低于PKCδ，而PKCδ最有可能参与缺血再灌注期间的缺血性损伤(32–34). 我们最近发现，用苔藓抑制素-1激活PKC正好增强了与大鼠迷宫学习和记忆有关的突触发生、突触前/突触后超微结构特化和蛋白质合成功能(20,35). PKC激活至少有两种可能与PKC信号处理相关的作用：在低浓度下激活PKC同工酶和保护活性的膜结合PKC免受应激降解。在培养的大鼠海马IGF1R细胞中，0.2 nM的苔藓抑制素-1激活PKC，在30分钟时达到最大效应（约为两倍）(A类). 浓度越高，活化时间越短。此外，在细胞应激、营养物质和生长因子的损失（与血清剥夺相似）下，培养的大鼠海马IGF/IR细胞中PKC同工酶水平显著降低(B类). 到96小时，PKCα、PKCδ和PKCε的膜水平几乎检测不到，但其他蛋白质的水平没有变化，包括ERK1/2、GSK-3β和TACE，以及总蛋白（未显示）。Bryostatin-1对血清剥夺诱导的活性、膜结合PKC同工酶的下调具有优先保护作用。膜蛋白激酶Cα、蛋白激酶Cδ和蛋白激酶Cε水平分别比相应的对照水平高400%、350%和250%( C–E类). 相反，苔藓抑制素-1对胞浆PKC没有保护作用（未显示）。
在培养的大鼠海马IGF/IR细胞中，Bryostatin-1激活PKC同工酶并保护膜相关PKC同功酶免受血清剥夺诱导的下调。(A类)苔藓抑制素-1对PKC活性影响的时间进程。(B类)血清剥夺对膜相关PKC水平影响的时间进程。(C–E类)血清剥夺条件下苔藓抑制素-1对膜相关PKC水平的影响。PKC通过Western blot分析测定，并绘制为每个时间点的对照值百分比。
Bryostatin-1拯救全脑缺血/缺氧后的空间学习和记忆。
缺血后慢性苔藓抑制素-1治疗（为期5周的治疗，在缺血/缺氧事件发生24小时后首次给药）有效地恢复了大鼠的空间学习和记忆能力。总体而言，两组之间存在显著差异(F类3255个= 31.856;P（P）< 0.001;)和x组试验(F类21,255= 1.648;P（P）< 0.05). 用苔藓抑制素-1（bryostatin-1+缺血vs.缺血：F类1,127= 50.233;P（P）<0.001），而bryostatin-1单独并不影响学习（bryostatin-1 vs.sham-operated：F类1,127= 2.258;P（P）>0.05）在最后一次服用bryostatin-1后2周测量学习能力。因此，所观察到的学习指数能力差异没有受到苔藓抑制素-1对学习的任何直接作用的影响。在记忆保留测试中，假手术大鼠表现出目标象限偏好，但缺血大鼠没有表现出任何可测量的记忆保留。Bryostatin-1治疗有效地将脑缺血后的记忆保留恢复到假手术大鼠的水平，但与假手术对照大鼠相比，它对目标象限偏好没有显著影响。目标象限比率存在显著差异(F类3,31= 6.181;P（P）< 0.005;F类)小组之间。记忆保持测试的详细分析进一步揭示了缺血大鼠与使用苔藓抑制素-1治疗的缺血大鼠之间的显著差异(F类1,15= 10.328;P（P）<0.01），但在用bryostatin-1治疗的缺血大鼠和假手术对照大鼠之间没有显著差异(F类1,15= 0.0131;P（P）>0.05）或在假手术对照大鼠和单独使用bryostatin-1的大鼠之间(F类1,15= 0.161;P（P）> 0.05).
在单独的大鼠组中，通过尾静脉联合给药PKC同工酶抑制剂Ro-31–8220[0.5 mg/kg(22)]显著减弱了bryostatin-1对学习缺血性损伤的功能恢复作用（缺血+bryostatin-1 vs.缺血+Ro-31–8220+bryostain-1：F类1,127= 9.429;P（P）<0.005）和记忆（缺血+bryostatin-1 vs.缺血+Ro-31–8220+bryostain-1：F类1,15= 4.923;P（P）< 0.05; 未显示），表明参与PKC激活。仅Ro-31–8220对缺血性学习障碍无影响(F类1,127= 0.282;P（P）>0.05）无缺血性记忆损伤(F类1,15=0.0162；P（P）>0.05）。因此，Ro-31-8220治疗对全脑缺血损伤后的空间学习记忆没有功能恢复作用，但显著减弱了苔藓抑制素-1对学习记忆的影响。
脑缺血和Bryostatin-1不会改变大鼠的感觉运动能力。
在探针测试结束时，在可见平台测试中测试大鼠的感觉运动能力和动机差异。该测试包括对每只大鼠进行一次试验，以确定是否存在任何可能影响大鼠空间学习和记忆任务表现的视觉和运动障碍以及动机差异。感觉运动能力和动机不受缺血程序和苔藓抑制素-1治疗的影响(F类6,55= 0.218;P（P）> 0.05;G公司)在可见平台测试中。
Bryostatin-1增强脑缺血后的神经营养活性和神经存活。
脑缺血/缺氧事件在背海马CA1区产生了显著的神经和突触损伤，慢性给予苔藓抑制素-1可以挽救这种损伤。首先，脑缺血降低了海马CA1区存活的锥体细胞数量。缺血和非手术对照大鼠存活细胞的数量有显著差异(F类1,11= 28.938;P（P）<0.001）和用苔藓抑制素-1治疗缺血和缺血之间(F类1,11个= 11.491;P（P）< 0.001;A类). 另一方面，与对照组相比，苔藓抑制素-1单独对海马CA1中存活细胞的数量没有显著影响(F类1,11= 0.797.P（P）> 0.05).
慢性苔藓抑制素-1可使背海马CA1区的锥体细胞、神经营养活性和突触强度免受脑缺血诱导的损伤（最后一次苔藓他汀-1剂量5周治疗后9天，脑缺血/缺氧事件后约7周）。(A类)脑缺血和苔藓抑制素-1治疗对背海马CA1区存活细胞数量的影响。(B类)海马CA1区锥体层BDNF免疫组织化学扫描共聚焦显微镜（绿色）。神经核用4′，6-二氨基-2-苯基林德尔（红色）复染。脑缺血：n个=3只大鼠，n个=84个细胞体，n个=30个枝晶区域。控制：n个=3只大鼠，n个=123个细胞体，n个=30个枝晶区域。缺血+苔藓抑制素-1：n个=3只大鼠，n个=99个细胞体，n个=30个枝晶区域。Bryostatin-1单独使用：n个=3只大鼠，n个=117个细胞体，n个=30个枝晶区域。(C类)海马CA1区放射层扫描共聚焦显微镜，用树突状棘标记物嗜棘蛋白和突触前囊泡膜标记物突触素进行研究。缺血性：n个=3只大鼠，n个=28随机CA1面积。假操作：n个=5只大鼠，n个=50 CA1面积。缺血+苔藓抑制素-1：n个=3只大鼠，n个=30 CA1面积。单用Bryostain-1：n个=3只大鼠，n个=30个CA1图像。(D类)海马CA1区放射层不同形状树突棘的变化，用Dil染色研究，并用共聚焦显微镜成像（M，蘑菇棘；S，粗棘；T，细棘；F，丝状足）。缺血：n个=3只大鼠，n个=16枝晶。假操作：n个=3只大鼠，n个=28个枝晶。缺血+苔藓抑制素-1：n个=3只大鼠，n个=28个枝晶。(E类)海马CA1区放射层轴棘突触的变化。左侧电子显微照片显示蘑菇（M）、短刺（S）和细刺（T）的超微结构，它们从树突轴（D）分支。这些树突棘的头部与包含突触前小泡的突触前轴突泡（A）形成突触（白色箭头）。右电子显微照片显示了使用和不使用苔藓抑制素-1的脑缺血中树突棘的密度（黄色高亮）。底部面板显示了观察到的不同类型的突触和总数量的量化。脑缺血：n个=3只大鼠，n个=62个随机CA1面积。假操作：n个=3只大鼠，n个=62 CA1区。缺血+苔藓蛋白-1：n个=3只大鼠，n个=61 CA1面积。仅Bryostatin-1：n个=3只大鼠，n个=48 CA1面积。Bry，bryostatin-1；缺血，脑缺血。
其次，苔藓抑制素-1显著增强了背海马CA1区脑源性神经营养因子（BDNF）的活性，这一反应与先前的观察一致，即大脑中BDNF活性升高可保护神经元免受缺血损伤(36,37). 实验组海马CA1区锥体神经元的BDNF荧光强度在细胞体方面总体上存在显著差异(F类5,624= 39.738;P（P）<0.001）和枝晶(F类5,179= 9.490;P（P）< 0.001;B类). 与对照组大鼠相比，脑缺血使细胞体和树突中的BDNF水平升高。在缺血大鼠中，Bryostatin-1治疗进一步增强了BDNF活性（Bryostatin-1+缺血vs.缺血：P（P）细胞体和P（P）枝晶<0.05；B类). 与对照组大鼠相比，单独使用Bryostatin-1也增加了BDNF活性。
Bryostatin-1预防脑缺血后突触丢失并诱导突触发生。
Bryostatin-1挽救了缺血诱导的树突棘和突触前小泡减少。在缺血动物中，（突触后）树突棘的数量（用树突棘标记物嗜酸性粒细胞测定）与假手术对照大鼠相比显著减少(C类). 用苔藓抑制素-1治疗和缺血的动物的树突棘数量显著高于未经苔藓他汀-1治疗的脑缺血大鼠和假手术对照大鼠(P（P）< 0.001). 与对照组大鼠相比，单用Bryostain-1也增加了树突棘的数量。与树突棘相比，突触前轴突束的数量（由突触素颗粒的数量测定）稳定，不受全脑缺血和/或慢性苔藓抑制素-1的影响(C类). 然而，轴突泡中突触前小泡的数量（以突触素强度为指标）的变化与树突棘的变化相同。
Bryostatin-1挽救了脑缺血诱导的蘑菇棘形成的丢失。缺血动物的蘑菇和短粗棘的数量明显低于混乱对照动物(D类). 慢性苔藓抑制素-1恢复了缺血动物中蘑菇和短粗棘的数量。当蘑菇、短梗和薄棘的数量加在一起（即棘的总数）时，与假手术对照动物相比，苔藓抑制素-1不仅可以挽救缺血诱导的树突棘丢失，而且可以增加棘的总数(D类)，证实了用树突状棘标记物嗜酸性粒细胞蛋白研究树突状刺总数的结果(C类).
此外，苔藓抑制素-1可防止脑缺血诱导的树突状棘突触丢失。采用双盲分析和电子显微镜研究蘑菇、短刺和薄刺中突触数量的变化(E类，白色箭头）。与假手术对照组大鼠相比，脑缺血减少，慢性苔藓抑制素-1逆转了蘑菇、短刺和薄刺的轴-棘突触数量。总之，慢性给予苔藓抑制素-1可以缓解脑缺血对突触数量的影响。
讨论
大鼠全身脑缺血/缺氧对背侧海马CA1区造成显著损伤，并损害了依赖于大鼠背侧海马的空间学习和记忆。本文报道的结果表明，在缺血后延长时间窗（24小时），通过长期给予bryostatin-1激活PKC，可以通过防止神经元丢失和维持/恢复树突棘及其突触来改善学习和记忆。即使与对照组相比，苔藓抑制素-1单独使用也显著增加了蘑菇状突触、短突突触和薄棘突触的数量(E类). bryostatin-1恢复非蘑菇棘数量的机制包括抗凋亡、突触发生和棘发生。使用具有延长时间窗口的治疗方法所获得的这些结果与其他各种策略所获得的结果不同，这些策略阻止了病理级联，而这些病理级联很可能在治疗开始时已经造成显著损害。苔藓抑制素观察到的缺血后/缺氧治疗效果在多大程度上是促进神经元存活/修复、神经发生/迁移和/或突触发生的，尚待确定。本研究中给大鼠的剂量在已知的人类耐受剂量范围内。在这个剂量范围内，人类的不良反应是罕见的，通常是轻微的，最常见的是肌痛和/或疲劳。然而，这些治疗结果可能导致一种涉及神经修复和修复的新药治疗，通过改善和/或预防脑缺血/中风后受损脑区的突触和神经网络损伤，补充现有的溶栓治疗。
材料和方法
动物、脑缺血/缺氧和药物治疗。
实验前，将成年Wistar大鼠（雄性，225–250 g）放置在温度控制（20–24°C）的房间中至少1周，允许自由获取食物和水，并保持12小时的光/暗循环。他们被随机分配到不同的组（每组8-10人）。诱导了全脑缺血体内通过双动脉闭塞（2-VO）方法，结合控制缺氧时间（罐子中14分钟）。在适当的戊巴比妥麻醉水平下（60 mg/kg腹腔注射，必要时额外补充剂量），用丝线绑住双侧颈总动脉（从颈部腹侧）。2-VO闭塞导致这些年轻大鼠的脑血流量慢性减少至原始流量的70%。在整个手术过程中监测直肠温度，并使用加热灯将其保持在37.5°C。
手术结束后，在适当的麻醉下，大鼠接受酮洛芬（皮下注射5 mg/kg）用于术后疼痛缓解，以及5 ml生理盐水以补偿水分和矿物质的损失。在缺氧暴露期之前，允许有7天的手术恢复期（在罐子里大约14分钟，吹入大约5%的低氧）。联合脑缺血/缺氧导致翻正反射丧失约10分钟。除了动脉未闭塞和同一罐中的氧气水平未降低外，对照大鼠接受了相同的程序。
Bryostatin-1（15μg/m2)和/或Ro-31-8220（0.5 mg/kg）通过尾静脉给药（2次/周，共10次），在缺血/缺氧事件结束后24小时开始。评估大鼠的空间学习能力（2次试验/天，共4天）和记忆能力（最后一次试验后24小时，1分钟的探针测试）作为功能终点，在最后一次服用bryostatin-1或Ro-31-8220后9天开始首次训练。最后一次bryostatin-1/Ro-31-8220剂量与第一次空间迷宫训练试验之间的延迟似乎适合于将bryostatin-1和Ro-31-8220的急性记忆作用与其对脑缺血后神经修复的影响分离开来。
所有程序均按照美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会指南进行，并得到该研究所伦理委员会的批准。
空间学习和记忆。
本研究中使用了水迷宫采集，因为它与背海马CA1锥体细胞的功能关系最为密切。每天试验前至少1小时，将大鼠转移到家中笼子中的试验室。迷宫水池直径152厘米，高60厘米，高40厘米2O（22±1°C）。迷宫被分成四个象限。训练大鼠4天（2次试验/天），以找到一个隐藏平台（直径9厘米），该平台位于其中一个象限的中心，淹没在水面以下约2厘米处。在所有试验开始时，将大鼠分别放置在面对迷宫墙的水中，每次试验使用不同的起始位置，并允许它们游泳，直到它们找到平台，在平台上停留20秒，然后再回到家中的笼子。研究人员将一只在2分钟内未能找到平台的大鼠引导到那里，得分为120秒。游泳路径是用视频跟踪系统记录的，该系统可以计算到平台的延迟、游泳距离和在象限中花费的时间百分比。训练试验结束后，进行了一项探针试验（象限试验或记忆保留试验），移除平台，以评估大鼠在象限内移动距离对其位置的记忆保留。视频跟踪系统跟踪动物在每个象限的运动1分钟。
可见平台测试。
在完成空间记忆程序后，所有大鼠都在一个可见的平台任务上进行了测试（平台上有一个突出水面9英寸的杆子，但在一个新的位置），以评估它们的感觉运动能力和寻找逃跑动机的差异。
存活细胞。
在行为测试结束时，一些大鼠在400 ml 4%多聚甲醛的戊巴比妥深麻醉下经心灌注。大脑被提取并在4%多聚甲醛中过夜固定。用旋转切片机切取冠状7 mm切片。海马结构的连续切片安装在载玻片上，并进行甲酚紫染色。为了计数，沿着背海马CA1细胞中层放置一个300μm长的框架，没有任何偏差。单元格在框架内计数，除非它们与框架的顶部或右侧重叠。观察到任何细胞损伤。
PKC活动。
用bryostatin-1处理6孔板中的大鼠海马IGF1R细胞（ATCC），然后用PBS洗涤，刮除，并在含有50 mM NaF、1 mg/ml leupeptin和1 mM PMSF的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中超声均质。PKC活性通过酶法结合32P来自γ[32]在300μg/ml磷脂酰丝氨酸和45μg/ml二酰甘油（1,2-二辛醇-sn-甘油）存在下，ATP转化为组蛋白。
在另一项实验中，用苔藓抑制素-1处理后，将大鼠海马IGF1R细胞在无血清培养基中培养96小时。对细胞进行清洗、刮除和均质处理。细胞溶胶和细胞膜通过10万倍离心分离克使用IMAL软件通过密度测定法在Western blots中测量膜和细胞溶质PKCα、PKCδ和PKCε蛋白水平。
共焦显微镜研究。
共聚焦显微镜观察BDNF、突触前轴突束和突触后树突棘的变化。在麻醉下（戊巴比妥，80 mg/kg体重，腹腔注射），用磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温下通过左心室在重力作用下灌注大鼠，以冲洗血液，然后在室温下用≈150 ml 4%多聚甲醛在PBS中轻轻固定，而不是冷固定剂，因为低温可以减少树突棘的数量。取脑后固定10min，然后从右侧大脑半球解剖海马，用振动棒在400mm处切割海马背侧，进行1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚花青素高氯酸盐（DiI）染色和免疫组化。
DiI染色。
如参考文献所述，使用DiI（分子探针/Invitrogen）观察树突棘。20使用配备510共焦扫描系统的蔡司Axiover 200M显微镜，使用63×Plan-APO铬酸盐油浸物镜（1.4 NA），对辐射层中DiI（568 nm/>510 nm；激发/发射）染色的树突棘进行成像。共聚焦图像（512×512像素）采用线扫描模式和≈1.00 Airy单位的针孔采集。收集一组共聚焦图像（每0.45μm拍摄一次），以获取单个树突轴的所有树突棘。
在分析过程中，使用Image J程序检索图像堆栈(http://rsb.info.nih.gov/ij/). 在一张图像上识别出的单个脊椎也在相邻的堆叠图像上进行了验证，以近似该脊椎的三维结构。这些脊椎的头部直径比颈部直径大三倍以上，出现在叠放图像的三个以上平面上，被鉴定为蘑菇状脊椎。从每只动物身上获得了大约四到六个叠加图像集。所有图像集被合并并编码；因此，图像被识别为未知动物数量和未知治疗（双盲方案）。
免疫组织化学。
免疫组织化学是根据我们之前的研究修改的(27). 将厚度为35-μm的海马切片与抗BDNF的一级抗体（单克隆IgG，1:50；Santa Cruz Biotechnology）、树突棘标记物嗜酸性粒细胞蛋白（多克隆IgG1:100；/Upstate/Millipore）和突触前囊泡膜蛋白突触素（单克隆免疫球蛋白；1:2000；Chemicon/Millipole）自由漂浮培养，在含有0.1%Triton X-100和15%马血清的PBS中于室温过夜。然后将切片与以下二级抗体在室温下孵育3小时：用于嗜刺蛋白的Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG（1:200；分子探针）和用于BDNF和突触素的生物素化马抗小鼠抗体（1:20；Vector Labs）。用生物素化二级抗体孵育的组织切片，然后在室温下用与Alexa Fluor 488（1:100；分子探针）偶联的链霉亲和素孵育3小时。Alexa染色后，所有切片用含4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（Vector Labs）的Vectashield安装介质安装在玻片上，对细胞核进行复染，并用盖玻片密封。
使用上述共焦显微镜设置（仅单个平面图像/区域）对海马切片进行成像，并通过image J程序进行量化。根据CA1层锥体BDNF的荧光强度，在单个细胞水平上测定了海马CA1神经元胞体中BDNF（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚复染细胞核）的表达。通过测量放射层浅部共聚焦图像（63μm×63μm）中BDNF的总荧光强度，确定BDNF在树突中的表达。用背景减影后的底片分析了辐射层浅部63μm×63μm图像中嗜酸性粒细胞蛋白和突触素剖面的外观。然后计算树突棘（嗜棘颗粒）和突触前轴突束（突触素颗粒）的总数。根据突触素的荧光强度评估突触前小泡的体积。控制数据设置为100%，所有其他实验数据定义为其控制的百分比。
电子显微镜研究。
如前所述，用电子显微镜研究了突触前、轴突泡、突触后树突棘及其突触的超微结构(27). 用水合氯醛麻醉的大鼠通过心脏灌注2%戊二醛和3%副甲醛。取下的大脑在4°C下用相同的固定剂固定过夜。然后用振捣器将右背海马切片至100μm。海马切片用碳酸缓冲液（pH 7.4）清洗三次，在1%OsO4中固定1 h，然后用蒸馏水冲洗。切片在分级乙醇系列中脱水，然后进行树脂包埋，然后使用标准程序进行切片。用乙酸铀酰和乙酸铅对超薄切片（90nm）进行染色，并在JEOL 200CX电子显微镜中在100kV下观察。在双盲定量期间，电子显微照片（100μm2使用带有Mac OS X操作系统和19英寸显示器的iMac G5计算机上的Preview程序，将5000倍CA1区域数码放大至20000倍。脊椎被定义为与轴突突触形成突触的结构，不含线粒体。树突脊椎被定量分类为蘑菇状脊椎，要求附着在清晰可分辨的“颈部”上的脊椎“头部”的横截面可视化直径>600 nm，这是由Image J程序测得的，或者脊柱“头”没有连接到一个清晰可分辨的颈部，（横截面可见）长轴和短轴长度均大于600 nm。
使用方差分析进行统计分析，然后使用Newman-Keuls多重比较测试，或使用Studentt吨在适当的情况下测试配对和未配对数据。A类P（P）值<0.05被认为是显著的。
