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单元格。作者手稿；PMC 2009年7月11日发布。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2008年7月11日；134(1): 74–84.
doi（操作界面）：2016年10月10日/j.cell.2008.05.029
预防性维修识别码：PMC2527511型
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院59838
PMID：18614012

大染色质结构域上核小体的快速、转录依赖性丢失热休克蛋白70地点

史蒂文·J·彼得什1和约翰·T·利斯1中，*
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关联数据

补充资料

总结

为了有效转录基因，RNA聚合酶II（Pol II）必须克服核小体和高阶染色质结构所造成的障碍。许多基因，包括果蝇Hsp70，激活后染色质结构发生变化。为了描述这些变化，我们绘制了热休克蛋白70以高空间分辨率和前所未有的时间分辨率跟踪瞬时热冲击。令人惊讶的是，我们发现在激活后的30秒内，整个基因的核小体发生了首次破坏，其速度快于Pol II转录的速度，随后在2分钟内又发生了第二次破坏。这种初始变化与Pol II转录无关。此外，核小体的快速丢失超出了热休克蛋白70并在scs和scs的绝缘元件处停止。对28个转录和染色质相关因子的RNAi筛选显示，热休克因子、GAGA因子或聚（ADP）-核糖聚合酶或其活性的缺失可消除核小体在热休克蛋白70激活。

简介

在真核细胞中，DNA被包装成染色质，为需要获得DNA的因素提供天然屏障(Rando和Ahmad，2007年). 许多基本的细胞过程，包括基因表达，都依赖于细胞调节和减轻染色质限制性特性的能力。体外研究表明，负责表达所有mRNA编码基因的RNA聚合酶II（Pol II）的转录速率和加工能力受到核小体的严重抑制(《膝关节和色度》（Knezetic，and Luse），1986年;洛奇、拉波因特和科恩伯格，1987年). 然而，体内研究表明，Pol II，甚至是第一个转录诱导基因的“先驱”Pol II能够以约1.5 kb/min的速率转录，这表明它不受核小体的抑制(O'Brien和Lis，1993年;Thummel、Burtis和Hogness，1990年). 这些结果表明，真核细胞具有调节活性基因核小体位置和结构的机制。

作用于染色质的因子的多样性表明，真核细胞利用多种通用机制来改变核小体的位置或组成，从而使Pol II等关键因子能够进入DNA(Li、Carey和Workman，2007年). 染色质重塑复合物，如SWI/SNF和ISWI，为细胞提供了沿着DNA模板去除、转移或滑动核小体的能力(Saha、Wittmeyer和Cairns，2006年). 此外，许多转录延伸因子和组蛋白伴侣，如FACT、Spt6和Asf1，在转录Pol II后有助于核小体的拆卸和重组(Bortvin和Winston，1996年;《孤儿》，LeRoy等人，1998年;Schwabish和Struhl，2006年). 最后，组蛋白修饰酶可以乙酰化、甲基化、磷酸化、单泛素化、sumoylate或ADP-核糖基化组蛋白，或执行每种反应的相反过程(Li、Carey和Workman，2007年). 许多这些修饰可以调节核小体间和核小体内的相互作用(Reinke和Horz，2003年;Shogren Knaak和Peterson，2006年)大多数可能成为效应器的特定靶点(Jenuwein和Allis，2001年;Wysocka、Swigut等人，2006年)可以局部作用，减轻或加强染色质的抑制结构。

理解核小体的位置以及这些位置在转录过程中是如何变化的，对于解释这些变化是如何发生的至关重要。早期对细胞分离的染色质进行微球菌核酸酶（MNase）或DNase1的研究，首次提出了细胞染色质结构的观点黑腹果蝇热休克基因体内这些分析表明，启动子和3'端热休克蛋白70该基因含有较大的超敏区，HS前编码区上的核小体在HS延长后被破坏(Wu、Wong和Elgin，1979年;吴，1980). 最近，全基因组ChIP-ChIP和ChIP-seq研究表明，许多基因表现出类似的核小体占据模式(Johnson，Tan等人，2006年;Lee，Tillo等人，2007年;Schones，Cui等人，2008年). 特别是，在转录起始位点上游的启动子区域通常没有核小体，这使得转录机制能够轻松获得DNA元素(克劳福德、霍尔特等人，2006年;Mito、Henikoff和Henikof，2005年;袁，刘，等，2005). 此外，基因酿酒酵母在启动子区域的每一侧平均包含1个位置良好的核小体，核小体的位置逐渐减少(Albert，Mavrich等人，2007年;Lee，Tillo等人，2007年;袁，刘，等，2005). 因此，虽然许多发起人是开放的，可以接近的，甚至被波尔二世占领(利斯，2007年)，Pol II仍然必须克服核小体阻塞其下游进入基因的通路。

D.melanogaster Hsp70是用于研究Pol II通过染色质转录的一般机制的模型基因。热休克蛋白70在HS发生后几秒钟内迅速激活，伴随着染色质结构的去凝集，明显表现为多烯染色体上形成大团簇(Boehm、Saunders等人，2003年). 毫不奇怪，一整套转录因子被用来热休克蛋白70激活后，在主热冲击系数（HSF）激活器的指示下(桑德斯、科尔和利斯，2006年). 奇怪的是，尽管HS诱导基因的烟团大小随着转录长度和启动子强度的增加而增加(Simon，Sutton等人，1985年)，先前的研究也表明，HS基因座的膨胀可以通过化学刺激与基因的主动转录脱钩(Winegardard，Wong等人，1996年). 尽管信息丰富，但这些研究并没有在活细胞的分子水平上证明占据核小体的核小体确实发生了变化热休克蛋白70.

基因激活后染色质结构的巨大变化引发了几个问题。这种膨胀完全代表核小体的变化吗？核小体被驱逐了吗，或者它们的位置或构型发生了改变？在分子水平上，染色质结构的变化能以多快的速度被检测到？最后，是哪些因素造成的？以前的研究表明，热休克因子（HSEs）或GAGA因子（GAF）结合位点的缺失热休克蛋白70启动子区域导致HSF结合减少，HS后形成烟团的损失(Shopland、Hirayoshi等人，1995年). GAF，由类似三叉戟的基因，结合重复（GA）n个序列并出现在热休克蛋白70HS前启动子(O'Brien，Wilkins等人，1995年). GAF本身已被证明在基因激活中发挥重要作用，可能是通过自身调节染色质结构或通过其与NURF重塑复合体的相互作用(Tsukiyama、Becker和Wu，1994年;Tsukiyama和Wu，1995年).

除了HSF和GAF外，最近的证据表明，聚ADP-核糖聚合酶（PARP）在许多位点的烟团形成中也很重要，包括热休克蛋白70(Tulin和Spradling，2003年). PARP是一种催化NAD中ADP核糖单元聚合的酶+作用于靶蛋白（主要是自身）并与DNA和核小体相互作用(Kim，Mauro等人，2004年;Pinnola、Naumova等人，2007年). PARP蛋白在几个核过程中起作用，包括DNA损伤反应(D’Amours，Desnoyers等人，1999年)，但最近才对转录进行了检查(Kraus和Lis，2003年). P元素的插入会干扰PARP的表达或抑制PARP的催化活性，在HS发生后，多烯染色体中的烟团尺寸减小，Hsp70蛋白水平降低(Tulin和Spradling，2003年). 为了了解烟团的形成以及HSF、GAF和PARP的作用，需要在核小体水平上检查染色质。此外，还需要评估其他因素的潜在作用。

在本文中，我们绘制了D.melanogaster Hsp70基因的分辨率为30 bp，并在瞬间HS后几秒钟跟踪其变化。我们发现在HS之前热休克蛋白70在大多数基因上具有与一般全基因组特征相似的特征。在HS之后，我们发现热休克蛋白70在整个基因中有一个最初的剧烈变化，这种变化非常迅速，甚至在第一波转录聚合酶到达基因的相应区域之前就发生了。此外，我们发现核小体的初始丢失与转录无关，并延伸到HS基因两侧的天然绝缘元件。通过对已知辅活化因子、染色质重塑酶、组蛋白修饰物、核小体组装和拆卸因子、DNA拓扑修饰物和延伸因子的RNAi筛选，我们确定HSF、GAF和PARP是核小体在热休克蛋白70HS基因。PARP的作用需要其活性，在HS前仅10分钟添加特定抑制剂就足以阻止核小体丢失。

结果

染色质结构热休克蛋白70热休克后迅速发生剧烈变化

我们采用了一种先前开发的方法(Sekinger、Moqtaderi和Struhl，2005年)跟踪体内染色质结构的变化热休克蛋白70激活后的单核小体水平的基因。在我们的分析中，热休克蛋白70在中诱导果蝇属S2电池在不同时间通过瞬时HS。细胞与甲醛交联，然后分离染色质并分裂成模拟和MNase处理的样品(图1A). 然后用100多个平均间隔30 bp的单独引物集探测DNA，并沿着Hsp70抗体副本(图1B和表S1). 引物对的扩增能力取决于MNase消化后剩余引物之间相邻DNA的数量；MNase裂解核小体之间的连接体DNA，裂解无核小体DNA。确定特定区域的消化量热休克蛋白70基因，我们使用定量PCR（qPCR）计算消化的DNA数量与未消化对照的相对比率。100 bp区域的有效扩增可确保消化样品中可扩增的DNA为单核小体或亚核小体，但大于四聚体或六聚体结构。滴定MNase的量，从细胞核的大量染色质中产生单核小体(图S1A)，并在非感应条件下观察保护热休克蛋白70扩增100 bp大小的片段，但不扩增190 bp大小的碎片(图S1B). 这确保了我们的分析具有单核小体分辨率，并提供了测量和跟踪核小体位置的精确方法热休克蛋白70遵循HS。

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染色质结构在热休克蛋白70通过高分辨率MNase扫描分析检测到热休克

（A） 描述高分辨率MNase分析所遵循程序的图表。将S2细胞热休克0（深蓝色）、5（浅蓝色）、30（绿色）、60（橙色）或120秒（红色）（颜色指1C），立即冷却至室温并交联，分离其染色质。用0或500U的MNase处理样品中纯化的DNA产物，并用于qPCR。

（B） 显示在Hsp70抗体基因。PCR产物的大小为100±5 bp，间距为30±6 bp。mRNA编码单元以黑色显示。与面板C相对应的基因核苷酸位置编号如下，并标明HSE、TSS和PolyA位点（+2343）。

（C） HS时间进程染色质分布热休克蛋白70通过使用ΔC（t）方法（y轴）将MNase消化PCR产物的量标准化为未消化产物的量来确定，该方法根据基因核苷酸位置（x轴）绘制。对重叠引物集的值进行平均。x轴表示基对单位，0表示TSS。线表示3个单独实验的平均值，为了清晰起见，省略了误差条。

在非热冲击（NHS）条件下，热休克蛋白70包含4个不同的染色质区域：一个无核小体启动子区域，一个位置良好的核小体，位于转录起始位点（TSS）后约330个核苷酸的中心，基因体内位置不佳的核小体和基因3'末端的第二个无核小体区域(图1C，深蓝色）。（每个单独的时间点都可以被视为一个单独的图形，其中包含图S2A-E.）核小体游离区位于热休克蛋白70与早期的研究一致，这些区域对核酸酶过敏(吴，1980). 5’超敏区延伸至转录单位，而不是已知Pol II参与转录并在其起始位点下游暂停20到40个碱基对(Giardi、Perez-Riba和Lis，1992年;拉斯穆森和利斯，1993年;拉夫维和利斯，1990年). 除了第一个核小体（位于+330的中心位置，以及暂停的Pol II的下游位置）之外，基因体还包含逐渐失去定位的核小体。这可以从基因上相对均匀的保护分布中看出。位于热休克蛋白70把核小体放在基因的3'端。总的来说，在NHS条件下热休克蛋白70该基因可以容纳暂停的聚合酶，但仍然为转录延伸提供了一个迫在眉睫的障碍。

为了确定热休克蛋白70在瞬间HS发生变化后，我们在5、30、60和120秒HS后使用高分辨率MNase分析。在HS的5秒内，基因紧邻5'区域的DNA保护作用减弱(图1C，浅蓝色）。30秒前(图1C，绿色），在5'区域观察到进一步的损失，但现在也观察到损失延伸到基因的3'区域。令人惊讶的是，基因3'端的这些初始变化发生在RNA聚合酶到达3'端之前，大约需要2分钟(Boehm、Saunders等人，2003年;O'Brien和Lis，1993年). 核小体保护在30到60秒之间没有明显变化(图1C，橙色）。然而，通过120秒的高速(图1C（红色）核小体保护的另一个广泛缺失发生在整个基因上。与NHS条件相反，120秒HS的核小体保护模式被破坏。即使在HS持续20分钟后，此2分钟保护模式仍保持不变（未显示数据）。对于较短的HS诱导物，在相同的时间尺度上也观察到核小体的类似变化Hsp26型基因(图S3A和S3B). 在HS期间，核小体的位置既不会移动到核小体自由区，也不会增加其相对保护水平。

为了确定染色质景观中的这些变化是否是由于组蛋白丢失或该位点DNA可接近性增加所致，我们使用识别组蛋白H3及其变体的抗体进行了传统的超声ChIP。ChIP测定的组蛋白NHS景观与MNase保护分析相匹配(图2，深蓝色）。此外，在HS的5、30和60秒时，组蛋白H3 ChIP的MNase保护模式也发生了相同的变化(图2、淡蓝色、绿色、橙色）。MNase可及性增加和组蛋白密度降低表明基因核小体结构中断或核小体丢失。两种方法之间观察到的唯一显著差异是，HS 60到120秒之间组蛋白水平没有变化。对这些差异的一个可能的解释是，Pol II在此点在基因体中积累，导致典型核小体结构的进一步破坏。这可能导致该DNA对MNase的可及性增加，而组蛋白H3的含量不会进一步减少。同样，也发现了类似的结果Hsp26型(图S3C).图1和图2表明核小体结构的变化热休克蛋白70从基因的5'端开始，比Pol II更快地向3'端移动。

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组蛋白H3快速丢失热休克蛋白70热休克时

组蛋白密度热休克蛋白70使用H3抗体通过ChIP检测的基因。S2细胞受到0（深蓝色）、5（浅蓝色）、30（绿色）、60（橙色）或120秒（红色）的热冲击。y轴表示输入材料免疫沉淀的百分比。误差条代表3个独立实验的SEM。x轴表示沿热休克蛋白70TSS为0的基因；每个数字代表PCR扩增子的中心。基因间区域代表了热休克蛋白70BcHS不会改变。

核小体位于热休克蛋白70可以独立于转录而丢失

核小体在热休克蛋白70在Pol II占据这些区域之前发生的变化表明，染色质的快速变化发生在20分钟HS最大烟团形成之前(Lewis、Helmsing和Ashburner，1975年)，也可能独立于转录而发生。为了在高分辨率下对染色质的变化进行分类，我们使用水杨酸钠或核苷酸类似物5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）。这两种化学物质都能降低HS诱导的水平热休克蛋白70转录(Giardi和Lis，1993年;Winegarden，Wong等人，1996年). 用DRB处理S2细胞，然后进行2分钟HS，导致HSF正常募集到启动子（−154）(图3A). Pol II通常也被招募到暂停地点（+58）；然而，在下游地区（+1702）没有检测到(图3A)，表示转录延伸被抑制。带有DRB的2分钟（或30秒）HS的核小体保护谱显示，即使Pol II从未进入基因体内，核小体结构也发生了初始丢失(图3B和图S15A).

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核小体的初始丢失热休克蛋白70独立于转录

（A） ChIP位于热休克蛋白70对于HSF和Rpb3（Pol II），在HS之前（NHS，黑色条和NHS+DRB，深灰色条）和HS期间（2'HS，白色条和2'HS+DRB、浅灰色条），有或没有125µM转录抑制剂DRB。y轴表示输入材料免疫沉淀的百分比。x轴值表示以HSE（−154）、Pol II暂停位点（+58）、下游区域（+1702）和scs和scs区域外的基因间区域为中心的碱基对单位。误差条代表3个独立实验的SEM。

（B） MNHS带DRB（深灰色）、带DRB的2'HS（浅灰色）和2'HS（中灰色）的底座保护剖面，如图1C。线表示3个单独实验的平均值。为了清晰起见，仅为2'HS+DRB线绘制了代表SEM的误差线。

（C） ChIP，如（A）所述，除了在之前（NHS，黑条和NHS+水杨酸盐，深灰色条）和HS期间（20'HS，白条和20'HS+水杨酸盐，浅灰色条）有和没有10mM水杨酸钠。误差条代表3个独立实验的SEM。

（D） MNase保护配置文件如（B）所示，带有NHS（黑色）、NHS+水杨酸盐（深灰色）和1'HS（浅灰色）。线表示3个单独实验的平均值。为了清晰起见，仅为NHS+水杨酸盐线绘制了代表SEM的误差线。

在NHS条件下用水杨酸钠处理细胞，导致HSF水平的补充，相当于20分钟HSF水平(图3C). 然而，暂停点或下游地区的Pol II含量与NHS水平相比没有变化(图3C). 这些结果与先前的研究一致，这些研究表明水杨酸钠诱导HSF与其HSE结合，但不会导致暂停的Pol II导致额外的启动子熔化(Giardi和Lis，1995年). NHS使用水杨酸钠进行治疗，就像在DRB存在下使用HS一样，导致整个基因的核小体丢失，类似于HS 30或60秒后的初始丢失(图3D). 两个实验的结果相似Hsp26型以及(图S4A–D). 这些实验表明，核小体的初始丢失是由于一种独立于转录的机制造成的，随后的保护性丢失是由于转录依赖机制造成的。

核小体的丢失热休克蛋白70在果蝇属scs和scs的边界元

在我们最初的实验中，我们观察到整个细胞的染色质发生了变化热休克蛋白70我们调查的地区(图1C). 接下来，我们选择确定核小体保护缺失在哪里停止。去凝聚多烯染色体团不会无限期扩散，这表明核小体丢失可能存在相对明确的边界。为了确定此边界发生的位置，我们逐步沿着热休克蛋白7087A基因与scs和scs边界元素(图4) (缅因州乌德瓦迪和斯克德尔，1985年). 作为绝缘体，scs和scs的区域可以防止染色质位置的正负效应，并可以阻断顺式作用、启动子-增强子相互作用(Kellum和Schedl，1991年;库恩、哈特和盖尔，2004年). 已知scs和scs区域分别包含核酸酶超敏区以及zeste-white 5（Zw5）和边界元素相关因子32（BEAF-32）DNA结合蛋白的DNA结合元件(Gaszner、Vazquez和Schedl，1999年;巴斯克斯和舍德尔，1994年;赵、哈特和莱姆利，1995年). 令人惊讶的是，在热休克蛋白70HS激活后，scs或scs区域丢失，动力学与在热休克蛋白70(图4B、4C和数据未显示）。然而，由scs和scs元件包围的区域外的核小体不受影响(图4A和4D). 这些结果表明，scs和scs区域也对严重解聚染色质的传播起到屏障作用，转录激活时核小体的快速丢失不仅限于转录单位，而且可以延伸激活基因的上游和下游数kb。有趣的是，尽管核小体的变化发生在该区域内的多个基因上，但只有热休克蛋白70基因在HS后被诱导(图S5A). 此外，与87A聚乙烯烟团相对应的宽域核小体丢失发生在最大烟团形成之前；因此，膨化不仅代表核小体的变化，还必须表示位点的高阶结构变化。

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scs和scs区域将热休克位点与核小体丢失的传播隔离开来

（A–D）MBase HS时间进程保护，如图1Cscs和scs绝缘体的侧面。上面显示的87A HS基因座描述了分析的侧翼scs和scs’的4个位点。A区和C区位于scs和scs绝缘体的外部，B区和D区分别位于scs绝缘子的内部。区域A–D也对应于图中的A–D。所有4张图的x轴使用Hsp70抗体复制为0点。代表的每一行是3个独立实验的平均值。为了清晰起见，省略了误差线，但3个独立实验的SEM小于±0.06。

HSF和GAF是在果蝇Hsp70

上述结果确定了核小体丢失的位置和速率热休克蛋白70但没有确定核小体丢失需要哪些因素。为了解决这个问题，我们将高分辨率MNase分析与RNAi对候选因子的瞬时消耗相结合。假设HSF突变或HS或GAGA元素的缺失或突变会极大地抑制HS烟团的形成(Jedlicka、Mortin和Wu，1997年;Shopland、Hirayoshi等人，1995年)，我们首先针对HSF和GAF进行消耗。HSF或GAF耗尽至LacZ对照细胞的10%以下(图5A和5B)，消除了热休克蛋白702分钟高速行驶后(图5A和5B)并以较短的30秒HS(图S15B和15C). 因此，HSF和GAF对于HS上核小体的丢失至关重要。

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HSF、GAF和PARP是在热休克蛋白70

Mbase保护配置文件如中所示图1C比较（A）HSF、（B）GAF或（C）PARP（黑线）RNAi缺失后的染色质结构，并与2'HS后的LacZ（灰线）对照RNAi损耗进行比较热休克蛋白70每条线代表3个独立实验的平均值，误差条代表SEM。显示HSF、GAF或PARP相应敲低的蛋白质印迹显示在每张图的右侧，TFIIS用作负载对照，LacZ RNAi的系列稀释用于量化每次敲低。

聚（ADP）-核糖聚合酶在热休克蛋白70

为了确定HS后核小体结构的快速变化是否需要其他因素，我们通过RNAi缺失瞄准了许多其他因素：HS反应中已知的参与者、核小体重塑者、组蛋白相互作用蛋白、延伸因子、影响DNA拓扑结构的因素和已知的边界元素因素。这些实验的结果总结在表1和中图S7-13虽然并不是所有的敲除都得到了确认，但由于抗体的不可用性，那些被检查的细胞的蛋白质水平下降到了对照细胞的5-20%(图S14). 在NHS条件下，含有Nurf301和Chd1的ISWI重塑复合物的作用最大，因为该基因体上的核小体更好地定位在ISWI、Nurf301和Chd1-RNAi处理的细胞中(图S10B、S10C和S10E). 此外，HDAC3的RNAi缺失降低了对应于前2个核小体位置的DNA保护(图S11D). HS后，一些转录相关因子，包括Med15、P-TEFb、Spt6和ERCC3(图S7D、S9A、S9D和S12C分别）显示核小体轮廓更接近于1分钟而不是2分钟HS，这可能是转录缺陷的结果热休克蛋白70(Ni，Saunders等人，2007年)或可能在与延长Pol II相关的核小体的解体中发挥直接作用。无论如何，这4个因子的缺失加强了这一发现，MNase保护的第二个缺失（发生在HS的1到2分钟之间）是一个转录依赖性事件。其他因素的耗竭导致HS患者TSS后第一个核小体部位的保护稍多（例如。图S8D、S9B、S9C等）。此外，还选择了包括Zw5和BEAF-32在内的一组因子，以确定RNAi缺失是否有任何因子可以破坏scs和scs'外的核小体，但未发现任何因子(图S6). 总的来说，与在2分钟HS前后控制LacZ RNAi治疗相比，大多数靶向缺失的因子在核小体轮廓上没有表现出任何差异（例如。图S7C、S7E、S8A等）。

表1

不同因素RNAi耗竭对大鼠染色体结构的影响热休克蛋白70

因子NHS变更2'HS的变化
上游激活器高速缓冲存储器1无英国国家医疗服务体系4
GAF公司1无英国国家医疗服务体系4
美国海关与边境保护局无无
医学15无1英尺高5
医学23无无
SAGA子单元Gcn5公司无无
Tra1（Tra1）无无
转速3无无
Ubp8型无非军事计划6
伸长率PTEF-b（细胞周期蛋白T1)无1英尺高5
第1页1无非军事计划6
事实（Spt161)无非军事计划6
速度61无1英寸5
染色质重塑器瑞士/瑞士（Brm）无无
ISWI公司核武器计划2无
纽尔夫301核武器计划2无
MI-2公司无无
变更1核武器计划2非军事计划6
基斯梅特无无
核小体相互作用蛋白质类HIRA公司无无
Asf1型无无
PARP项目1无英国国家医疗服务体系4
HDAC3型自然语言处理三非军事计划6
DNA拓扑地形11无无
顶部2无非军事计划6
TFIIH（ERCC31)无1英尺高5
边界元素BEAF公司-无非军事计划6
Zw5型无非军事计划6
1Western确认敲除为LacZ RNAi水平的5-20%。
2基因体上的核小体位置更好。
三DNA位于1标准和2第TSS后的核小体受到较少保护。
4类似于NHS档案。
5类似于1'HS配置文件。
6DNA位于1标准TSS后的核小体受到更多保护。

除了HSF和GAF之外，只有一个额外的因子，即聚（ADP）-核糖聚合酶（PARP），被发现对HS染色质结构的剧烈变化至关重要。与热休克2分钟的LacZ耗竭细胞相比，PARP耗竭至约10%的对照水平，导致核小体轮廓更接近NHS(图5C)，表明PARP在HS时引起染色质结构变化方面的重要性。使用较短的30秒HS也发现了类似的结果(图S15D).

为了确定PARP调节染色质结构变化的能力是否依赖于其催化活性，我们使用了一种特定的PARP催化抑制剂PJ34(维拉格和萨博，2002年). 用300 nM PJ34处理S2细胞10分钟不会影响NHS染色质分布（数据未显示）。然而，用300 nM PJ34处理细胞，然后进行2分钟HS(图6A)或30秒高速(图S15E)与未经处理的细胞相比，NHS核小体轮廓保留。这些结果证实了RNAi敲除数据，并反驳了瞬时敲除的非靶向效应，但也表明PARP的酶活性是核小体丢失所必需的热休克蛋白70遵循HS。

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PARP的酶活性是核小体丢失所必需的热休克蛋白70并且完整需要PARP热休克蛋白70表达式

（A） Mbase保护配置文件热休克蛋白70如中所示图1C用PARP酶抑制剂PJ34比较经2'HS处理（黑线）或未经处理（灰线）的S2细胞的染色质结构。每条线代表3个独立实验的平均值，误差条代表SEM。

（B）热休克蛋白70对缺乏LacZ（黑色）或PARP（灰色）的S2细胞进行2、5和20分钟HS后的mRNA水平测量。热休克蛋白70通过寡核苷酸dT引物逆转录和qPCR检测表达水平Hsp70抗体引物。热休克蛋白70mRNA水平标准化为49卢比具有代表3个重复的SEM的误差条的基因。

然后，我们试图确定PARP的耗竭是否会导致HS后染色质结构的保留之外的功能后果。为了解决这个问题，我们测量了热休克蛋白70HS 2、5和20分钟后的mRNA水平。结果是，在每个时间点之后，成绩单的数量几乎减少了3倍(图6B)与之前估计的Hsp70蛋白水平减少5倍相当(Tulin和Spradling，2003年). 总的来说，我们的结果表明，在HS时，PARP对于快速核小体丢失是必要的热休克蛋白70因此，基因的完全转录激活。

讨论

使用高分辨率体内绘制快速诱导的染色质结构变化的方法热休克蛋白70基因，我们观察到核小体结构的广泛破坏，其发生速度比转录Pol II更快，比单个转录单元更宽，在天然绝缘元件处停止。此外，我们发现染色质结构在热休克蛋白70可以从基因转录中解耦，而第二次中断2分钟是转录依赖性的。选择性RNAi筛选确定HSF、GAF和PARP是在热休克蛋白70.

在HS之前热休克蛋白70该基因包含一个染色质景观，有许多一般性的，也有一些独特的特征。像许多其他含有TATA的基因一样(Albert，Mavrich等人，2007年)，一个高度定位的核小体存在于启动子区域下游和机体上的相邻核小体热休克蛋白70逐渐失去定位。同样，正如许多全基因组研究所见，启动子和基因3'端的一个区域相对来说是无核小体的(Mito、Henikoff和Henikof，2005年;Trinklein、Karaoz等人，2007年;袁，刘，等，2005). 基因3'端对核酸酶过敏的原因尚待确定。然而，虽然酵母中的许多基因都包含一个定位核小体，起始于转录单元的前100 bp，热休克蛋白70包含进一步延伸的无核小体区域，第一个核小体中心位于TSS之后330 bp。这种延伸的无核小体区域可能是含有暂停聚合酶的基因的一个更普遍的特征。

我们的HS时间进程表明，在HS后2分钟内热休克蛋白70急剧变化。通过我们的检测，经过2分钟的HS后，通常由组蛋白八聚体提供的相邻100 bp DNA片段不再具有明显的保护作用。然而，在基因体上仍然可以检测到组蛋白H3的水平，尽管比NHS水平低三倍。尽管这些结果与早期观察到的组蛋白水平不同热休克蛋白70请勿按照HS进行更改(Nacheva，Guschin等人，1989年;所罗门、拉森和瓦沙夫斯基，1988年)，我们通过qPCR测量的3倍下降与HS后组蛋白水平的最新定量一致(Adelman，Wei等人，2006年)在这些早期实验的定性分析中可能没有被发现。天然转录Pol II复合物与生长RNA链的早期电子显微镜扩散D.黑腹果蝇表明大量转录Pol II体内其路径两侧似乎有核小体(McKnight和Miller，1979年). 然而，我们的结果表明，至少对于快速诱导的热休克蛋白70基因，HS之前存在的核小体结构在基因激活后不再存在。

我们还发现热休克蛋白70诱导远远超出了热休克蛋白70并且在scs和scs的绝缘元件处停止。先前对scs和scs’的研究表明，这些绝缘体能够阻断增强子功能，并建立对位置效应具有抗性的染色质结构域(Kellum和Schedl，1991年;库恩、哈特和盖尔，2004年). 然而，scs和scs区域已被DNA FISH定位在压扁的多烯染色体上，位于内源性87A HS位点的HS烟团内(库恩、哈特和盖尔，2004年). 这表明，scs和scs区域本身并不是染色体结构变化的绝对边界，支持我们的观察，即膨化在核小体破裂后很长时间内达到最大，因此表示此处观察到的额外结构变化。尽管转录CG31211号,CG3281号，以及极光HS后没有改变，RNAi的靶向因子不允许scs或scs'以外的核小体被破坏，这两个区域都包括一个含有可检测到的Pol II的TSS(图S5B)，与之前的结果一致(Gilchrist Muse等人，2007年). 因此，这些基因上存在Pol II的启动子结构可能负责在这些位点建立屏障。总的来说，我们的结果表明，scs和scs’至少在核小体水平上为染色质去凝聚的传播提供了一个主要屏障，增加了我们对烟团染色质结构的有限知识。

先前的结果与我们的结果相结合，表明转录相关染色质去凝聚可能更普遍。染色质结构的变化与转录无关热休克蛋白70在人类中(Brown和Kingston，1997年)以及发育调控的泡芙果蝇属(克劳利、马瑟斯和梅耶洛维茨，1984年). 此外，我们的结果表明D.melanogaster Hsp70不依赖于许多不同的转录因子。在酿酒酵母，许多HS基因也会在2分钟的HS时间内失去基因体内的组蛋白密度(Zhao、Herrera-Diaz和Gross，2005年)和我们的研究一样，这些变化与SWI/SNF、Gcn5和Paf1无关。总的来说，转录诱导的染色质去凝聚可能使细胞通过清除Pol II在运动之前的障碍，以及延伸因子的环境，快速激活基因。

我们的结果表明，除了HSF和GAF外，它们以前也参与了热休克蛋白70位点(Shopland、Hirayoshi等人，1995年)，PARP对于核小体结构的快速变化也是必要的热休克蛋白70这与PARP表达减少导致HS烟团大小减小的发现一致(Tulin和Spradling，2003年). 我们的结果进一步证明，PARP有助于在HS后2分钟内快速去除核小体。聚（ADP-）核糖（PAR）聚合物是PARP的酶促产物，具有与核酸相似的化学和结构特征(D'Amours，Desnoyers等人，1999年). 激活后，PARP多核糖基化自身，导致PARP从染色质中释放(Wacker，Ruhl等人，2007年). 其结果可能是双重的。首先，由于PARP以与连接组蛋白H1类似的抑制方式与核小体结合(Kim，Mauro等人，2004年)PARP的激活可导致其从染色质中释放，以逆转对染色质结构的任何抑制作用热休克蛋白70第二，组蛋白的ADP-核糖基化可能会破坏核小体的稳定性，这些PAR聚合物的产生可以作为核酸在局部起作用，将组蛋白从机体吸引并清除热休克蛋白70基因。或者，PARP可以共价修饰另一种蛋白质，以激活其在去除核小体中的作用。

除了组蛋白外，PAR还可以吸引结合核酸的转录因子。这可以解释Pol II和其他重要转录因子快速募集到HS活性转录位点的原因(Boehm、Saunders等人，2003年). 同样，PAR也可以提供一种方法，通过这种方法，被招募到基因中的转录因子被局部保留(Yao，Ardehali等人，2007年). 因此，PARP的激活可以提供一种快速、转录依赖的方法来耗尽组蛋白并促进热休克蛋白70基因。

实验程序

炸薯条

按照中所述进行热冲击(Boehm、Saunders等人，2003年)和ChIP的执行方式(Adelman，Wei等人，2006年)但以下情况除外。在4°C下，在生物破坏者（Diagenode）的高超声环境下，用一个15’的间隔，然后用三个5’的间隔20”的脉冲，再加上1’的不活动（相当于24次总脉冲），对提取物进行超声处理，以获得平均400bp的碎片大小。每IP使用的抗体量为：4µL兔抗Rpb3(Adelman，Wei等人，2006年)，2µL兔抗HSF(Boehm、Saunders等人，2003年)和2µL兔抗组蛋白H3-ChIP等级（Abcam ab1791）。

高分辨率MBase映射

对ChIP使用相同的程序，直到在超声缓冲液中重新悬浮。此时，交联细胞重新悬浮在高渗缓冲液A中（300 mM蔗糖、2 mM醋酸镁、3 mM氯化钙2，10 mM Tris pH 8.0，0.1%Triton X-100和0.5 mM DTT）至1×108细胞/mL，在冰上孵育5'，用2mL搅拌均匀器（紧杵，惠顿）浸泡20次。通过在4°C、720 g下离心5'收集细胞核。在缓冲液A中洗涤两次颗粒，然后在1×10的缓冲液D（25%甘油、5 mM醋酸镁、50 mM Tris pH 8.0、0.1 mM EDTA、5 mM DTT）中再次悬浮8通过在4°C和720 g下离心5'收集细胞核/mL。将颗粒在缓冲液D中洗涤两次，然后再悬浮在缓冲液MN中（60 mM KCl、15 mM NaCl、15 mM Tris pH 7.4、0.5 mM DTT、0.25 M蔗糖、1.0 mM CaCl2)1×108核/mL。2×10的当量7核用于MNase反应。添加在缓冲液MN中稀释的MNase（USB），以便每次反应使用0、0.5、5、50和500个总单位，并在室温下计时30'。添加EDTA和SDS至最终浓度分别为12.5 mM和0.5%时，反应停止。相当于5×106从珠的洗脱点去除细胞核并像ChIP样品一样进行处理。

定量实时PCR分析

ChIP和RT-qPCR引物集之前的特征如(Adelman，Wei等人，2006年). 实时PCR按照(Ni，Saunders等人，2007年). 对于ChIP样本，通过连续稀释输入样本生成标准曲线，以量化IP样本。对于MNase消化，计算了一个倍差(Schmittgen，Zakrajsek等人，2000年)MNase处理和未处理样品之间。所有使用的值都是从线性放大范围中收集的。

化学处理

将所有化学品添加到培养基中的S2细胞中，最终浓度为125µM DRB、10 mM水杨酸钠和300 nM PJ34，并在室温下混合10'。然后按照ChIP部分中概述的NHS或2'HS条件收集细胞。

RNAi治疗

所有RNAi治疗均按照(阿德尔曼、马尔等人，2005年)但击倒被允许进行96小时。所有敲除的RNAi引物和RefSeq DNA标识符见表S1简单地说，用双链RNA处理S2细胞，双链RNA使用Ambion MEGAscript手册设计，靶向所列因子的编码序列或β-半乳糖苷酶（LacZ，作为阴性对照）。收集细胞并将其分裂为NHS和2'HS样品，以使用高分辨率MNase分析进行处理。

mRNA表达分析

所有mRNA表达分析均按照(Adelman，Wei等人，2006年). 简而言之，在HS作用2、5和20分钟后，从PARP RNAi和LacZ RNAi S2细胞中分离出总RNA（Qiagen RNeasy）。热休克蛋白70通过寡核苷酸dT介导的定量实时逆转录-PCR测定水平。稳定的核糖体蛋白RpL32基因(49卢比)用于RNA量的内部标准化。

西方印记

使用标准条件进行蛋白质印迹，输入稀释液用作信号线性的定量指示。HSF抗体实验室库存(Shopland、Hirayoshi等人，1995年)、GAF(O'Brien，Wilkins等人，1995年)、和TFIIS(阿德尔曼、马尔等人，2005年)分别以1:2000、1:1000和1:3000的稀释度使用。提高兔抗Parp血清识别C末端(Kim，Mauro等人，2004年)是W.Lee Kraus的礼物，稀释倍数为1:1000。

补充材料

01

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02

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致谢

我们要感谢Lis实验室所有成员对手稿的评论，特别是Abbie Saunders和Abbie Sounders对ERCC3抗体生产的评论。这项工作得到了NIH向J.T.L.拨款GM25232的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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