蒙古沙鼠腹侧前列腺的年龄相关组织病理学损伤是研究自发性激素相关疾病的良好模型

摘要

前列腺是男性泌尿生殖系统的附属腺体，有助于精液营养物质的产生，并促进维持分泌物中的离子梯度和适当的pH值(Untergasser公司等。2005). 目前，由于前列腺腺癌是影响男性的主要肿瘤，因此该腺体具有重要的临床病理学意义(Taplin&Ho 2001年;舒尔茨等. 2003). 尽管近年来前列腺癌发生机制的研究取得了进展，但它仍然是一种复杂的疾病，其自然史尚不清楚(Bonkhoff&Remberger 1998年;Huss公司等。2001).

与衰老过程相关的荷尔蒙失衡，包括雄激素和雌激素比例的显著下降，可能导致前列腺病理性改变的演变(班纳吉等。2001;Schulz等人，2003年). 除了荷尔蒙失衡外，前列腺组织在衰老过程中细胞增殖和凋亡过程之间也会逐渐失去体内平衡(博斯特维克等。1996;唐和波特1997).

人类和啮齿动物前列腺之间存在的解剖相似性有助于维持小鼠模型在器官正常发育以及前列腺癌进展过程中的分子变化研究中的应用(Pollard&Luckert 1986年,1987,1992;胡斯等。2001). 在这两个物种中，前列腺的发育始于泌尿生殖窦，在这两种物种中，它都是雄激素敏感器官。细胞群相似，可能具有相同的生理功能。人类和啮齿动物前列腺的主要区别在于宏观和微观腺体解剖；这些差异会损害对啮齿动物病理变化的解释(Abate-Shen&Shen 2000年;库尼亚等。2004).

我们的研究小组采用了前列腺研究的实验模型长爪沙鼠沙土鼠。这种动物的前列腺叶彼此非常接近，因此，从解剖学上讲，与其他啮齿动物相比，腺体更紧密(Zanetoni&Taboga 2001年;佩戈林·德坎波斯等。2006). 此外，该模型对激素治疗有显著的反应(桑托斯等。2006;斯卡拉诺等。2006;奥利维拉等。2007)，抗前列腺增生药物(科拉迪等。2004)以及与衰老相关的自发性肿瘤的发展，后者是自发性肿瘤(Zanetoni&Taboga，2001年;佩戈林·德坎波斯等。2006).

根据先前关于沙土鼠前列腺的研究，本研究的目的是对老年沙土鼠腹侧前列腺自发病变的特征和分类，以评估其作为激素相关自发增殖性疾病前列腺微环境研究新模型的潜力。

材料和方法

结果

老年沙鼠前列腺的结构和超微结构

在形态和功能正常的情况下，一只老沙鼠的腹侧前列腺轮廓对应于一组由纤维肌间质包围的简单上皮形成的管腔结构(图1a). 在本研究中，这些前列腺区域被视为与年龄相关病变进行对比研究的对照。

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图1

血红素-曙红染色的老沙鼠前列腺。a： 前列腺腺泡总图（a）。上皮层（ep）和平滑肌细胞（SM）被一个巨大的上皮下胶原沉积（箭头）分隔开。上皮细胞保持合成活性，腺泡腔内有分泌小泡（箭头所示）。基质（S）。b： 前列腺腺泡中的前列腺上皮内瘤变（PIN）。上皮（ep）很厚，SM分布不规则，上皮基底部胶原沉积较大。请注意，上皮细胞在增殖聚集物内呈现肥大细胞（箭头）。正常上皮区（箭头所示）。c： 腺泡腔内有上皮皱褶的PIN。一些PIN成分呈现非典型表型，如细胞肥大、细胞质苍白和细胞核巨大（箭头）。肌肉层（SM）。d： 异常腺泡的详细信息，上皮细胞（箭头）和SM（箭头）分布发生改变。正常上皮（ep）；血管（V）。e： PIN由表现出非典型表型（细胞多形性）的细胞组成。腺泡腔内有晶体结构沉积（箭头所示）。f： PIN的细胞分层和核多形性细节。平滑肌层（SM）。g： gömöri的网状蛋白法。前列腺基质（S），PIN基底部网状纤维（箭头所示）明显增多。正常上皮（箭头）。h： 腺癌。由于较大腺泡内上皮细胞（箭头）的增殖和重排，可以观察到微腺泡（a）。基质（S）；血管（V）；平滑肌细胞；正常上皮区（箭头）；肥大细胞（双箭头）。i： 微创癌（MC）。痤疮（a）；上皮（箭头）；血管（V）；平滑肌细胞（SM）。j： 微小浸润癌细胞成分的详细信息。

前列腺组织病理学改变主要损害上皮室(图1b-i)在80%的分析动物中观察到。这些改变大多是增殖顺序的，涉及分泌细胞群中的稳态紊乱(图1b–h).

最常见的上皮改变是PINs，在分析的前列腺中占46.67%（14/30）。微创性病变的代表性较低，为26.67%（8/30），以癌和腺癌为特征。在基质中，20%（6/30）的标本发生细胞增生，且通常与异常上皮部位有关。根据国家癌症研究所人类癌症联合会前列腺指导委员会的小鼠模型开发的小鼠前列腺Bar-Harbor分类系统，完成了老年沙鼠前列腺病变的组织病理学分类(沙佩尔等。2004).

超微结构分析证实了传统光学显微镜的验证结果。在正常前列腺区，上皮细胞呈柱状细胞，细胞核呈细长形(图2a). 在这些部位，细胞极性保持不变，电子显微镜证实基底膜完整(图2a).

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图2

老年沙土鼠前列腺上皮的超微结构。a： 正常分泌上皮（ep）为典型的柱状细胞，细胞核与细胞形态相匹配。上皮被平滑肌层（SM）包围。基底膜（箭头）；基质（S）；血管（V）。棒材：15.12μm。b： 上皮细胞细胞质充满脂滴（ld）。靠近这些脂质沉积的是几个线粒体（黑色箭头）。注意，浓缩的染色质团主要沉积在细胞核外围（N）（白色箭头）。棒材：1.5μm。c： 分泌上皮细胞的顶端部分，腺泡腔内有小泡（sv）释放。细胞质中充满了合成的细胞器（箭头，RER）和脂滴（ld）。细胞质和腺泡腔中可见类似脂褐素的结构（箭头）。棒材：1.95μm。d： 具有丰富内质网（RER）和大量脂褐素样沉积物的上皮细胞的高倍镜（箭头）。细胞核（N）。棒材：1.16μm。e： 上皮细胞细胞质中的脂滴（ld）和丰富内质网（箭头）的详细信息。棒材：1.16μm。f： 增殖聚集物的非典型上皮细胞（ep）成分相互分离。细胞质和细胞核轮廓不规则（箭头）。细胞核（N）。棒材：3.25μm。g： 变性过程中的细胞表现出浓缩的染色质（箭头）。细胞核（N）。棒材：3.25μm。

此外，大多数上皮细胞呈现浓密的核染色质，主要分布在核周围的肿块中(图2b、d). 细胞质通常呈现大量脂滴(图2b–e)分散在整个细胞中。分泌上皮细胞具有独特的形态，在其顶端有丰富的合成细胞器和分泌小泡(图2c–e). 上皮细胞中经常发现类似脂褐素的嗜锇沉积物(图2c、d).

PIN码(图1b-g)其特征是细胞类型和形态结构可变，腺泡腔内上皮内陷加重(图1b、c)和/或细胞分层(图1e–g). 最后一个方面被观察到最终与部分简单上皮相关(图1b、d、g). PIN的细胞成分在同一增殖聚集物中表现出不同的表型(图1b-e)在不同的增殖部位。一些PINs也由具有明显细胞核和浅色细胞质的肥大细胞组成，似乎含有粘蛋白沉积物(图1b-e). PIN组分细胞保持分泌活性，但这些细胞释放的确切产物类型尚不清楚。

在微侵袭性癌中(图1i，j)细胞聚集物侵入周围基质，可能是基底膜破裂所致。大多数癌细胞细胞核深染，细胞质稀少，侵犯的间质中没有腺体形成(图1j). 在超微结构上，这些细胞的细胞核形态奇特(图2f)可以观察到一些正在经历退化过程(图2g).

在腺癌中，腺泡呈弥漫性扩张(图1h)病变附近可见不典型上皮细胞和基质细胞增多。在较大的腺泡内也观察到微腺泡的形成。这一事件可以通过分泌上皮细胞的增殖和重排观察到(图3a-c). 它们的分泌产物在这些新细胞排列形成的小管腔中释放(图3a-c).

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图3

老年沙土鼠前列腺癌的超微结构。由上皮细胞（ep）分隔的管腔（l）的微腺泡排列。注意，这些细胞存在明显的合成细胞器（箭头），主要由内质网代表。微绒毛（箭头）常见于细胞顶端。在微腺泡腔（l）中可以观察到神经酰胺样结构（星号）。消旋腔（L）。棒材，a:2.51μm；b： 1.16微米；c： 1.16微米。

在老动物腺泡中常见较厚的基底膜，在增殖部位，这种结构受到非典型细胞细胞质投射的永久压迫(图4a–d). 这些改变的上皮细胞在这种扩张中表现出局部粘连，这有助于细胞固定，暗示了这些细胞可能具有迁移能力(图4d). 通过基底膜破裂点证实了异常细胞的侵袭潜能(图4e，g)电子显微镜观察。

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图4

老年沙土鼠前列腺基质的超微结构。a： 前列腺上皮（ep）下方基质和（S）的大体视图。胶原纤维束分布在上皮基底部，并点缀着平滑肌细胞（SMC）。这些细胞的细胞核（N）突出，通常与其形状相匹配。基底膜（箭头）；成纤维细胞（F）。棒材：1.95μm。b： 带有厚基底膜（bm）的上皮-基质界面详图。后者表现为由上皮细胞（ep）的细胞质投射实现的压迫引起的波动（箭头）。棒材：0.9μm。c： 非典型上皮细胞（ep）的细节，细胞质扩张（箭头）压迫基底膜（箭头）。细胞核（N）；血管（V）。棒材：1.95μm。d： 上皮细胞的细胞质投影（ep），可观察到局部粘连（箭头）。位于上皮基底部的大胶原蛋白沉积（co）。弹性纤维（箭头）；基底膜（bm）。棒材：0.54μm。e： 胶原纤维（co）排列在不同的方向，与基底膜成分（箭头）相关。上皮（ep）；脂滴（ld）。棒材：1.5μm。f和g：基底膜结构（bm）可能破裂的区域（箭头），有利于前列腺基质内上皮细胞（ep）的侵入。胶原蛋白（co）。棒材，f:0.42μm；g： 0.42微米。h： 具有不规则细胞质和细胞核轮廓的平滑肌细胞（SMC）（箭头所示）。胶原蛋白（co）。棒材：1.95μm。

老年沙土鼠前列腺基质经历了与正常上皮和改变区域相关的重塑(图1a-i)这一事件在大多数被分析的动物中都很常见。

腺上皮基底部胶原纤维沉积显著增加(图1g)分布于平滑肌细胞之间，压迫平滑肌细胞。这些纤维组织成粗束，促进了基质纤维化的加重(图4a、d–f). 当与上皮病变相关时，其分布变得不规则(图1b–d)在一些腺泡中，上皮基底有无定形胶原沉积(图1b、d、g). 平滑肌细胞增多，与病变相关时形成松散不规则排列(图1b、d、h、i). 在某些情况下，平滑肌细胞在超微结构上呈现出外部和不规则的核轮廓(图4a).

定量分析

有关定量分析的数据显示在表1和​和2，2中的、和图5（a，b）对未受影响的老年动物（对照组）和前列腺组织病理学改变的老年动物进行对比分析，后者根据常见病变类型（PIN和HSA）分为两个亚组。在本分析中，携带腺癌的前列腺碎片不包括在内，因为在进行可靠统计分析所需的最小数量下发现了前列腺碎片。

表1

形态计量体视学数据在老年沙土鼠腹侧前列腺增生性病变中的价值

	组
前列腺测量	未受影响	增生基质区	前列腺上皮内瘤变	微创癌
隔间密度（%）
腺体上皮**	55.74 ± 13.52一	51.26 ± 13.05一,b	63.90 ± 13.40一,c（c）	内华达州
基质*	44.26 ± 13.52一	47.20 ± 14.51一,b	36.10 ± 13.40一,c（c）	内华达州
组织成分的体积（%）
上皮**	17.33 ± 5.53一	27.72 ± 6.99b	35.77 ± 9.48c（c）	内华达州
卢门**	38.41 ± 13.36一	23.54 ± 13.67b	28.13 ± 14.46b	内华达州
平滑肌细胞***	14.28 ± 7.15一	29.43 ± 6.75b	15.28 ± 6.23一	内华达州
Colagen上皮下层*	7.61 ± 5.36一	0.51 ± 1.74b	4.28 ± 4.28c（c）	内华达州
非肌肉间质	18.22 ± 11.10	17.26 ± 13.39	16.54 ± 10.50	内华达州
染色体测量数据
核面积（μm2)*	24.58 ± 5.47一	19.00 ± 3.41b	22.11 ± 6.45c（c）	20.19 ± 6.19b
核周长（μm）***	20.12 ± 2.53一	18.18 ± 2.10b	18.78 ± 2.82b,c（c）	17.64 ± 2.88b,d日
核形状系数*	0.76 ± 0.1一	0.73 ± 0.09b	0.78 ± 0.08一	0.80 ± 0.08c（c）

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NV，未验证。

数值表示为平均值±SD。

基于方差分析和Tukey测试。

^*P（P）≤ 0.01;

^**P（P）≤ 0.001;

^***P（P）≤ 0.0001.

^一不同的超指数表明组间存在显著差异。

^b不同的超指数表明组间存在显著差异。

^c（c）不同的超指数表明组间存在显著差异。

^d日不同的超指数表明组间存在显著差异。

表2

增殖和细胞死亡（凋亡）指数在老年沙鼠腹侧前列腺上皮增生性病变中的价值

组	增殖指数（PI）	凋亡指数（AI）	人工智能/PI
未受影响	0.021 ± 0.004一	0.062 ± 0.019一	0.034
前列腺上皮内瘤变	0.085 ± 0.018b	0.089 ± 0.021一	0.095
微创癌	0.162 ± 0.036c（c）	0.100 ± 0.040b	1.620

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数值表示为平均值±SD。

基于方差分析和Tukey测试。

P（P）≤ 0.05.

^一不同的超指数表明组间存在显著差异。

^b不同的超指数表明组间存在显著差异。

^c（c）不同的超指数表明组间存在显著差异。

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图5

a： 老年沙土鼠前列腺上皮病变中每核核仁数的百分比分布。b： 上皮细胞中核仁和核面积的比率。^{a、 b}不同的超指数表明组间存在显著差异。HSA，增生性基质区；PIN，前列腺上皮内瘤变。

两个改变组的腺上皮室平均比例与未受影响组无显著差异（55.74±13.52%）(表1). 在这些病变中，PIN患者前列腺区域的隔室变大，这一事实得到了上皮组织增加的证明，上皮组织是这种病变类型的特征。前列腺间质增生的区域通常与上皮改变有关，其上皮也相对于非病变区域增加。

改变组的腺泡腔减少，尽管分泌活性明显保持稳定，与病变类型无关(表1).

前列腺基质比例的体积密度在改变组和未受影响组之间没有差异(表1); 然而，与PIN相关的增生性基质部位中该间隔增加。基质扩张与平滑肌细胞的平均增加直接相关，与未受影响的平滑肌细胞相比，平滑肌细胞几乎增加了一倍。对照组动物的非肌肉上皮下基质较大，而在改变组中，该组织的纤维成分失去了上皮基底周围的典型分布。它们在细胞排列中随机分布。非肌肉相互作用间质在各组之间没有发生显著的振荡，其值保持在接近未受影响组的值（18.22±11.10%）。

与核型测量数据相关，病变显示细胞核面积和周长明显小于正常部位(表1). 在病变中，PIN与其他组相比核面积较大，而癌的周长最小。这些验证可能表明前列腺病变的分泌上皮细胞降低其转录核活性。形状因子虽然在各组之间没有显著差异，但其值大于0.7，表明在所有情况下，细胞核几乎是均匀的。

核仁行为分析表明，老年动物的主要表型是上皮细胞核中不明显的核仁(图5a)在HSA中，这一表型在统计学上更为突出。

旧对照组和PIN组的核仁面积测量值较大，而周长测量值在病变和对照组之间没有显著差异。核仁/核面积比(图5b)与其他组相比，PIN更大，其他组的值波动接近对照组。

随着病变的侵袭性，增殖和细胞死亡指数显著增加(表2;图6a–c和7a–c类). 在PIN中，两个过程之间的指数保持平衡，尽管在微侵袭性癌中，细胞增殖导致细胞凋亡减少，表明这些对立现象之间的稳态失衡，导致前列腺异常生长。

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图6

抗Ki-67免疫细胞化学。反染：苏木精。a： 正常上皮（ep）细胞核增殖界限很低；免疫反应核（箭头和棕色核）。b： 前列腺上皮内瘤变（PIN）（箭头所示）。c： 增生上皮（ep）细胞增殖增加。

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图7

TUNEL/苏木精。箭头表示就地前列腺上皮（ep）中DNA片段（凋亡细胞核）的检测。a： 正常上皮。b： 前列腺上皮内瘤变（PIN）。c： 癌症。

讨论

对老年沙土鼠腹侧前列腺自发增生病变的行为进行了评估，并证实上皮室是主要的组织病理学改变部位，能够攻击单个腺泡或腺泡群。在前列腺基质中，衰老与细胞成分和细胞外基质的增加和重新分布有关。

最常见的上皮性改变是PIN，其次是微创性癌，还有小得多的腺癌。PINs中的分泌上皮细胞大量增加，使得上皮室的相对频率可能达到60%以上。在18个月大时，46%的受试动物发现了某种程度的前列腺病变。ACI/Seg大鼠提供了另一种实验模型，该模型可在腹侧前列腺自发发展微小癌症，只有在33个月大后才会出现浸润性癌症(病房等。1980). 显然，沙鼠需要更短的时间来形成侵袭性自发病变，因为26%的分析动物在研究期间出现了微侵袭性病灶。此外，成年沙鼠长期服用睾酮可缩短该模型中出现肿瘤病变的时间(扎内托尼等。2005;斯卡拉诺等。2006).

关于啮齿动物前列腺癌发生的确切区域，研究人员之间存在很大的矛盾。在沙鼠和ACI/Seg大鼠中，腹叶对应于增殖性病变的主要起源和建立部位(病房等。1980).波拉德和勒克特（1992）表明小鼠前列腺改变开始于前叶和背外侧叶，而科恩等。(1994)认为肿瘤的传播始于这些动物的精囊。最近，遗传数据显示，小鼠前列腺背外侧叶与人类前列腺的外周区同源，而前列腺癌是最常见的区域(贝尔坎等。2005). 我们实验室已经评估了沙土鼠肺叶的特征，未来将更好地研究其在增殖性病变中的潜力。

前列腺上皮内瘤变的特征是异种上皮细胞聚集，可能具有非典型功能。在超微结构上，异常细胞的细胞核形态奇异，染色质边缘分布，细胞质中充满脂滴。细胞质突起向细胞外基质延伸，压迫基底膜。后者在某些区域出现破裂，表明异常上皮细胞具有侵袭潜能。因此，可以证实前列腺基质中的增殖聚集物确实是上皮来源的细胞。此外，我们实验室尚未公布的数据显示，患有化学致癌物诱发的前列腺浸润性病变的成年沙鼠，存在α-甲酰辅酶a消旋酶（P405S）的表达，这是前列腺癌细胞的一种新标记物。

沙鼠前列腺上皮细胞中发现的脂滴在老年小鼠和人类前列腺癌细胞系中也很常见(科恩等。1994;斯温宁等。2004). 脂肪生成增加是癌细胞的主要标志之一，而脂肪生成酶的基因编码子受雄激素调节。这一事件在肿瘤转化（PIN）的初始阶段和浸润性癌中同样多见，甚至在雄激素依赖性细胞中也持续存在(斯温宁等。2004).

在老年沙鼠的上皮细胞和基质细胞中经常观察到的亲血性结构类似于脂褐素和/或神经酰胺沉积。细胞内这些物质水平的增加似乎是衰老和细胞对应激因子反应中的常见事件(Hannun 1996年;Venable&Obeid 1999年). 在接受辐射的人LNCaP前列腺癌细胞中，神经酰胺的产生与激活凋亡细胞死亡有关(木村等。1999).

与其他前列腺癌模型和人类的情况不同，改变组（PIN、微创癌和前列腺基质增生）分泌细胞的面积、周长和核形态因子的测量值没有增加，表明老年沙鼠增殖性病变的核行为不同。此外，这种类型的孤立定量分析在帮助诊断老年沙鼠前列腺病变方面并不有效。在人类前列腺疾病中，核参数在区分不同Gleason程度的腺癌方面也无效，但在比较前列腺增生和腺癌方面有效(马丁内斯·贾巴洛亚斯等。2002;塔博加等。2003).

核仁DNA含量是功能状态和细胞增殖程度的指标(2000年特雷;卡拉扬等。2004). 在老年沙鼠前列腺中，PIN和癌中的核仁小体数量略有增加，而在前列腺间质增生中，几乎70%的细胞核没有明显的核仁。至于该细胞器的面积和周长参数，PINs表现出较高的核仁/细胞核比率，这表明核仁总大小增加，并且可能在这些区域具有更大的细胞代谢活性。据推测，在获得侵袭潜能后，细胞会降低其转录活性，限制其代谢以维持复制过程。大多数上皮病变中核仁的最小变化行为仍然意味着这些肿瘤的侵袭性较小。与这些数据一致，没有一只分析过的老动物出现转移性病变或完全损害前列腺功能的病变。

此外，随着老年沙鼠组织病理学改变变得更加严重，增殖和细胞死亡指数表明细胞更替更大。在人类和小鼠身上，也发现了类似的细胞动力学事件(伯吉斯等。1995;谢等。2000).

在PIN中，增殖和细胞死亡过程之间存在平衡，而在癌中，细胞增殖指数超过了凋亡指数。前列腺癌患者对凋亡细胞死亡的抵抗力降低或增强似乎是一种常见的情况，而这种因素会加速肿瘤的生长(奥尼尔等. 2001;舒尔茨等。2003).

在衰老过程中导致前列腺组织内稳态失衡的事件中，雄激素水平的改变是其中之一。虽然很少有研究真正证明血清睾酮水平与前列腺癌之间存在显著关系，但大多数研究表明这两个因素之间存在关联(兴等。, 2002)包括沙鼠。在这些啮齿动物中，成年动物的平均血清睾酮水平为4.82 ng/ml，而在老年动物中，这些值降至2.80 ng/ml(佩戈林·德坎波斯等。2006). 雄激素受体在所有组织学类型的前列腺癌中都有表达，而这些受体基因的体细胞突变在人类肿瘤中很常见；这些突变可能与肿瘤的进展和侵袭性有关(谢尔等。2004).

沙土鼠前列腺基质也发生了与衰老相关的改变，主要发生在异常上皮附近的区域。在这一过程中，胶原蛋白纤维明显增多，表现为促结缔组织增生过程。这种类型的基质反应在许多癌症类型中很常见(罗伯特2002). 细胞外基质的解体和重塑可能有利于上皮细胞在基质中的分散。此外，恶性转化与细胞外基质的组成和结构密切相关，据信肿瘤细胞可以改变基质成分的产生和降解，有利于迁移过程(罗伯特2002).

在大多数已知的啮齿动物模型中，自发性前列腺癌的发生相对罕见。由于这是一种与衰老有关的疾病，推测实验动物的预期寿命可能太短，无法有效地安装和进化这种疾病类型(Pollard&Luckert 1986年;班纳吉等。1998). 然而，模型系统是获得前列腺癌发病机制、进展和治疗方面更多知识的基础(希赖等。2000). 虽然老沙鼠没有出现侵袭性前列腺改变的高频率，但PIN在这些动物中相当一部分是常见的。由于这些病变被认为是前列腺癌的前兆，因此对其细胞和分子成分进行更详细的分析就足以证明沙鼠是研究前列腺癌前病变的良好实验模型。此外，具有上述特征的衰老沙鼠肿瘤系统似乎有助于研究其发病机制和开发治疗方法。

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