国际实验病理学杂志。2008年2月；89(1): 38–44.
三种不同方法建立转移性脑肿瘤模型的比较：软脑膜的形态学作用
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斋藤北彦
*日本东京东吴大学医学院神经外科第二系
†日本东京东吴大学医学院外科病理学系
青木株式会社
*日本东京东吴大学医学院神经外科第二系
*日本东京东吴大学医学院神经外科第二系
†日本东京东吴大学医学院外科病理学系
‡上海中医药大学组织胚胎学系
通信：Norihiko Saito，MD，PhD，神经外科第二系Toho大学医学院2-17-6，Ohashi，Meguro-ku Tokyo Japan电话：81-3468-1251传真：81-346 8-2960电子邮件：pj.ca.u-ohot.dem.botiasb公司 2007年5月12日收到；2007年9月7日接受。
版权©2007 The Authors Journal编译©2008 Blackwell Publishing Ltd 摘要
随着癌症诊断和治疗方法的进步，人们对转移性脑肿瘤的兴趣不断增加。有许多研究使用不同的动物模型方法，我们认为由于大脑的独特组成，每个模型反映了不同的病理过程。我们用三种不同的方法制备了转移性脑肿瘤模型。在这项研究中，我们试图阐明软脑膜在脑转移中的作用。转移灶呈血管中心型，形成肿瘤细胞的衣领，被称为“血管周围增生”。此外，我们观察到肿瘤细胞浸润大脑实质，其边界变得模糊。这些被标记为“侵袭性增殖”。颈内动脉注射模型反映了血源性转移。在这个模型中，观察到血管周围和侵袭性增生。鞘内注射模型反映了软脑膜癌病。在这个模型中，观察到脑膜转移。在立体定向注射模型中，观察注射部位肿瘤增殖和脑实质浸润。当肿瘤细胞扩散到血管周围间隙形成血管中心模式时，胶质膜充当支架。脑胶质膜位于脑实质和血管之间。血管通过被软脑膜覆盖的血管周围空间穿透大脑。我们准备的三种不同方法反映了三种不同的病理过程。我们的发现表明软脑膜是脑转移的关键因素。
关键词：动物模型、脑转移、血源性转移、血管周围间隙、软脑膜
最近，脑转移瘤患者的数量有所增加。随着癌症诊断和治疗方法的进步，人们对转移性脑肿瘤的兴趣不断增加。大脑中肿瘤细胞的增殖有时可以通过延长生存期的治疗来控制；然而，延长生存时间可能会为脑转移提供更多机会(Kindt 1964年;纽金特等。1979).
血源性转移是脑转移的常见途径，模拟这一过程的动物模型对于理解脑转移的发病机制和治疗至关重要。
有许多研究使用不同的动物模型方法(夏皮罗等。1979;吉田等。1986;弗兰克等。1988;Schackert&Fidler 1988年,1989;藤卷等。1993;基姆等。2004;门德斯等。2005)我们认为，由于大脑的独特组成，每个模型反映了不同的病理过程。
血管通过软脑膜覆盖的隧道穿透中枢神经系统，形成血管周围空间(威廉姆斯等。1995;Gartner&Hiatt 2001年;乌拉布等。2002;朱奎拉等。2005). IV型胶原是基底膜的主要成分之一(威廉姆斯等。1995;Gartner和Hiatt 2001;乌拉布等。2002). 由软脑膜和血脑屏障组成的功能屏障阻止某些物质从血液中通过(Junqueura公司等。2005).
我们用三种不同的方法制备了转移性脑肿瘤模型。在这项研究中，我们试图阐明软脑膜瘤在脑转移中的作用。
材料和方法
老鼠
从Charles River Co.（日本横滨）购买的8至9周龄C57BL/6Ncrj雄性小鼠，按照该机构的实验动物护理和使用指南，在东吴大学医学院的动物护理设施进行饲养和护理。该实验方案由东吴大学医学院动物研究委员会（ARC/TUSM）批准。
肿瘤细胞系与细胞培养
本研究中使用的3LL（Lewis肺癌）肿瘤细胞系来自东北大学生物医学研究细胞资源中心。
细胞保存在添加有10%胎牛血清（FCS；Hyclone Laboratories，Logan，UT，USA）的RPMI-1640培养基（美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司）中，并在37°C的空气中5%CO2的增湿环境中培养。
肿瘤细胞注射用制剂
接种物的体积和浓度分别为0.1 ml和3×105/ml。
颈内动脉注射
小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，并通过背部位置固定在软木板上。为了稳定头部和颈部，在上颚的牙齿和伸直的宫颈之间放置了丝线。在手术中，使用70%乙醇对颈部进行消毒，并在中线切开。右颈动脉和迷走神经位于二腹肌和胸骨肌之间。通过从颈总动脉到颈内动脉和颈外动脉分叉点的钝性解剖暴露动脉。在颈总动脉的远端和近端放置两条5-0丝线材料结扎。首先，近侧被绑紧，而远端被绑松。用显微镜划痕动脉，并将玻璃套管插入动脉腔内。缓慢注射0.1 ml接种物，然后取出套管。远端结扎被拉紧，皮肤被缝合。所有手术都是在显微镜下进行的(n个= 5).
鞘内注射
小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。用30号针头刺穿小鼠大池，并注射0.05 ml细胞悬液。
立体定向注射
小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。我们稍微修改了夏皮罗描述的注射方法等。(夏皮罗等。1979). 简单地说，0.01 ml细胞悬液是通过连接在Hamilton注射器上的30号针头输送的。将针头插入冠状缝背侧3mm和矢状缝外侧3mm的深度。
组织取样
注射7天后，这些动物开始出现诸如头部倾斜等神经症状。在这项研究中，小鼠在第9天被杀死。为了进行组织学研究，将大脑从颅腔中取出，保存在4%多聚甲醛固定剂中过夜，然后嵌入石蜡中(n个＝6）。
组织学观察
通过苏木精和伊红（H&E）染色进行组织学观察。
电子显微镜
通过腹膜内注射戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，然后对主动脉进行插管。用生理盐水灌流小鼠5分钟，洗去血细胞，然后用磷酸盐缓冲固定剂（1%戊二醛和2%多聚甲醛，置于pH 7.3的0.1M磷酸盐缓冲液中）灌流15分钟。灌流后，将大脑从颅腔中取出，保存在固定剂中。
然后对大脑进行电子显微镜检查。使用JEM-1200EX-II（日本东京JEOL）检查超薄切片(n个=5，每个）。
结果
显微镜观察
颈内动脉注射
脑转移灶位于无核运动皮质区的深皮质、体感皮质、后边缘区和Ammon角（CA1～CA3）。它们由皮质动脉的皮质深支和皮质下动脉的侧支灌注(阿基玛等。1986;野中弥弥等。2003年a,b,c（c）); 白质内未见转移灶().
（a） 颈内动脉注射脑转移的宏观表现（H&E染色）。脑转移瘤灶位于后边缘区和阿蒙角，以及无核运动皮层和体感皮层。（b，d）转移灶位于血管周围病变。（c） 侵袭性增生，肿瘤细胞浸润脑实质，边界模糊。
这些病灶位于血管周围病变(). 转移灶呈血管中心型，形成肿瘤细胞的衣领，被称为“血管周围增生”。
此外，我们观察到肿瘤细胞浸润大脑实质，其边界变得模糊。这些被标记为“侵袭性增殖”(). 与血管周围增生一样，在无颗粒运动皮层区、体感皮层、后边缘区和Ammon角（CA1～CA3）观察到侵袭性增生。
脑转移灶形成于第三脑室和侧脑室的脉络丛。然而，肿瘤细胞局限于脉络丛，而室管膜上皮没有解体().
鞘内注射
在大脑底部观察到脑转移灶(). 脑膜转移是在这个部位形成的。肿瘤细胞未浸润脑实质()但也观察到从大脑表面侵入大脑实质的皮质动脉的血管中心型().
（a） 鞘内注射脑转移的宏观表现（H&E染色）。在脑底部观察到脑转移灶。（b） 观察到脑膜转移。（c，d）转移灶显示“血管周围增生”。
脑转移灶形成于第三脑室和侧脑室(). 此外，在远离表面的脑实质中观察到许多小的转移灶，主要位于Ammon角(). 这些转移灶显示“血管周围增生”，无浸润().
立体定向注射
在注射部位，转移灶沿穿刺方向形成()肿瘤细胞浸润脑实质().
（a） 立体定向注射的宏观表现（H&E染色）。（b，c）侵袭性增殖。（d） 立体定向注射的血管周围增生。
在肿瘤与脑实质交界处稍远处观察到小的转移灶。这些部位显示血管周围增生(). 此外，在注射部位以外观察到大量转移灶，且无连续性(). 这些病变不仅见于皮质，而且广泛延伸至髓质和基底神经节().
（a） 注射部位远处转移的宏观表现（H&E染色）。（b，c，d）这些病变不仅见于皮质，而且广泛延伸至髓质和基底神经节。
电子显微镜观察
鞘内注射
在血管周增殖中，肿瘤细胞局限于血管周间隙。胶质细胞膜、血管内皮细胞和紧密连接在形态学上完好无损，未观察到脑实质浸润().
电子显微镜观察。（a） 鞘内注射在血管周围增殖时，肿瘤细胞局限于血管周围间隙。（b） 立体定向注射。在血管周围间隙和穿过胶质膜的脑实质中均观察到肿瘤细胞。
立体定向注射
在血管周增殖过程中，在血管周间隙和脑实质中，通过胶质膜可以观察到肿瘤细胞。在这个区域，pia-胶质膜是完整的，肿瘤细胞粘附在pia-神经胶质膜上().
致谢
我们感谢东吴大学医学院第二神经外科和外科病理学系的所有成员，感谢他们的合作，感谢Toshie Shimozeki和Akira Maeda的技术支持。
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