体内结直肠癌肝转移早期发展模型

摘要

一项欧洲研究估计，2004年诊断出290万癌症病例，170多万癌症死亡。诊断出的第二大常见癌症是结直肠癌，占所有病例的13.2%。结直肠癌导致203700人死亡(Boyle&Ferlay 2005年). 只有肺癌导致了更多的癌症死亡。在全球范围内，每年有近100万例结直肠癌病例登记，近50万人死于这种疾病(帕金等。2001). 在确诊时，多达25%的结直肠癌患者已发生肝转移(卡沃利乌斯等。1996). 结直肠肿瘤的原发部位通常通过单独手术或结合新辅助剂和辅助肿瘤治疗进行管理(纳尔逊等。2001). 管理转移到其他器官的转移是一个治疗挑战。尽管在播散性结直肠癌的肿瘤学治疗方面取得了进展(Allegra&Sargent 2005年;十二等。2005)肝转移瘤的外科切除仍然是唯一能提供长期生存和治愈可能性的治疗手段(Mutsaerts公司等。2005). 这种治疗方案取决于患者和肿瘤的特征。对许多人来说，这不是一个可行的选择(谢勒等。1995).

活体内视频显微镜（IVVM）现在可以动态实时成像体内模型系统(图1). 这项技术已被证明在研究肿瘤血流和血管破裂剂的治疗效果方面特别有用(伊加等. 2006). IVVM已使结直肠癌转移的早期发展，尤其是肿瘤细胞的阻滞、粘附和外渗得到了详细的分析(表1). 为了准确研究针对这些早期阶段的新型治疗药物体内必须建立与真实肿瘤发展过程非常相似的模型。

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图1

（a） 活体内视频显微镜（IVVM）图像显示大鼠肝循环内标记的红细胞。可见肝小静脉。（b） 这张图像显示标记的红细胞主要位于肝窦内。（c） 肝实质具有标记为（D）的绿色自发荧光。窦状血管为黑色（E）。看到三个标记的（红色）结直肠癌细胞–（A、B和C）。（A） 粘附在正弦形壁上。另外两个（B&C）已经从窦状血管迁移到肝实质。

本次审查的目的是检查当前体内结直肠转移模型。它将分析当前的模型，重点关注所使用的不同技术。通过概述和分析肿瘤细胞的制备、引入和监测体内，本次审查将深入了解可能发生的问题。还将讨论不同技术对改变所描绘的转移图像的影响。

转移模型

体内所部署的模型应真实反映癌症患者的生理过程。早在1889年，就有人提出转移是以非随机模式发生的。事实上，这是斯蒂芬·佩吉“种子与土壤”假说的基础(佩吉特1889). 这一假设以及转移过程在过渡时期得到了深入研究。“种子和土壤”假说已经被采纳，现在由三个独立的实体组成(Onn&Fidler 2002年;菲德勒2003). 首先，癌症由不同的细胞亚群组成，每个亚群都有自己的表型。当前研究(包等。2006;奥布莱恩等。2007)正在密切检查这些细胞亚群，以确定是否每个癌细胞都具有启动和维持肿瘤生长的能力，或者是否只有一部分细胞，即癌干细胞，具有这种潜力。奥布莱恩等。(2007)在免疫缺陷小鼠宿主移植后发现人类结肠癌诱导细胞。所有人结肠癌起始细胞均为CD133+。大多数肿瘤细胞为CD133−，无法启动肿瘤生长。包等。(2006)在胶质瘤中，也鉴定出CD133+细胞。胶质瘤内在体外和体内发现这些CD133+细胞中有较高比例能够在电离辐射下存活。这些CD133+细胞被发现在放射治疗后比CD133−细胞更有效地启动DNA修复。这些结果表明CD133+细胞对胶质瘤具有放射抗性，并可能导致放射治疗后肿瘤复发。这些结果表明可能存在癌症等级。只有一部分肿瘤细胞可能与肿瘤增殖有关。这些干细胞也可能是常规肿瘤治疗后肿瘤复发的原因。通过针对这些肿瘤干细胞的靶向细胞毒治疗，肿瘤管理可能会取得重大进展。其次，转移过程对具有栓塞、侵袭、粘附、渗出和建立远处器官转移能力的肿瘤细胞具有选择性。最后，转移需要肿瘤细胞和邻近微环境的调节机制之间的多重相互作用(利奥塔和科恩2001;菲德勒2002b).

修正后的假设提供了一个框架体内模型应该坚持。偏离这些原则将导致生理紊乱(图2)并对转移发展产生不准确的反映。不仅会得到扭曲的图像，而且该模型对于准确评估治疗干预措施无效。安体内模型反映了真正的转移过程，这将使我们能够研究和更好地理解转移的每个阶段。准确的模型也将有助于制定具体的治疗干预措施，并能够分析这种干预措施的临床效果。

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图2

此图以图形方式描述了转移过程，重点放在早期阶段。最初，位于原发位点的结直肠癌细胞增殖。随后，这些恶性细胞变得具有侵袭性，并采用迁移表型。如果侵入过程成功，肿瘤细胞将进入循环。体内，结直肠癌细胞可以通过血液或淋巴方法转移。为简单起见，只讨论了血源性传播。最近许多国家利用血源性传播途径体内中显示的研究表1癌细胞随后通过门静脉循环被输送到肝脏，在那里，窦是直径最小的血管。图中描述了两种不同的肿瘤细胞阻滞方法——机械包埋法和特异性肿瘤细胞粘附法。在首次被捕后，也有证据支持不同的早期转移发展方法。肿瘤细胞可以外渗到实质并随后增殖，也可以在血管内进行最初的增殖，然后再进行肝脏浸润。如果肿瘤细胞成功地完成了这些阶段，它们就会在新的环境中增殖，并可能发展成肉眼可见的肝转移。

大肠癌细胞系的筛选

也许是影响生物准确性的最重要因素体内模型是选择合适的大肠癌细胞株。一些研究利用了协同作用的结直肠癌细胞系(赖因穆特等。2003;施泰因鲍尔等。2003;Sturm公司等。2003)，其他人则比较了协同线和非协同线(海尔等。2003)而其他人则在Sprague–Dawley宿主中部署了非失能性人类结直肠癌细胞(Enns公司等。2004,2005;Schluter公司等。2006). 回到“种子与土壤假说”，第三个原理指出肿瘤细胞与微环境和稳态机制相互作用(菲德勒2003). 使用人类结直肠癌细胞在大鼠肝脏中发生转移的癌症模型的生物学准确性受到质疑。尽管人类HT29结直肠癌细胞和大鼠CC531结直肠癌细胞之间的比较在30分钟的观察期内没有显示出差异(海尔等。2003)大鼠和人的肝脏结构和稳态机制之间的差异可能会产生转移发展的扭曲图像。因此，协同模型有可能提供更准确的转移发展表示。

培养细胞系存在表型漂移问题。目前的大肠杆菌细胞系经常经历多次传代。例如，由欧洲细胞培养库提供的HT29人类结直肠癌细胞已经经历了135次传代。在不同实验室和不同国家进一步培养这些细胞可能会改变肿瘤细胞的特性。随着表型漂移的发生，从最初来源于同一细胞群的结直肠癌细胞中可以获得不同的肝转移发展表现。

移植方法

“种子和土壤假说”指出肿瘤是异质细胞群；选择发生在转移建立过程中，肿瘤和微环境发生相互作用(菲德勒，2002;菲德勒2003). 许多最近的模型都使用了培养的结直肠癌细胞在体外结直肠癌细胞用钙黄绿素标记(海尔等。2003;施泰因鲍尔等。2003;Enns公司等。2004,2005)或转染绿色荧光蛋白（GFP）(施泰因鲍尔等。2003;Sturm公司等。2003)在引入动物之前。然后将肿瘤细胞导入动物的循环中(图2)模拟血源性结直肠癌在患者体内的扩散(海尔等。2003;施泰因鲍尔等。2003;Enns公司等。2004,2005). 该模型在“种子和土壤”假设的第二个原理方面存在本质缺陷(菲德勒2003). 虽然引入的结直肠癌将是异质性人群，肿瘤细胞与微环境之间会发生相互作用，但没有发生选择性。在人类患者中，到达血流并扩散的结肠癌细胞已经表现出许多侵袭性或转移性特征。相反，经过传代的大肠细胞在体外没有表现出这些特征。因此，目前的转移模型可以描述一种早期转移发展模型，其效率远低于人类结直肠癌患者。基因工程动物能够自发地发生癌症和随后的转移，是最准确的转移生物学模型。Smad3突变小鼠被证明患有转移性结直肠癌(朱等。1998). 后续组(菲利普·斯塔赫利等。2002;多米诺牌手表等。2007)用这些小鼠研究了影响结直肠癌发展的不同因素。然而，这些模型不适用于活体显微镜——实时观察肿瘤发展的重要工具。肿瘤细胞必须贴上标签才能检测到体内.

直接引入血液会抵消免疫监测的效果。由于免疫系统需要时间来检测和处理新引入的细胞物质，因此通过血源性团注不同程度地引入肿瘤细胞来人为挑战生理免疫监测机制。物种间和物种内个体间免疫反应的差异可能是肿瘤自然史中实验性差异的原因。最近利用原位肿瘤模型在雌性BALB/c小鼠中检测人类结直肠癌的研究(扁平标记等。2004). 植入了12株结直肠癌菌株。结果表明，细胞系之间在肿瘤的增殖和传播方面存在很大差异。十二个结直肠癌细胞系中有一个产生了肝转移，而这只发生在十只动物中的两只。虽然结直肠癌细胞引入的方法不同-原位与血源性免疫监测和清除正在发生。这一理论得到了其他原位研究的进一步支持。一项针对HT29人类结直肠癌细胞的进一步研究产生了类似的结果(扁平标记等。2004)在免疫活性小鼠中(吉尔鲍德等。2001). 然而，在免疫抑制严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中，淋巴结转移和肝、肺转移的发生率明显较高。在较长的血源性实验模型中也观察到了免疫反应。CT26协同小鼠结直肠癌细胞导入BALB/c小鼠宿主(施泰因鲍尔等。2003). 对转移发展进行监测，并对GFP标记的细胞和传统技术标记的细胞进行比较。早期转移发展无显著差异。然而，表达GFP的CT26结直肠癌细胞的晚期转移生长明显减少。这种现象只在免疫活性小鼠中发现。对免疫缺陷小鼠的进一步实验表明，这种癌细胞清除是免疫介导的。在先前健康的结直肠癌患者中，尽管对免疫功能正常的患者进行了免疫监测，但仍会发生结直肠癌的发展和传播。突然推出1×10⁶结直肠癌细胞(海尔等。2003;Enns公司等。2004,2005)进入循环并不能准确描绘肿瘤细胞的播散。相反，引入的速度将允许至少在初始阶段逃离免疫系统。这可能在一定程度上解释了为什么人类HT29大肠杆菌细胞和大鼠CC531大肠杆菌癌细胞以造血方式导入Sprague-Dawley大鼠(海尔等。2003)在30min的观察期内，两种细胞系的粘附性能没有发现显著差异。细胞团的引入和实验持续时间的缩短将防止免疫监测影响肝转移早期的发展。在更长的实验中，这两种肿瘤细胞系的生长可能存在显著差异。在啮齿动物宿主中，人类癌细胞系更有可能被识别为异物，并引发免疫反应。这种反应可能会抑制转移的发展。

对于血源性或原位引入结直肠癌细胞是否能提供更准确的模型，仍存在争议。原位植入术(吉尔鲍德等。2001;赖因穆特等。2003;Sturm公司等。2003;扁平标记等。2004)从种子与土壤假说的原理来看，很可能描绘出更准确的转移过程。允许结直肠癌细胞的异质性群体建立自身。选择将发生在整个传播过程中，并发生肿瘤微环境相互作用。缺点是，这种植入过程使得对早期转移发展中事件的分析难以准确分析。机械陷阱的两种理论(瑙莫夫等。1999;钱伯斯等。2001;麦当劳等。2002)和细胞特异性粘附(海尔等。2003;Sturm公司等。2003;Enns公司等。2004,2005)已被提议用于肝脏微循环中的结直肠细胞阻滞。还描述了肿瘤细胞外渗前血管内增殖的模型(阿尔·梅赫迪等。2000;斯特姆等。2003). 准确分析上述步骤需要在任何特定时间点循环中有大量肿瘤细胞。细胞团，引入造血细胞体内模型，使得分析转移发展的早期步骤变得更加容易。在原位模型中，任何给定时间点循环中的肿瘤细胞数量将显著少于血源性丸。此外，在原位模型中，将肿瘤细胞引入循环将更加不稳定。观察和实验将延长。这不仅会增加观测误差和变异，从而降低统计有效性，而且会出现宿主正常生理参数保存方面的问题。

在血源性模型中，钙黄绿素AM经常用于标记结直肠癌细胞(海尔等。2003;Sturm公司等。2003;Enns公司等。2004,2005). 这些实验的主要重点是研究转移发展的早期阶段——肿瘤细胞阻滞、粘附和外渗。这些实验时间很短，从几分钟到几小时不等。钙黄绿素AM不仅是一种有效的细胞标记物，而且对肿瘤细胞没有任何生理作用。从肿瘤细胞标记的角度来看，原位模型中肿瘤细胞阻滞、粘附和外渗的研究更为困难。原位实验延长，涉及结直肠癌细胞分裂。这种细胞分裂导致钙黄绿素AM和纳米球荧光探针出现问题(麦当劳等。2002)这将在下一节中讨论。为了优化肿瘤细胞信号，必须使用GFP或外源性给药聚合物底物。长期实验表明GFP可以刺激免疫反应(施泰因鲍尔等。2003). 结直肠癌细胞从原位种植的原发部位播散后，肝脏的早期转移可能受到影响。替代标记技术涉及聚合物底物的造血给药(韦斯莱德等。1999). 造血聚合物可能影响早期转移发展。这种技术(魏斯勒（Weissleder）等。1999)与单个细胞相比，它更适合标记转移瘤，并且与高背景肝脏荧光有关(霍夫曼2002).

使用的宿主和手术技术

迄今为止，大多数体内研究结肠直肠肝发育早期阶段的模型使用啮齿动物(表1). 为了发生转移，引入的肿瘤细胞和啮齿动物肝脏之间发生了多种相互作用。为了确保准确的临床图像，应选择与这些宿主相当的细胞系。稍后将对此进行更详细的讨论。这些早期模型最多只能提供人类转移过程的一些表示，因为物种之间没有密切的相关性。因此，高等灵长类动物的模型可能提供更准确的表示。然而，更高级的灵长类动物研究尚未出现。

宿主，特别是用于建立实验模型的技术，会影响转移模型的有效性。目前的许多工作都依赖于主人在麻醉下进行腹部切口(海尔等。2003;赖因穆特等。2003;施泰因鲍尔等。2003;Sturm公司等。2003;Enns公司等。2004,2005). 麻醉和手术压力为转移模型引入了新的变量。此外，随后对肝脏的暴露，包括IVVM观察的动员和部分外化，可能会扭曲转移的发展(海尔等。2003;施泰因鲍尔等。2003;Sturm公司等。2003;Enns公司等。2004,2005). 肝脏的这种动员有能力破坏结肠直肠细胞的肝脏结构和微环境。微循环中的血管很容易被压缩。一些人对此进行了争论(Enns公司等。2005)这种压迫可能是肿瘤细胞机械性包埋的部分原因(库普等。1995;瑙莫夫等。1999). 动员期间持续的创伤也可能引发炎症反应，这将为转移模型增加另一个变量。结肠直肠癌细胞导入所需的血管插管已认识到并发症及其对动物宿主和导入细胞系的影响(吉川等。2002;海尔等。2003;施泰因鲍尔等。2003;Enns公司等。2004,2005). 这些问题以及由此导致的转移发展扭曲在较小的啮齿动物中可能更为显著。在小鼠中，组织更易碎，肝脏的活动会导致更严重的创伤。在实验过程中，动物宿主的正常生理参数可能会发生变化，而在较小的宿主中，这种变化会再次被夸大。除了麻醉和剖腹手术带来的压力外，实验期间可能会出现昏迷、低血容量和体温过低带来的进一步压力。即使对脉搏、平均动脉压、脉搏血氧饱和度和温度进行密切监测，并遵守协议以保持正常参数的值，这充其量也是一个人工系统。另一个需要考虑的宿主因素是免疫状态。长期实验表明，免疫系统可以发挥关键作用(吉尔鲍德等。2001;施泰因鲍尔等。2003;扁平标记等。2004). 用于容纳异种细胞系的SCID动物宿主大大改变了正常的生理标准(吉尔鲍德等。2001).

肿瘤细胞导入方法对转移发展有显著影响。早期模型使用经肠系膜静脉的门脉内途径(卢齐等。1998;瑙莫夫等。1999;丁等。2001;伊藤等。2001;吉川等。2002;施泰因鲍尔等。2003). 这种引入方法不仅导致通常低压系统的瞬态中断，而且可以解释机械卡阻现象(丁等。2001;伊藤等。2001). 机械包埋理论认为，当较大的肿瘤细胞滞留在微循环血管中时，就会发生肿瘤细胞阻滞。许多人认为这是人为的，因为肝脏结构受压或循环中断。无论肿瘤细胞阻滞是由于机械包埋还是细胞特异性粘附，这些模型都提供了有关癌细胞外渗和癌细胞在外来环境中生长的有用信息(卢齐等。1998;瑙莫夫等。1999;丁等。2001;伊藤等。2001;吉川等。2002;施泰因鲍尔等。2003). 然而，阐明肿瘤细胞阻滞的机制非常重要。如果肿瘤细胞由于尺寸限制（机械性包埋）而被困在微循环中，那么创造一种抑制这种情况的治疗干预措施是徒劳的。如果，正如许多人所说(丁等。2001;伊藤等。2001)细胞特异性粘附是导致肿瘤转移的主要原因，针对相关分子的治疗干预可能会显著损害肿瘤转移的发展。机械诱捕是人为的这一论点得到了以下研究结果的有力支持：海尔等。(2003).他们的体内引入的模型1×10⁶细胞置于1 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中。经颈静脉引入静脉肿瘤细胞可能导致心肺功能障碍。注意到由于短暂的剧烈压力变化，门脉内注入导致肝脏生理性破坏。首选的引入方法是经颈动脉的动脉。与其他方法相比，IVVM能最大限度地减少生理性破坏，在肝循环中观察到的粘附细胞数量更多。通过一系列实验(海尔等。2003;Enns公司等。2004,2005;Schluter公司等。2006)这组研究表明，结直肠癌细胞仅粘附在转移的靶器官中，并且这种情况发生在直径大于结直肠癌癌细胞的血管中。对原始车型的改装(海尔等。2003)已经证明阻断特定整合素可以显著降低结直肠癌细胞的粘附(Enns公司等。2004,2005)和迁移(Enns公司等。2004). 这些模型清楚地证明了由细胞表面受体介导的特定结肠器官靶向性。最近，对不同转移潜能的结直肠癌细胞系的比较表明，迁移率与转移潜能相关(Schluter公司等。2006).

赖因穆特等。(2003)创建了一个体内使用小鼠宿主和小鼠结直肠癌细胞系建立模型。肿瘤细胞被导入脾内以诱导转移。给予整合素αvβ3的肽抑制剂S247可延长生存期，减少结肠直肠癌转移和血管生成。像这样的模型有助于阐明与转移建立和发展有关的基本过程和分子。虽然在远亲物种中发现，但它们提供的见解对于加深对转移过程的了解和发展高度特异性的癌症靶向治疗至关重要。

标签

为了能够在活体显微镜下观察结直肠癌细胞，必须对细胞进行适当的标记。传统标记方法使用了各种组织化学标记基因——大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（Lac Z），果蝇属乙醇脱氢酶基因和人胎盘碱性磷酸酶基因。使用病毒载体将其克隆到真核细胞中。随后使用适当的染色方法对细胞进行分化(林等。1990;Lin&Culp 1991年). 尽管这些标记物有利于分析培养系统中的细胞，但需要细胞染色，因此需要牺牲动物。这些技术对于动态体内评估癌症进展。

已经发生了对传统标记的适应。特别是Lac Z标签系统的修改允许体内β-半乳糖苷酶活性的实时检测(东等。2004). 这些适应性利用复杂的合成接枝聚合物。当被目标蛋白酶裂解时，蛋白质在光谱的红外区域变为荧光(魏斯勒（Weissleder）等。1999;东等。2000;陈等。2002). 聚合物底物可适应特定蛋白酶。由于许多蛋白酶具有细胞特异性，因此可以监测特定的癌细胞。虽然专门标记动物的靶细胞，但该系统仍有一些局限性。该系统依靠静脉输液(菲格雷多等。2006)红外探针进入动物宿主，这需要非选择性地递送到动物器官。由于肝细胞内蛋白酶丰富，人们表达了担忧(霍夫曼2002)关于高肝背景荧光。转移发展的研究包括监测单标记癌细胞在肿瘤细胞阻滞、粘附和外渗过程中的变化(海尔等。2003;Enns公司等。2004,2005). 肝脏的高背景荧光将阻碍对肝转移发展的准确分析。研究结肠转移发展早期阶段的实验模型经常使用肿瘤细胞扩散的血源途径来模拟血液传播的肿瘤扩散。通过静脉输液传递红外线探针可能会扭曲实验模型中的生理图像。不仅输注量大，而且将异物同时引入血流中，使其进入结肠肿瘤细胞，很可能无法准确描述转移过程。最近的研究(Enns公司等。2004,2005)显示注射后几分钟内，肿瘤细胞粘附在肝脏微循环中。由于底物传递到细胞和底物的细胞加工，用于酶切的底物的传递在肿瘤细胞发出荧光之前会有延迟。这使得该方法不适用于转移发展的早期阶段。另一种肿瘤细胞标记方法使用荧光素酶基因，该基因涉及底物的外源递送(斯威尼等。1999). 该标记基因已被转染到人类癌细胞中，以监测肿瘤的生长和消退。这种系统肯定会破坏正常生理，尤其是在肿瘤扩散的早期阶段。荧光素酶需要传递底物荧光素以发光。此外，由于获得的图像分辨率和信号较低，因此需要麻醉。因此，这两种外源性底物递送系统更适合于监测和鉴定体内动物模型。抗体已被用于癌症成像，但同样更适合对已确定的肿瘤转移进行成像(切斯特等。2004).

在引入动物宿主之前对结直肠癌进行荧光标记被认为有利于监测传播的早期阶段。这是通过肿瘤细胞转染和改变蛋白表达来实现的(霍夫曼，2002年)或将荧光化合物引入细胞(麦当劳等。2002). 这些方法可以立即显示血源性引入的结直肠癌细胞。绿色荧光蛋白cDNA提取自维多利亚多管发光水母已转染到原核细胞和真核细胞中，获得稳定表达的蛋白质(查尔菲等。1994). 随后实现了GFP表达和信号强度的优化(程等。1996;科马克等。1996;佐洛图金等。1996). 这使得GFP被广泛用作癌症研究的工具。霍夫曼（2002）写了一篇关于GFP及其用途的优秀评论。最近，一些小组利用GFP研究结直肠癌扩散的早期阶段(施泰因鲍尔等。2003;斯特姆等。2003). 与其他结直肠癌细胞标记方法相比，该蛋白具有许多优点。在稳定表达的细胞系中，GFP在后代中继续表达(霍夫曼，2002). 这样可以很容易地观察肿瘤在长时间内的生长情况。相对而言，钙黄绿素AM(乌格里等。2004)和其他无毒细胞质标记产生的荧光信号往往寿命相对较短，在荧光照射下容易褪色(麦当劳等。2002). 荧光纳米球已被用于癌细胞标记。这些标记物往往具有光敏电阻。然而，这些球体在整个细胞中的分布可能是不均匀的，在复制过程中，每个细胞的球体数量减少，导致信号强度降低(麦当劳等。2002). 将纳米球引入癌细胞可能会改变肿瘤细胞的特性。GFP是理想的肿瘤细胞标志物。最近已发现该标记存在问题。在更长的实验中，GFP已经被证明可以刺激免疫反应。这在引入小鼠宿主的小鼠结直肠癌中得到了注意(施泰因鲍尔等。2003).

迄今为止，理想的结直肠癌细胞标签体内染色尚未发现。在引入之前标记肿瘤细胞似乎是最受欢迎和最明智的方法，并在最近的实验系统中使用。表1显示了实验模型的开发和模型的改进，以分析结直肠癌转移发展的早期阶段。最近的工作使用了钙黄绿素AM(海尔等。2003;Enns公司等。2004,2005). 尽管存在缺点，钙黄绿素AM并没有被证明会引起任何免疫反应，也不会影响关键的肿瘤细胞功能。在HT29人结直肠癌中，钙黄绿素AM已被证明对肿瘤细胞活性或粘附无影响(海尔等。1999). 此外，由于钙黄绿素AM在细胞内被激活，它只能标记有活力的肿瘤细胞(海尔等。2003;乌格里等。2004). 因此，它发挥了有效肿瘤细胞标签的作用，因为它对正常生理过程的破坏最小。

活体显微镜

另一个影响实验模型和转移发展的因素是使用的活体显微镜类型。这两种活体显微镜都是直立的(海尔等。2003;施泰因鲍尔等。2003;Enns公司等。2004,2005)和倒置(瑙莫夫等。1999;麦当劳等。2002;Sturm公司等。2003). 这两者都对“种子与土壤”假说的第三个原则——肿瘤微环境产生了影响。在垂直镜下，肝脏被动员、外化，并在动物宿主仰卧时观察。这个过程包括镰状韧带的剥离、部分脉管系统的活动和拉伸。肝脏被放置在宿主外部和上方的观察平台上。这个过程会扭曲肝脏的微环境。肝脏的外部化涉及更广泛的物理处理和肝脏暴露于外部环境的实验，而不是与倒置IVVM相关。所有这些因素都可能对循环产生深远影响，导致血管收缩或血管扩张。

倒置显微镜包括肝脏的外科暴露，活动度最小。将动物放在腹部，肝脏位于观察平台上方。使用倒置显微镜，肝脏可能较少进行物理操作，但可能会受到更多压迫。这会扭曲肝脏的结构，尤其是微循环。微循环，尤其是窦(瑙莫夫等。1999;海尔等。2003;Sturm公司等。2003;Enns公司等。2004,2005)似乎在肿瘤细胞阻滞中起着重要作用。肿瘤细胞的阻滞至关重要。这次逮捕是如何发生的机制仍有争议。细胞特异性粘附(海尔等。2003;Enns公司等。2004,2005)考虑到肿瘤细胞的阻滞，就可以制定有针对性的干预措施。机械夹持(瑙莫夫等。1999;钱伯斯等。2002)被一些人认为是与肝脏微循环受压有关的人工制品(Enns公司等。2004)，将允许极少的治疗干预。

结论

迄今为止，尚未建立完善的结直肠癌早期扩散和转移发展模型。为了对早期事件进行仔细分析，血细胞法比原位法更可取，因为它可以研究更多的待检查肿瘤细胞。钙调素AM似乎是一种有效的标记机制，对生理图像的失真最小。同基因细胞系有可能提供更准确的转移过程图像，而两种活体显微镜可视化方法都有助于实验变量。只有建立一个符合“种子与土壤”假设所有原则的模型，才能真正准确地描述肿瘤的进化过程。安体内模型紧密地反映了真正的转移过程，可以进行准确的研究，并提高对结直肠癌肝转移建立和发展早期阶段的了解。这种模型将有助于制定具体的治疗干预措施，并能够分析这些干预措施的生物效应(埃布尔等。2006).

致谢

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