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国际实验病理学杂志。2008年2月；89(1): 45–54.
数字对象标识：10.1111/j.1365-2613.2007.00560.x号
预防性维修识别码：PMC2525753型
PMID：18005134

敏感性大肠杆菌Nissle 1917对小鼠的影响取决于环境和遗传背景

安德烈·布利奇,* 约翰·P·桑德伯格,† 安娜·斯莫泽克,* 莱因哈德·冯·瓦西列夫斯基,‡ Maike F de Buhr公司,* 莉迪亚·贾纳斯,* 格温·朱尔加,* Sya N Ukena公司,§ 汉斯·J·赫德里奇,*和弗洛里安·冈泽§**
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

大肠杆菌Nissle 1917（EcN）是一种特性良好的益生菌。尽管EcN和尿致病性EcN的基因组比较大肠杆菌菌株CFT073具有高度的相似性，EcN通常被认为是非致病性生物体。然而，最近的证据表明，EcN能够在宿主肠上皮细胞中诱导炎症反应，我们旨在研究EcN在肠道上皮细胞中的潜在致病特性体内使用各种无菌（GF）小鼠菌株的模型。除了携带有缺陷的类toll-like受体（TLR）4等位基因的C3H/HeJZtm小鼠外，不同菌株的小鼠口服EcN 1周后没有明显的病变，尽管器官培养（血液、肺、肠系膜淋巴结、胰腺、脾脏、肝脏和肾脏）均呈不同程度的阳性。接种EcN的C3H/HeJZtm小鼠出现临床疾病，大多数死亡或必须实施安乐死。所有生菌C3H/HeJZtm小鼠器官培养EcN阳性；主要组织学表现为中度至重度脓肉芽肿性浆膜炎、伤寒和胰腺炎。肿瘤坏死因子（TNF）血清水平升高证实了组织学发现。在特定无病原体维持的C3H/HeJZtm小鼠、缺乏白细胞介素-10基因的GF C3H/HeJ小鼠或接种了大肠杆菌K12菌株MG1655作为对照。此外，口服EcN 3个月后，在Ztm:NMRI小鼠中检测到轻微的组织学损伤。本研究表明，EcN能够在GF C3H/HeJZtm小鼠中显示毒力表型。这种表型是否与细菌的益生菌性质有关应是进一步研究的重点。

关键词：大肠杆菌Nissle 1917、EcN、无菌小鼠、益生菌

大肠杆菌血清型06:K5:H1的菌株Nissle 1917（EcN）是一种特性良好的益生菌，最初由Alfred Nissle博士于1917年从一名士兵的粪便中分离出来，该士兵在严重的痢疾爆发期间未受感染(日产1918). 益生菌是被认为对宿主有益的活微生物(Guarner&Schaafsma 1998年)其用于肠道菌群的治疗性操作有望用于治疗炎症性肠病（IBD）等肠道疾病(沙纳汉2000,2001;科隆贝尔等。2001;萨托2004;Bleich&Mähler 2005年). 例如，最近的研究表明，在维持人类溃疡性结肠炎的缓解方面，服用EcN与标准药物一样有效(雷姆巴肯等。1999;克鲁伊斯等。2004).

EcN益生菌本质的机制尚未阐明。鉴定菌株特异性特征和分析这种细菌与宿主相互作用产生的基因表达模式的尝试已被用于确定EcN的有益作用(格罗兹达诺夫等。2004;太阳等。2005;浮名等。2005). 在最近发表的一项研究中，我们发现大多数基因通过EcN与宿主细胞的相互作用而特异性上调在体外编码作为炎症途径一部分的促炎细胞因子或分子(浮名等。2005). 此外，益生菌EcN和尿致病性EcN的基因组比较大肠杆菌应变CFT073(韦尔奇等。2002)揭示了这两个菌株在基因组水平上的高度相似性，包括被认为与致病细菌毒力相关的因素。这些因素可能有助于EcN的适合性和适应性(格罗兹达诺夫等。2004;太阳等。2005).

尽管有这些相似之处，据我们所知，还没有关于EcN治疗后诱导致病作用的报告。本研究的目的是确定当肠道生理幼稚的小鼠暴露于EcN时，是否也会出现这种情况。因此，我们给不同遗传背景的无菌（GF）小鼠接种了EcN或非致病性K12大肠杆菌基因组序列已完全确定的菌株MG1655(布拉特纳等。1997).

材料和方法

老鼠

从德国汉诺威中央动物设施（Central Animal Facility，Hannover，Germany）的柔性薄膜隔离器（Metall+Plastik，Radolfzell-Stahringen，German:Ztm:NMRI（6只雌性，7只雄性）、BALB/cJZtm（4只雌性，6只雄性）和C3H/HeJZtm:，C3H/HeJBir.129P2-Il10号机组tm1校准（C3.129P2）-Il10号机组−/−，四只雌性，四只雄性），C57BL/6JZtm（三只雌性），ZtmTac:SW（五只雌性）。提供了含有22.0%蛋白质、4.5%脂肪和3.9%纤维的粒状辐照（50 kGy）膳食（ssniff®M-Z，ssniff Spezialdiäten，Soest，Germany）和高压R/O水随意.光：暗周期设置为12:12 h。

C3H/HeJZtm和C3.129P2-Il10号机组−/−对小鼠进行了测试Tlr4号机组磅/天等位基因(波尔托拉克等。1998)通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析325 bp的PCR扩增子Tlr4号机组含有导致Pro→His取代成熟蛋白质712氨基酸的点突变基因（方案由S.Goyert博士善意提供）。用以下寡核苷酸引物扩增靶区：5′-AGA-ATG-AGG-ACT-GG-TG-GA-GA-3′和5′-CTG-CTA-AAG-CGA-TAC-AA-3′。PCR使用REDExtrat-N-AMP-PCR ReadyMix（德国慕尼黑Sigma-Aldrich）进行。按照制造商的协议，使用BstNI（德国法兰克福新英格兰生物实验室）消化40次扩增循环后产生的产物，退火温度为60°C，并在含有SYBR Green（gel Star，4μl/100 ml；Biozym Scientific）。

共有8只C3H/HeJZtm小鼠（4只雌性，4只雄性）在一个环境可控（21±2°C，55±5%相对湿度，12h光照：黑暗周期，每小时换气12-14次）的房间内饲养。进入房间的人员必须穿戴长袍、帽子、外科口罩、套鞋和手套。将小鼠按性别分别安置在单独通风的笼子里（440厘米2地板面积），每个笼子最多有五只动物，床上用品为未消毒、无尘的软木纤维。提供含有22.5%蛋白质、5.0%脂肪和4.5%纤维的粒状膳食（ALTROMIN®1314；德国拉格ALTROMIN Speziafulter）和经紫外线处理的自来水随意.根据FELASA建议进行常规微生物监测(本特纳等。2002)没有发现任何感染常见小鼠病原体的证据，除了嗜肺巴氏杆菌这些小鼠此后被指定为特定的无病原（SPF）小鼠。

本研究是根据德国动物福利法和欧洲共同体理事会关于保护实验用动物的指令86/609/EEC进行的。所有实验均由当地机构动物护理和研究咨询委员会批准，并由当地政府授权。

细菌的制备和小鼠的定植

大肠杆菌Nissle 1917和大肠杆菌K12实验室菌株MG1655如前所述制备(浮名等。2005). 这两个菌株在37°C的Luria Bertani（LB）培养基（德国卡尔斯鲁厄的Invitrogen）中在摇床上培养过夜。然后将培养物在LB培养基中稀释1:500，在37°C下生长，达到OD后在对数后期收获600=1[约含109菌落形成单位（CFU）/毫升]，并离心。每只动物接受一次接种（109CFU）经口灌胃在100μl无菌PBS中重新溶解。3天后重复使用。对于慢性治疗，在给予小鼠1周的无菌饮用水中重新溶解细菌随意.EcN或大肠杆菌结果部分给出了MG1655(表1-3).

表1

大肠杆菌通过培养在器官中检测到Nissle 1917（EcN）（%）

应变n个血液肺MLN公司胰腺脾脏肝脏肾
Ztm:NMRI（7天）50401002040200
Ztm:NMRI（3个月）800380000
C57BL/6JZtm型三067673333033
BALB/cJZtm公司50606080604060
ZtmTac:开关5202010060606080
C3H/HeJZtm公司9100100100100100100100
C3H/HeJZtm-SPF公司802500000
平均值17456642423139

SPF，无特定病原体；MLN，肠系膜淋巴结。

组织学和细菌学检查

一氧化碳对小鼠实施安乐死2接种后1周或3个月窒息。无菌取出器官，按如下所述培养一部分。其余来自肺、淋巴结、肾、肝、脾、胰腺、小肠、盲肠和大肠的样品用中性缓冲4%福尔马林固定，常规处理，石蜡包埋，5-6μm切片，用苏木精和伊红（H&E）染色。

为了进行细菌检查，上述器官、血液和粪便在37°C的巯基乙酸肉汤（Oxoid，Basingstoke，UK）中培养1周。阳性培养物放置在血液和Gassner琼脂上，细菌通过API20E系统（法国Marcy l’Etoile的bioMérieux）和EcN-specific PCR（使用pMUT1质粒特异性引物（Muta 5/6）进行鉴定(Blum-Oehler公司等。2003). 引物序列为：5′-AAC-TGT-GAA-GCG-AGC-AGC-CC-3′和5′-GGA-CTG-TTC-AGA-GAG-CTA-TC-3′；退火温度设置为60°C。

对于定量细菌培养，在接种EcN后3天收集生菌C3H/HeJZtm、Ztm:NMRI和BALB/cZtm小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肠系膜淋巴结，称重，并使用Xenox电动手动工具在1ml PBS中均质（德国尼尔斯巴赫市Proxxon）。匀浆在PBS中连续稀释，每个稀释液在血琼脂平板上培养。计数每个平板的菌落数，并以每个器官的CFU表示。

细胞因子血清水平评估

血清样品在−80°C下保存，直到进行细胞因子分析。使用荧光标记微球（Fluorokine MAP System；R&D Systems，Wiesbaden-Nordenstadt，Germany）和Luminex 100仪器（Luminex BV，Oosterhout，Netherlands）定量肿瘤坏死因子（TNF）水平。所有程序均严格遵循制造商的说明。数据分析采用发光二极管2.3软件采用五参数曲线拟合。使用Fluorokine MAP Base Kit（R&D Systems）中提供的标准鸡尾酒进行三倍稀释，生成标准曲线，最低标准浓度为6 pg/ml。将血清稀释四倍，并重复测量。

结果

无菌小鼠对EcN接种耐受性良好，但C3H/HeJZtm小鼠除外，所有小鼠在接种后3-7天内均出现临床疾病。总共有九分之三的小鼠死亡，三只奄奄一息的小鼠在第四天或第五天被安乐死。如上所述，取这些小鼠的器官进行细菌培养和组织学检查。剩下的三只小鼠存活到第七天，表现出温和的临床症状（皱皮毛和脱水，皮肤出现帐篷状）。其他菌株接种EcN的GF小鼠均未出现临床症状。由于只有GF C3H/HeJZtm小鼠发生疾病，我们研究了EcN对该菌株SPF小鼠的影响。然而，在这些动物中未观察到任何临床症状。然后，我们质疑当感染EcN 3个月后，是否也可以在耐药株的GF小鼠中观察到致病作用。选择Ztm:NMRI小鼠是因为它们的器官培养比其他菌株的阳性率低（见下文）。与之前的实验相反，EcN是通过饮用水提供的。同样，这些慢性感染小鼠在长达3个月的时间内没有表现出任何临床症状。

大体尸检和组织学

尸检显示，除BALB/cJZtm小鼠和接种了大肠杆菌接种EcN的无菌C3H/HeJZtm小鼠出现脱水症状，肠系膜淋巴结和脾脏中度至重度肿大。在第五天进行尸检的一只小鼠中，发现胰腺明显水肿。

组织损伤仅限于接种了EcN并保持为生菌动物的C3H/HeJZtm近交系和暴露于EcN 3个月的生菌Ztm:NMRI小鼠。在SPF条件下维持的C3H/HeJZtm小鼠、接种了大肠杆菌MG1655，也没有在接种了EcN的其他菌株的GF小鼠中。这些发现表明，C3H/HeJZtm小鼠是携带Tlr4号机组磅/天等位基因(波尔托拉克等。1998)与EcN相关时，在GF条件下易发生发病率和死亡率。

在接种EcN的C3H/HeJZtm小鼠中，胰腺腺泡受压，胰腺小叶周围的结缔组织之间有一个清晰的间隙。此外，与对照组相比，小叶之间的间隙增大(图1a、b). 在小叶间质中也有巨噬细胞和粒细胞的聚集，包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(图1c、d). 在肠道中，病变仅限于盲肠粘膜下层的中度弥漫性粒细胞浸润(图1e、f、i、j). 然而，浆膜表面有中度至重度脓性肉芽肿炎性细胞浸润(图1g，h). 肠系膜附件的静脉因大量炎性细胞、纤维蛋白和细菌而扩张(图1k). 粘膜下层、肌肉层和浆膜中都有杆菌(图1j–l). 受感染小鼠的脾脏对EcN感染有反应，其显著增大证明了这一点。显微镜下，接种了大肠杆菌MG1655较小且呈三角形，有较小的白色和红色果肉区域，不太活跃(图1m，n). 相比之下，受影响小鼠的脾脏明显增大，并充满血液。虽然白髓在低倍镜下不太活跃，但它却积极产生大量未成熟的粒细胞(图1o，p). 肝脏和肾脏基本正常，尽管浆膜表面有轻微的巨噬细胞积聚。肺部和纵隔组织表面有不同程度的脓肉芽肿性炎症，与腹部相似。一个肝脏有一个小的急性凝固性肝坏死灶，伴有中心旁炎症。这些损伤在许多近交系小鼠中相对常见(松德贝里等。1997).

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（a–d）给予C3H/HeJZtm无菌（GF）小鼠大肠杆菌Nissle 1917（EcN）的水肿液将胰腺小叶周围和小叶之间的结缔组织分隔开（a），这与接种C3H/HeJZtm的对照组不同大肠杆菌MG1655（b）。在给予EcN的C3H/HeJZtm小鼠（c）中，巨噬细胞和少量粒细胞（中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）的积聚也分离了胰腺小叶。这可以从c（d）中的放大方框中看出。巴=150μm（a）、100μm（b、d）、700μm（c）。（e–h）接种了大肠杆菌MG1655的粘膜下层很薄，基本上没有细胞（e）。相比之下，接种EcN的人显示粘膜下层扩张，充满混合的、主要是粒细胞的炎性细胞浸润（f）。接种后C3H/HeJZtm小鼠肠系膜表面大肠杆菌MG1655在小肠的这一区域（g）中没有正常白色脂肪显示的异常。相比之下，接种EcN的GF C3H/HeJZtm小鼠的肠系膜有明显的肉芽肿浸润（h）。棒材=100μm。（i–l）EcN感染的C3H/HeJZtm小鼠的回盲肠连接。虽然与对照组小鼠相比，粘膜仅有轻微增厚，但粘膜下层明显增厚，并伴有以中性粒细胞为主的混合炎性细胞浸润（i）。许多杆菌在该区域扩散生长，许多被炎症细胞吞噬（j）。肠系膜附件的静脉扩张，有大量中性粒细胞、少量吞噬细菌的巨噬细胞和纤维蛋白（k）。整个肌肉层都有中度水肿液积聚和杆菌弥漫性生长（l）。棒材=400μm（i），150μm（j–l）。（m–p）接种C3H/HeJZtm小鼠的正常脾脏大肠杆菌MG1655横截面收缩，呈三角形（m）。在高倍镜下（方框面积单位为m），可以看到白髓产生淋巴细胞（n）。相反，给予EcN的GF C3H/HeJZtm小鼠的脾脏显著增大，充满成熟红细胞（o）。o中扩大的区域显示了丰富的成熟红细胞和大量未成熟粒细胞的产生，以应对感染（p）。Bar=700μm（o），100μm（p）。

在接种EcN 3个月的8只Ztm:NMRI小鼠中，有3只出现小肉芽肿和淋巴聚集物，广泛散布在盲肠和/或结肠周围的肠系膜脂肪中。在一只小鼠中，小肠粘膜下层可见局部广泛轻度中性粒细胞浸润；此外，在肠系膜脂肪内的这一区域内，有与中等动脉相关或围绕中等动脉的脓肉芽肿病灶。在一个胰腺中，一个孤立的胰岛周围可见轻度至中度淋巴细胞浸润。三只Ztm:NMRI小鼠出现轻度至中度慢性间质性肾炎。

细菌学检查

大肠杆菌从接种1周的所有GF小鼠的器官中不同程度地分离出Nissle 1917(表1). 测试表明，器官和粪便中存在单细胞培养物，表明没有发生污染。PCR证实EcN的特异性。与其他菌株和库存相比，所有C3H/HeJZtm小鼠的所有器官都检测出EcN阳性。当C3H/HeJZtm小鼠接种大肠杆菌MG1655细菌只能从肝脏、肾脏、肺部和肠系膜淋巴结中生长，如表2接种EcN的C3H/HeJZtm-SPF小鼠中只有两个器官阳性(表1). 这些结果表明，GF C3H/HeJZtm小鼠易受益生菌EcN的全身感染。

表2

大肠杆菌通过培养在器官中检测到MG1655（%）

应变n个血液肺MLN公司胰腺脾脏肝脏肾
C3H/HeJZtm型4075100002550
BALB/cJZtm公司50020002060
平均值03860002355

MLN，肠系膜淋巴结。

与C3H/HeJZtm小鼠一样，接种了大肠杆菌MG1655比接种EcN的BALB/cJZtm小鼠(表2)表明EcN比大肠杆菌MG1655.然而，EcN对生菌小鼠的侵袭性似乎不是C3H/HeJZtm小鼠出现病变的唯一原因，因为接种EcN的ZtmTac:SW和BALB/cJZtm小鼠的大部分器官也呈阳性，这些小鼠既没有出现临床疾病，也没有出现病理损伤。此外，对C3H/HeJZtm、Ztm:NMRI和BALB/cJZtms小鼠器官的定量培养显示，仅C3H/HeJZtm小鼠脾脏和肾脏中的细菌计数高于其他两种菌株；然而，这些结果在统计学上并不显著(图2). 因此，定量培养并没有表明C3H/HeJZtm中病理损伤的发生仅仅是由于这些小鼠的肠外细菌计数较高。

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器官的定量培养大肠杆菌Nissle 1917（EcN）感染无菌（GF）小鼠接种后3天。C3H/HeJZtm小鼠在脾脏和肾脏中的定殖水平高于Ztm:NMRI和BALB/cZtm小鼠，但差异无统计学意义。MLN，肠系膜淋巴结。

有趣的是，接种1周的Ztm:NMRI小鼠的几乎所有器官都在一定程度上呈阳性，而暴露于EcN 3个月的组只有肠系膜淋巴结呈阳性。除1只C57BL6/J和2只BALB/cJZtm小鼠外，几乎所有接种EcN 1周的GF小鼠的淋巴结培养结果均为阳性。

血清TNF水平

采用荧光微球法检测GF BALB/cZtm、C3H/HeJZtm和C3.129P2血清中的肿瘤坏死因子-Il10号机组−/−（见下文）接种EcN或大肠杆菌MG1655型(图3). 仅在接种EcN的GF C3H/HeJZtm小鼠中检测到高于6 pg/ml的血清水平。这些相当高的TNF含量可能反映了这些小鼠的病理损伤。比较平均荧光指数（MFI），即与血清TNF结合的荧光粒子数量，结果表明，EcN处理的BALB/c和C3H/HeJZtm小鼠的TNF血清水平显著高于接种了EcN的小鼠大肠杆菌MG1655。

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荧光微球阵列法检测人血清中肿瘤坏死因子大肠杆菌日产1917（EcN）和大肠杆菌MG1655治疗小鼠。TNF的量表示为平均荧光指数（MFI），因为只有C3H/HeJZtm小鼠的血清水平高于6 pg/ml（制造商建议的最低标准浓度）。双向方差分析显示了菌株之间的显著差异(P（P）=0.0002），治疗（EcN或大肠杆菌MG1655，P（P）=0.0006），以及应变/处理相互作用(P（P）= 0.0006). 随后的t检验的显著性水平设置为P（P）<0.05（*）和P（P）< 0.01 (**). EcN处理的BALB/cZtm和C3H/HeJZtm小鼠的TNF血清水平高于大肠杆菌MG1655治疗小鼠。此外，接种EcN后在C3H/HeJZtm小鼠中看到的炎症损伤伴随着相当高的TNF水平（高达100 pg/ml）。除了废除EcN治疗后的病理损伤外，删除Il10号机组-易感C3H/HeJ小鼠中的基因导致TNF减少，与非易感BALB/cZtm小鼠中检测到的水平相当。

C3.129P2-Il10感染−/−老鼠

众所周知，C3H/HeJ亚株易受革兰氏阴性感染(王等。1999,2002;伯恩海登等。2001;Vallance公司等。2003;布朗热等。2004)IL10在小鼠革兰氏阴性病原体诱导的疾病发病机制中起着重要作用(格林伯格等。1995;王等。1999). IL10的中和增强了C3H/HeJ的抗性(王等。1999)和CD-1(格林伯格等。1995)鼠标至肺炎克雷伯菌感染。因此，我们质疑当C3H/HeJ小鼠缺乏Il10号机组基因。未感染C3.129P2-Il10号机组−/−接种EcN或大肠杆菌MG1655出现任何疾病或组织病理学损伤迹象。与C3H/HeJZtm小鼠（在所有研究器官中对EcN均呈阳性）相比，EcN仅在接种EcN小鼠的肠系膜淋巴结和四个肺中的两个肺中检测到。所有其他器官经培养呈阴性(表3). EcN感染的C3.129P2患者血清TNF水平显著降低-Il10号机组−/−小鼠与C3H/HeJZtm小鼠的比较(P（P）= 0.0141,t吨-试验）并与接种EcN的BALB/c小鼠相比较。

表3

EcN和大肠杆菌(大肠杆菌)在C3.129P2的器官中检测到MG1655-Il10号机组−/−培养小鼠（%）

接种n个血液肺MLN公司胰腺脾脏肝脏肾
欧洲共同体40501000000
MG1655型400750000

欧洲共同体，大肠杆菌日产1917；MLN，肠系膜淋巴结。

Tlr4的验证Lps-d型无菌C3H/HeJZtm和C3.129P2-Il10中的等位基因−/−老鼠

由于C3H/HeJ亚基的TLR4缺陷可能介导对EcN诱导的损伤的易感性，IL10缺陷似乎可以逆转这一效应，因此我们确定了是否存在点突变Tlr4号机组GF C3H/HeJZtm和C3.129P2中存在导致蛋白质氨基酸712处Pro→His替代的基因-Il10号机组−/−小鼠群体。如所示图4，对带有BstNI的325 bp PCR扩增子进行限制性消化，在C3H/HeJZtm和C3.129P2中得到预期大小为202 bp和123 bp的两个片段-Il10号机组−/−小鼠，以及携带野生型的C3H/HeN小鼠中预测的202、94和29 bp的三个片段Tlr4号机组等位基因。因此，我们可以验证Tlr4号机组Lps-d型C3H/HeJZtm和C3.129P2的等位基因-Il10号机组−/−导致这些动物中TLR4缺陷。

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无菌（GF）C3H/HeJZtm和C3.129P2-Il10号机组−/−老鼠携带Tlr4号机组磅/天RFLP分析确定的等位基因。使用BstNI消化325 bp PCR扩增子。C3H/HeJZtm和C3.129P2中产生的两个片段（202和123 bp）-Il10号机组−/−小鼠和C3H/HeN小鼠中的三个片段（202、94和29 bp）证明存在Tlr4号机组前两个菌株的小鼠发生点突变，导致TLR4缺陷。kb=DNA分子量标记XIV（罗氏诊断公司，德国曼海姆）。

讨论

不同菌株和库存的无菌小鼠经口接触EcN，以确定接种后EcN在器官中的分布，并确定该益生菌的潜在毒性行为。与其他遗传背景小鼠的结果不同，来自C3H/HeJZtm小鼠的培养物对所有器官的EcN均呈阳性。此外，该菌株小鼠的死亡率、发病率和病理损伤与盲肠、脾脏、胰腺和浆膜表面的急性炎症反应一致。在EcN治疗的C3H/HeJZtm小鼠中检测到相当高的血清TNF水平证实了这一点。C3H/HeJZtm小鼠接种大肠杆菌MG1655，阳性器官较少大肠杆菌未见临床症状和组织学损害。C3H/HeJZtm-SPF小鼠既没有出现疾病，也没有出现炎症的组织学证据，细菌培养只有两个器官的EcN阳性。在暴露于EcN 3个月的Ztm:NMRI小鼠中观察到类似但不太广泛的组织学损伤；然而，这些小鼠没有出现任何临床症状。在我们看来，这些观察结果表明，在不同的环境条件下，口服EcN有可能在具有特定遗传背景的小鼠中诱发疾病，据我们所知，这一点以前从未被证明过。

EcN如何影响C3H/HeJZtm小鼠的机制尚不清楚。小鼠C3H/HeJ亚系与此处使用的其他小鼠之间的一个显著差异是该菌株的TLR4缺陷。存在Tlr4号机组磅/天本研究中使用的GF C3H/HeJZtm小鼠中的等位基因可能是因为其历史，并通过分子方法得到了证实(图4)对PCR产物进行RFLP分析。TLR4-缺陷等位基因与人类对某些感染的易感性增加有关(安妮斯等。2002;蒙特斯等。2006;范德格拉夫等。2006)和LPS低反应C3H/HeJ小鼠相比，LPS正常反应菌株更容易感染革兰氏阴性菌(王等。1999,2002;伯恩海登等。2001;Vallance公司等。2003;布朗热等。2004)，包括实验大肠杆菌泌尿生殖器官感染(霍普金斯大学等。1998;先令等。2001;埃尔卡瓦吉等。2005)，肺(李等。2005)和全身感染(十字架等。1989). 值得注意的是，在使用大肠杆菌感染模型；然而，较高的细菌计数并不一定与更严重的临床症状相关(霍普金斯大学等。1998;先令等。2001;李等。2005). 在这项研究中，肠道外细菌的存在可能有助于疾病的发展。这里使用的所有菌株中阳性细菌培养物的最高数量来自C3H/HeJZtm小鼠的器官；然而，其他菌株未受影响小鼠的器官培养物也对EcN呈阳性。因此，定量培养并不完全支持这样的假设，即C3H/HeJZtm中病变的发生仅仅是因为肠外细菌计数高。然而，EcN处理的C3.129P2的大多数器官中未检测到细菌-Il10号机组−/−尽管这些小鼠也携带Tlr4号机组磅/天等位基因(图4). 缺乏这种抗炎细胞因子可能会增强局部防御机制和细菌清除能力，从而抑制其他易感小鼠肠外器官的细菌定植。其他人也提出了这种机制，表明IL10的中和作用增强了C3H/HeJ小鼠对肺炎克雷伯菌感染(格林伯格等。1995;王等。1999).

可以通过使用GF饲养的C3H/HeN小鼠或携带野生型的其他C3H亚系来证明缺陷TLR4对GF C3H/HeJZtm小鼠对EcN诱导的病理的易感性的贡献Tlr4号机组等位基因。然而，除TLR4缺陷外的其他菌株特异性因素也可能对C3H/HeJZtm小鼠对EcN诱导的病理学的敏感性至关重要。众所周知，C3H/HeJ底物用作IBD动物模型时对肠道炎症非常敏感，例如白细胞介素10缺乏小鼠(布里斯托尔等。2000). 这里，TLR4缺陷似乎与疾病易感性无关(农民等。2001;梅勒等。2002)，尽管细菌因素确实起作用(塞隆等。1998;Bleich&Mähler 2005年).

在以前的研究中，宿主对EcN的反应(浮名等。2005)在体外或其他益生菌，如乳双歧杆菌(鲁伊斯等。2005)在体外和体内被证明至少具有短暂的促炎性；因此，EcN诱导炎症反应可能是其益生菌作用的一部分。体外显示EcN治疗的促炎反应的数据与我们的数据一致，即感染EcN的GF小鼠的血清TNF水平高于大肠杆菌MG1655接种动物。这不仅在发生病变的C3H/HeJZtm小鼠中检测到，而且在BALB/cZtm鼠中也检测到；然而，在BALB/cZtm小鼠中，无论接受何种治疗，血清TNF水平都很低。

总之，正常菌群的存在和遗传背景的特殊性决定了EcN是否表现为益生菌或病原菌，从而证明了该菌株的剩余毒力。需要进一步研究以确定EcN在GF C3H/HeJZtm小鼠中的致病作用是否与其益生菌特性有关，以及EcN与肠道共生体之间的相互作用，常规宿主或两者的正常启动免疫反应可解释GF或SPF C3H/HeJZtm小鼠EcN定植的不同结果。

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院（RR000173，JPS）和DFG（SFB621，HH&FG）的部分资助。

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