内质网相关需要Der3p/Hrd1p错误折叠的肺泡膜和完整膜蛋白的降解

DER3的克隆

DER3公司通过转化YAF29菌株分离得到酵母基因组DNA文库由Cvrková和纳斯迈思（1993）在着丝粒质粒YCplac111中。卢⁺将转化体复制接种到选择性培养基的新鲜平板上用硝化纤维素膜覆盖并培养5d至诱导CPY*的积累，基本上如所述Knop（打结）等。(1996).根据Knop（打结）等。(1996)用多克隆CPY检测到CPY*血清和山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联物抗体。用4-氯萘酚开发印迹。不染色采集菌落，通过Western blotting重新测试，质粒获救。

分子生物学技术与质粒构建

分子生物学的标准技术表现为在Ausubel中描述等。（1988）和萨姆布鲁克et（等）阿尔。(1989).

从基因中分离的互补质粒YCpDER3片段该文库被亚克隆到YCplac111中。A类巴姆你好——生态2.8-kb的RI片段包含DER3公司基因被克隆到2μ质粒YEp366中(迈尔斯等., 1986)过度强调DER3公司-编码的酵母中的蛋白质。要构建DER3公司断裂等位基因，一个生态RI–Hin公司YCpDER3 3.8 kb的dIII片段被克隆到pUC19中，产生pUCDER3，然后萨尔I–生态包含完整开口的RV碎片的阅读框（ORF）DER3公司被替换为HIS3型基因，产生pUC/del3质粒。要构造GST-Der3融合蛋白，质粒pFUS1通过克隆生态RI–生态包括C末端的RV片段139个ORF密码子进入生态RI–Sma公司I站点pGEX-3X的(史密斯等。, 1988). 质粒pDEG1(陈等。1993年)，包含Deg1-β-半乳糖苷酶融合，由M.Hochstrasser和T.Sommer提供。过度表达德3在酵母细胞中镀锌1通过亚克隆整个ORF构建启动子质粒pBM/DER3属于DER3公司到载体pBM150中(约翰斯顿和戴维斯，1984年)用…消化巴姆HI和萨尔I.创建两者编码区域两侧的限制站点DER3公司，PCR采用寡核苷酸GAL1作为引物的技术（5′-TAGATGTCGACTATTTCCGC-3′）和GAL2（5′-AGACAGGATCCATATGGTGCC-3′）。Der3p的表达通过Western blot检测pMB/DER3编码的基因及其对补充第3–1级突变。构建质粒YCpDER3ΔR，pUCDER3用生态RV 5分钟重排，产生pUCDER3ΔR，缺少生态RV碎片342个基点DER3公司ORF公司。3.5 kb生态RI–Hin公司克隆了pUCDER3ΔR的dIII片段到YCplac111中，得到YCpDER3ΔR。

西方印迹法

对于CPY*和Der3p的Western blotting和免疫检测，酵母细胞在CM培养基上生长(Guthrie和Fink，1991年)直到外径₆₀₀3.1-ml培养液的等分样品根据Yaffe和Schatz（1984）.三氯乙酸沉淀后，将颗粒重新悬浮在100μl尿素缓冲液中[5%十二烷基硫酸钠，8 M尿素、200 mM Tris-HCl（pH 6.8）、0.1 mM EDTA、溴酚蓝]和在60°C下摇晃10分钟。短暂离心后，15–20μl将上清液加载到8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上后续电泳（Laemmli等.，1970）通过Western blotting。

膜中富集的细胞提取物的制备如下所述塞拉诺（1988）.

蛋白酶保护实验基本上按照描述进行通过希勒等。(1996)进行了以下修改。这个将三氯乙酸沉淀物重新悬浮在100μl尿素中缓冲液和20μl样品在8%的浓度下分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶，印迹，特异性免疫反应用相应的抗体检测材料。

在所有情况下，适当的辣根过氧化物酶共轭次级使用抗体，并用ECL检测进行印迹套件（伊利诺伊州阿灵顿高地阿默沙姆）。

亚细胞分离和酶分析

亚细胞分离按照Antebi公司和芬克（1992），修改人Knop（打结）等。(1996).

鸟苷二磷酸酶（GDPase）活性的测定如下所述阿贝洪等。(1989).

Deg1-β-半乳糖苷酶融合降解动力学按照普伦珀等。(1997).简单地说，在CM培养基上获得了指数增长的酵母细胞通过离心并重新悬浮在新鲜CM培养基中，调整为3外径单位₆₀₀.环己酰亚胺被添加到最终浓度为0.5 mg/ml。采集90μl培养物的样品在0、30、60和90min后，β-半乳糖苷酶的活性为仔细斟酌的。β-半乳糖苷酶活性计算如下：福斯特等。(1988).

细胞标记和免疫沉淀

对于CPY*脉冲相实验，在CM上培养酵母细胞中等，直到OD₆₀₀已达到2的。5 ml的细胞将浓缩在1ml标记培养基中的培养物标记为[³⁵S] 蛋氨酸在30°C下保持20分钟。此后，1 ml添加chase培养基，并去除450μl等分样品每个时间点。生长、标记和追踪培养基及其他细胞处理、免疫沉淀和SDS-PAGE由描述手指等。(1993).

对于检测Sec61p的脉冲相位实验，SD培养基中呈指数增长的细胞被转移到限制温度为38°C，并标有[³⁵【S】蛋氨酸作用10分钟。生长和标记条件如前所述进行细胞、免疫沉淀和SDS-PAGE以前(比德勒等。, 1996). 标记为Sec61p的是通过放射自显影术进行可视化，并使用磷光成像仪进行定量（分子动力学，加利福尼亚州桑尼维尔）。

抗体

为了检测Der3p，识别蛋白质的139-氨基酸C末端区域为生成。使用质粒pFUS1，GST-Der3融合蛋白以表示大肠杆菌并通过亲和力纯化色谱法（Ausubel et阿尔。, 1989). 一毫克纯化后的蛋白用作免疫原材料兔子。

将多克隆抗Der3p以1:2500稀释用于蛋白质印迹，并以1:250稀释用于免疫荧光。多克隆抗CPY(手指等。,1993)、单克隆抗CPY（分子探针）、多克隆抗Kar2p（a来自R.Schekman和H.K.Rudolph的礼物）和单克隆抗体识别液泡膜ATP酶的100-kDa亚基（分子探针）被稀释为1:10000免疫印迹法。特异性多克隆抗体Sec61p由T.Sommer提供。

DER3染色体缺失导致CPY内质网降解缺陷*

探讨Der3p在ER相关疾病中的作用降解，我们完全确定了酵母菌株的表型缺少DER3公司基因。我们构建了一个带有DER3公司通过替换整个ORF来破坏等位基因DER3公司由HIS3型基因。突变体的发现携带第3–1级等位基因，第3级空突变体是可行的，并且在免疫印迹与同基因野生型的比较应变（图​（图2A）。2A） ●●●●。脉冲相位分析表明CPY*的积累是由于CPY*降解的阻塞（图​（图2B）。2B） ●●●●。删除DER3公司导致了一个完整的即使在3小时追逐后，CPY*也能稳定，而CPY*不能追踪60分钟后，在一株含有DER3公司野生型等位基因。我们必须确认第3–1级突变实际上是DER3公司基因。因此，我们将携带第3–1级菌株W303–1CΔ3的等位基因德3删除。二倍体表现出高水平的CPY*，表明这两个等位基因存在于相同的基因中。正如所料，二倍体由DER3公司野生型菌株W303–1C和第3–1级突变株YAF29在以下方面表现出野生型行为CPY*降解。

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图2

（A） CPY*的稳态水平DER3公司野生型和突变株。Western blotting是用早期固定相制备的粗提取物进行酵母细胞在YAF29菌株CM培养基上的生长(第3–1级)，YAF29具有着丝粒互补性质粒YCpDER3，野生型菌株W303-1C(DER3公司)、和DER3公司删除应变W303–1CΔ3(Δder3). （B） CPY动力学*中的退化DER3公司野生型和突变株。A类野生型菌株W303-1C的脉冲相位实验(DER3公司)和W303–1CΔ3(Δder3)是展示。用标记细胞20分钟[³⁵S] 蛋氨酸，并在指定的追逐期。（C） CPY*的稳态水平德国存托凭证1和DER3公司突变株和野生型菌株。粗提取物来自菌株W303–1C（野生型）的早期固定相细胞，W303–1CD码(Δder1),W303–1C型Δ3(Δder3)、和W303–1CDΔ3(Δder1Δder3)都准备好了。CPY免疫反应通过SDS-PAGE和Western blotting检测材料单克隆抗CPY抗体。

携带缺失的菌株DER3公司没有显示任何当细胞在不同温度下生长或用二硫苏糖醇和β-巯基乙醇，引起蛋白质错误折叠的物质。也在无肌醇介质上Δder3，个单元格没有显示与DER3公司野生型应变。

与发现的类似表型第3级突变体CPY*降解，之前曾描述过突变菌株有缺陷的德1编码内质网膜蛋白的基因(Knop（打结）等。, 1996). 我们研究了可能的相互作用通过过度表达Der1p和Der3pDER3公司在承载应变第1–2级突变或过度表达德国存托凭证1在中第3–1级背景。在任何情况下都不能观察到CPY*退化的恢复（我们的未出版结果）。A类Δder1Δder3双突变株未显示CPY*稳态水平与单个突变体（图​（图22C） ●●●●。

Der3p是内质网膜的一种蛋白质

我们研究了Der3p的细胞内定位。为了这个目的，特异性多克隆抗体能够在通过Western blot、免疫荧光或免疫沉淀法检测酵母细胞获得了。简单地说，一种Der3p-GST融合蛋白含有蛋白质C末端亲水尾部的139个氨基酸是以表示大肠杆菌纯化后用作抗原在兔子身上产生免疫反应。获得的抗血清在野生型原油中唯一识别出约64kDa的蛋白质蛋白质印迹SDS-PAGE后的提取物（图​（图3三A） ●●●●。这个蛋白带相当大过度表达DER3公司关于多拷贝质粒YEpDER3。在第3–1级或Δder3突变细胞（图​（图3A）。三A） ●●●●。

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图3

（A） Der3蛋白的鉴定。原油CM菌株培养基上指数生长细胞的提取物W303–1C[野生型（WT）]，W3031-C携带高拷贝质粒YEpDER3、YAF29(第3–1级)，W303–1CΔ3(Δder3)和W303–1CD(Δder1)是制备、SDS-PAGE分离和免疫印迹。水平用多克隆Der3p抗血清检测Der3p的表达。（B） Der3p是一种完整的膜蛋白。浓缩在膜中的粗提取物在CM菌株培养基上由指数增长的细胞制备W303–1C（重量）和W303-1CΔ3(Δder3). 等分的可溶性（S）和膜（P）组分的负载量为8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后蛋白质印迹。Der3p抗原材料用抗Der3p多克隆抗体。

N-末端疏水区Der3p公司有五个假定的跨膜结构域表明蛋白质。Der3p确实可以在富集膜中检测到酵母细胞提取物和不在可溶性部分中的部分（图​（图3B）。三B） ●●●●。虽然Der3p序列包含两个识别位点N个-糖基化，则蛋白质不被糖基化。无换档SDS-PAGE和内切糖苷酶F处理后的免疫印迹（我们的未发表的观察结果）。

为了研究Der3p的细胞膜定位，我们在含有高拷贝质粒YEpDER3。如图所示​图4A，4A、 Der3p与ER共分馏管腔伴侣Kar2p。Der3p不与液泡、Vph1p或高尔基体定位的GDPase(阿贝洪et（等）阿尔。, 1989;马诺尔森等。, 1992). ER本地化Der3p通过在细胞过度表达Der3p。内质网的典型模式，核周沿着质膜有染色区域(普劳斯et（等）阿尔。, 1991)在可视化Der3p时观察到（图​（图4B）。4B） ●●●●。当亚细胞分馏在含有只有…的染色体拷贝DER3公司，微弱，但很清楚与ER共分馏的可见Der3p免疫反应带发现了常驻蛋白Kar2p，证实了蛋白质（图​（图4C）。4C） ●●●●。

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图4

Der3p的细胞内定位。（A） Der3p公司与ER驻留蛋白Kar2p共分馏。球原生质体携带高拷贝质粒YEpDER3的W303–1C（野生型）菌株制备，在温和溶解后，匀浆在10步蔗糖梯度上分馏（18–54%，4%步蔗糖）。对每一组分的等分样品进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。Der3p、Kar2p（ER标记）和100kDa的水平液泡膜ATP酶亚基用各自的特异性抗体。高尔基体标记物GDPase的活性，以测量的最高活动值的百分比给出。（B）Der3p定位于类ER结构。指数增长的细胞用2μ质粒YEpDER3转化的菌株W303–1C的用多克隆抗Der3p抗体和山羊进行固定和染色抗兔Cy3抗体。用激光监测Cy3荧光共焦显微镜（Cy3，Cy3荧光；DIC，Nomarski光学）。（C）当从基因的染色体拷贝表达Der3p时与Kar2p共分馏。亚细胞分馏如下在A中使用菌株W303–1C。用于检测Der3p，每种500μl用10 mM HEPES（pH 7.5）将部分稀释至10倍将100000 g膜芯（1 h）重新悬浮在尿素缓冲液中加载到8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。免疫印迹后检测到Der3p和Kar2p带有合适的抗体。仅显示分数1-8；没有乐队可以在分数9-17中检测到。

Der3p的亲水尾朝向ER流明

对Der3p功能机制的研究需要对其含有351个氨基酸的大分子定位的认识亲水性C末端结构域包含一个RING-H2指基序。这个这类基序的功能尚不清楚，但已被提出用于参与蛋白质-蛋白质相互作用(绍林等。,1996).

分离野生型细胞的微粒体并用胰蛋白酶处理。如果Der3p的C末端尾部位于ER，可以预计Der3p的分子量会减少SDS-PAGE后胰蛋白酶处理约40kDa。如图所示图​图5，5，Der3p-reactive无位移在胰蛋白酶处理微粒体后可以观察到条带。仅当添加Triton®声波风廓线仪X-100后，Der3p的C端区域变为可接近蛋白酶并完全降解。自从抗体只针对Der3p的亲水性C末端，这种治疗会导致抗体的能力完全丧失检测蛋白质的任何片段（图​（图5）。5). 此外，只有用Triton X-100处理微粒体后，可获得Kar2p胰蛋白酶消化。这表明亲水性C末端Der3p的尾部位于ER的内腔中。

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图5

Der3p的C端子尾部朝向ER流明。野生型菌株W303-1C的酵母球状体受到轻微的溶解。将裂解液离心分离含有完整颗粒组分（P）的可溶性组分（S）酵母微粒体。将等分的微粒体培养30分钟在没有（−）或有胰蛋白酶（+T）或胰蛋白酶的情况下加冰和Triton®声波风廓线仪X-100（+T+X）。三氯乙酸停止治疗酸沉淀（10%最终浓度）。重新悬浮颗粒在尿素缓冲液中，SDS-PAGE后进行免疫印迹，并染色抗Der3p或抗Kar2p多克隆抗体。

Der3p缺失导致CPY*在ER内积聚

阐明Der3p在ER相关中的作用降解途径，我们研究了包含已删除内容的单元格中的CPY*DER3公司基因。微粒体在不存在或存在的情况下用胰蛋白酶制备和处理用CPY观察Triton X-100和CPY抗原材料单克隆抗体。如图所示​图6A，6A、 CPY*受到ER膜的保护通过胰蛋白酶进行蛋白水解消化。仅在膜溶解后使用Triton®声波风廓线仪X-100，CPY*会被消化。完整性小泡由ER管腔伴侣Kar2p控制在本实验中，其行为与CPY*相同。因此，CPY*累积在缺乏DER3公司基因。

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图6

CPY*在不同突变体中的定位减少ER降解。进行了蛋白酶保护实验菌株W303–1CΔ3的完整酵母微粒体(Δder3)，W303–1CD(Δder1)，W303-CQ(Δubc7)和W303CPQ(Δubc6Δubc 7).未处理的可溶性部分（S）和内质网囊泡（P）的等分样品（−）或用胰蛋白酶（+T）或胰蛋白酶和Triton X-100处理（+T+X）进行Western blotting和CPY*水平测定用合适的抗体检测对照Kar2p。

Ubc6-Ubc7泛素化途径的完整性对于CPY*的ER降解(希勒等。, 1996). 因此，我们测试Der3的缺陷是否影响该通路的功能。为此Deg1-β-半乳糖苷酶，一种β-半乳糖苷酶与Matα2阻遏蛋白的Deg1降解域被证明是Ubc6-Ubc7-依赖性的特异性底物泛素化(陈等。1993年)，在野生型和Δder3背景（图​（图7）。7). 在这种基质的降解可以在Δder3细胞与野生型相比。这表明Der3p不是参与与招聘泛素结合酶Ubc6和Ubc7或ER蛋白酶体用于降解CPY*的膜。

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图7

Ubc6-Ubc7泛素化和蛋白酶体通路不受Der3p缺失的影响。动力学Deg1-β-半乳糖苷酶融合蛋白在菌株中的降解W303–1C（重量）和W303-1CΔ3(Δder3)已测量。在两种菌株的CM培养基上生长的早期固定相酵母细胞携带高拷贝质粒pDeg1的菌株被采集并重新悬浮于含有环己酰亚胺（0.5 mg/ml）的新鲜CM培养基，在30°C。在0、30、60和90分钟后采集培养物样本，测定β-半乳糖苷酶的活性。酶活性在时间0时设置为100%。

Der1p和Ubc6p/Ubc7p的缺失也会导致CPY的积累*ER内部

除了translocon和Kar2p的成分(普伦珀et（等）阿尔。, 1997)以及蛋白酶体(希勒等。,1996)，我们之前描述过其他基因产物Der1p，正确的ER关联需要Ubc7p/Der2p和Ubc6pCPY*降解(希勒等。, 1996;Knop（打结）et（等）阿尔。, 1996). 这些基因的缺失也会导致细胞中的CPY*。使用与本地化相同的方法CPY*英寸Δder3突变体，我们发现CPY*也定位在ER在Δder1突变体（图​（图6B）。6B） ●●●●。有趣的是，在携带a的等基因菌株UBC7公司缺失等位基因，部分在微粒体中可见CPY*的积累（图​（图6C）。6C） ●●●●。然而，在缺乏泛素酶Ubc6和Ubc7的菌株，大多数CPY*积聚在ER管腔中（图​（图6D）。6D） ●●●●。因此，组件定位于ER膜（Der1p、Der3p）以及组件中功能定位于细胞质（Ubc6p、Ubc7p）是必要的用于CPY*从内质网腔逆行转运到胞浆。

DER3的删除抑制了携带sec61-2突变的细胞可稳定体内Sec61-2突变蛋白

Sec61p是ER膜(德塞伊斯等。, 1991;格利希et（等）阿尔。, 1992; 哈特曼等。, 1993). 一种突变形式的这种蛋白质由第61–2秒等位基因(Deshaies和Schekman，1987年). 像CPY*(希勒等。, 1996)，这个泛素蛋白酶体选择性降解突变蛋白限制温度为38°C时的路径(比德勒et（等）阿尔。, 1996). 由于腔CPY*和Sec61–2p退化通过相同的蛋白水解途径，阐明Der3p是否参与了降解泛素化和蛋白酶体之前的膜定位Sec61–2p蛋白质水解。

携带第61–2页等位基因显示清晰对温度敏感的增长，无法在限制条件下生存温度38°C(Deshaies和Schekman，1987年). 因此，我们调查是否删除了德3是的抑制器由第61–2秒突变。A菌株携带第61–2秒等位基因和DER3公司建造完成。尽管承受压力第61–2秒突变无法在38°C下生长，原因是Sec61-2蛋白的降解，从而完全消失将蛋白质导入内质网的能力第61–2秒Δder3双突变体能够在38°C下生长（图​（图8A）。8A） ●●●●。如预期第61–2秒突变细胞再次停止生长DER3公司基因是引入到Δder3质粒上的突变体。这个表明Der3蛋白的缺乏稳定了突变转座子组分Sec61–2p，允许蛋白质进入内质网。因此，在没有Der3p的情况下，Sec61–2p的缺陷降解假设。

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图8

（A） 对德3抑制温度敏感性生长表型第61–2秒突变体。菌株W303–1C（WT），YRP086(第61–2秒)和YRP105(秒61–2Δder3)窝藏LEU2级含有质粒YCplac111，和YRP105型(第61–2节Δder3/YCpDER3)包含DER3公司对着丝粒质粒中的基因进行测试在不含亮氨酸的CM板上在30和38°C下生长36小时（B）删除DER3公司阻止Sec61–2p在限制温度。脉冲相位实验在菌株W303-1C（WT），YRP086(第61–2秒)和YRP105(秒61–2Δder3). SD上呈指数增长的细胞将培养基移到38°C下2小时，并用[³⁵S] 蛋氨酸。追逐之后，小份细胞被在指定的追踪点处采集，溶解，并用免疫沉淀特异性抗Sec61p抗体。

我们测量了DER3中Sec61-2蛋白的半衰期野生型和Δder3脉冲相位实验中的突变限制温度为38°C。Sec61p的SDS-PAGE后标记Sec61-2蛋白的抗原物质通过放射自显影术及其半衰期是用磷光成像仪测量的。如图所示​图8B，8B、 野生型Sec61p甚至相当稳定在非允许温度下追逐150分钟后。这个第61–2秒等位基因编码一种快速降解的Sec61-2蛋白在38°C下，追逐150分钟后几乎检测不到。删除属于DER3公司导致第61–2节蛋白质。突变蛋白的半衰期延长三倍于Δder3突变株与DER3公司野生型。

我们表示DER3公司在镀锌1同基因野生型和第61–2秒突变菌株。而在含有葡萄糖的培养基上，这两种菌株都是明显能够在25°C和30°C下生长；诱导过度表达属于DER3公司关于半乳糖的培养基导致了戏剧性的携带第61–2秒25°C和30°C时的等位基因（图​（图9）。9).这再次表明Der3p参与了Sec61-2突变蛋白。删除后UBC7公司，一个第61–2秒突变株过度表达DER3公司变得可行（我们未发表的观察结果）Der3p在第61–2页应变允许的温度必须解释为突变Sec61-2蛋白。

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图9

的过度表达DER3公司是致命的一第61–2页在允许温度下突变。应变W303–1C（重量）和YRP086(第61–2秒)窝藏URA3公司含有质粒pBM150或DER3公司受控制的基因镀锌1将克隆到pBM150质粒（pBM/DER3）中的启动子生长在CM板上25岁时不含尿嘧啶，以葡萄糖或半乳糖为碳源30°C持续36小时。

我们感谢M.Knop和M.Rose提供菌株F。Cvrková和K.Nasmysy欧洲标准化委员会-欧盟2图书馆，M。Hochstrasser和T.Sommer为Deg1-β-半乳糖苷酶融合质粒，T.Sommer提供抗Sec61p抗体，R.Schekman和H.K.Rudolph检测抗Kar2p抗体。我们感谢Monica Bredschneider感谢她在共焦显微镜和S.Jäger，M。Laquai和J.Strayle提供了有益的评论和讨论。这项工作得到了德国联邦政府的支持Technologie（德国波恩），Zentrales SchwerpunktprojektBioverfahrenstechnik（德国斯图加特）和化学基金会Industrie（德国法兰克福）。J.B.是西班牙人文化教育部（F.P.I.en el extranjero计划）。