周细胞迁移

摘要

周细胞在起源、分布、表型和功能方面是异质的(1,2). 常驻视网膜周细胞在发育过程中来源于中胚层和神经嵴。周细胞的骨髓来源以及内皮细胞向周细胞的转分化也已在出生后血管修复和成人血管生成中得到证实(三–5). 此外，周细胞可以转分化为巨噬细胞和成纤维细胞样细胞(6,7). 周细胞是小动脉平滑肌细胞（SMC）的毛细血管对应物。与SMC相反，它们完全嵌入毛细血管基底膜并延伸过程，长度、排列和形式各不相同，表明它们在功能性血管中的流动性(8–11). 周细胞和SMC的一个显著共同特征是它们的收缩表型(12). 然而，血管收缩的关键分子肌动蛋白和肌球蛋白在周细胞群中分布不均匀(13–15)导致收缩潜能的差异，这取决于它们在毛细血管树中的位置(12). 周细胞可以在生理和病理条件下控制内皮细胞增殖和血管生成(16–22). 平滑肌肌动蛋白（SMA）、结蛋白、蛋白聚糖NG2、血小板衍生生长因子受体β（PDGFB-R）、氨肽酶N和G信号调节因子5（RGS-5）是常见的周细胞标记物，但它们都不足以识别每个周细胞(15,19,23–29). 另一种研究周细胞的实验工具是XLacZ小鼠。在该小鼠中，LacZ在血管平滑肌细胞和周细胞中以不同的血管树水平表达，但细胞增殖和迁移与转基因下调相关。根据我们自己的观察，LacZ仅在视网膜周细胞的子集中表达。起源的多样性、功能能力的差异以及缺乏泛核细胞标记表明，周细胞在特定器官中的数量并不一致；因此，在某些亚群中，视网膜周细胞对慢性高血糖的反应可能不同。

糖尿病视网膜病变的形态学特征是视网膜毛细血管发生病变。主要和主要特征是周细胞丢失和毛细血管逐渐闭塞(8,30). 据推测，预防糖尿病视网膜病变发病机制中的早期事件，如周细胞丢失，将阻止糖尿病视网膜病变的后续发展。糖尿病视网膜病变周细胞丢失的潜在机制是复杂的，尚未完全阐明。

细胞凋亡和周细胞内的破坏性信号通路通常被认为是高血糖状态下视网膜周细胞丢失的原因(31,32)但越来越多的证据表明，周细胞被其他机制积极耗竭。毛细血管周细胞覆盖率受多种生长因子系统调节，如血管生成素及其酪氨酸激酶受体Tie-2。血管生成素-2（Ang-2）在视网膜中表达，并在周细胞丢失之前在糖尿病视网膜中上调。我们最近证实，Ang-2基因剂量减少50%可防止糖尿病视网膜周细胞丢失，这表明Ang-2/Tie-2系统在糖尿病周细胞丢失中起着重要作用。感光细胞中Ang-2的组成性过表达降低了视网膜深毛细血管层的周细胞覆盖率，将重组Ang-2注射到非糖尿病大鼠的玻璃体中可在几天内诱导剂量依赖性周细胞丢失，表明Ang-2在减少周细胞覆盖中的重要性(33,34). 糖尿病动物和增生性糖尿病视网膜病变患者玻璃体液中Ang-2水平的升高支持了Ang-2/Tie-2系统在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用(35,36)，但其潜在机制仍有待研究。

根据已发表的关于周细胞异质性以及周细胞损失与Ang-2/Tie-2系统的关联的证据，我们假设糖尿病周细胞损失是原位凋亡以外的机制的结果，并且Ang-2等因素可能积极调节这一过程。

在本研究中，我们使用转基因小鼠模型量化实验性糖尿病视网膜病变中的周细胞丢失，以研究视网膜周细胞对慢性高血糖的反应，以及Ang-2对获得和丧失功能模型中视网膜周细胞迁移的影响。

研究设计和方法

本研究中的所有实验均根据视觉和眼科研究协会（ARVO）发布的动物实验声明指南进行，并得到动物护理和使用委员会的批准。动物分组被关在笼子里，在12小时的光照和12小时的暗节律下自由获得标准食物和水。

自发性糖尿病Ins2Akita杂合小鼠购自Jackson Laboratory（Charles River Laboratories，Sulzfeld，Germany）(29)生成自发性糖尿病杂合XLacZ小鼠（Ins2Akita^+/−XLacZ公司^+/−). 年龄匹配的非糖尿病杂合XLacZ小鼠（Ins2Akita^−/−XLacZ公司^+/−)作为控制。如前所述，出生4周后通过PCR确定基因型(37). 本研究仅使用雄性小鼠，因为与雌性小鼠相比，糖尿病发病更早，高血糖更严重。每隔一周连续监测血糖水平和体重，并在研究结束时通过亲和色谱法测定糖化血红蛋白浓度（MicromatII；德国慕尼黑Bio-Rad实验室）。偶尔给个别糖尿病小鼠注射胰岛素，以防止严重的体重减轻。实验性糖尿病6个月后，在深度麻醉下进行眼球摘除，并立即在−80°C下冷冻以进行进一步分析。

为了研究Ang-2对周细胞迁移的影响，对转基因mOpsinAng2和Ang2LacZ小鼠的视网膜进行了分析。mOpsinhAng2小鼠在视网膜的感光层中过表达人Ang-2。Ang2LacZ小鼠携带一种靶向载体，该载体用编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因替换Ang-2的部分编码区，以产生Ang-2空等位基因。杂合LacZ敲除导致功能性Ang-2基因剂量减少50%。先前已经描述了mOpsinAng2和Ang2LacZ小鼠的产生和基因分型(34,38). 野生型幼崽作为对照。在随机选择的转基因小鼠和野生型小鼠中，一次性注射链脲佐菌素（STZ）（购自德国曼海姆Roche Diagnostics；150 mg/kg i.p.）可诱导糖尿病。当血糖水平达到稳定水平>250 mg/dl时，注射STZ的动物被视为糖尿病动物。在糖尿病诱导6个月后处死糖尿病和非糖尿病小鼠，在深度麻醉下收集眼睛，并立即在−80°C下冷冻。

结果

周细胞亚群中的不同周细胞丢失。

周细胞表现出不同的表型。如所示图1A类周细胞位于毛细血管分支或直毛细血管上。直毛细血管周细胞的细胞核小、圆或细长。值得注意的是，直毛细血管上的一种周细胞似乎与内皮接触较少。图1B类–G公司显示了周细胞从广泛接触到较少接触到内皮细胞的连续迁移过程，这是我们在研究的不同阶段经常发现的。周细胞图1D–G型被定义为迁移周细胞。为了检查迁移过程中周细胞和邻近内皮之间的关系，并排除消化过程中的伪影，对视网膜整体支架进行了NG2（绿色）/凝集素（红色）双重染色(图1H（H）–J型). 与位于毛细血管上的周细胞相比，迁移的周细胞及其向邻近血管的延伸仅对NG2呈阳性，这表明这些结构源自周细胞，并且周细胞表型既不是血管退行的结果，也不是消化过程的结果。

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图1。

根据周细胞亚群的位置和与毛细血管的接触情况图解(A类)周细胞迁移过程(B类–G公司)在视网膜消化制剂中。箭头在A类：B-PC，分支周细胞；箭头插入A类：S-PCs，与内皮细胞广泛接触的直毛细血管周细胞；中的星号A类：M-PC，周细胞在直线毛细血管上迁移，与内皮接触较少。周细胞迁移过程的连续性如所示图1B类–G公司根据我们的形态学定义，周细胞被视为迁移周细胞（M-PC），因为三角形细胞核的至少一侧比与毛细血管接触的基底长(图1D–G型). 周细胞的迁移通常将过程延伸到邻近的毛细血管。NG2（绿色）/凝集素（红色）染色的视网膜整体支架的共焦显微镜可识别周细胞（如箭头所示H–J型)以及它们与内皮细胞的分离过程(图1H（H）–J型).H（H）：NG2–荧光素异硫氰酸盐染色；我：凝集素-TRITC染色；J型：的合并图像H（H）和我。原始放大倍数：400×。（请参见http://dx.doi.org/10.2337/db08-0325以获得该图的高质量数字表示。）

为了评估血糖升高对周细胞丢失的影响，我们分析了实验性高血糖6个月后糖尿病XLacZ小鼠视网膜消化液中周细胞的覆盖率。我们发现，糖尿病XLacZ小鼠在高血糖6个月后，与非糖尿病同胞相比，周细胞总数减少了16%（非糖尿病对糖尿病：2374±257和2002±136/mm）²毛细管面积的，P（P）< 0.01,图2A类). 周细胞亚群分析显示，血管分支周细胞（B-PC）完全不受慢性高血糖的影响（非糖尿病组与糖尿病组：580±157和586±139/mm²毛细管面积的，图2B类). 我们发现糖尿病视网膜周细胞的丢失仅限于直毛细血管周细胞。S-PC的数量减少了27%（非糖尿病组与糖尿病组：1676±316和1218±282/mm²毛细管面积；P（P）< 0.05,图2C)这种减少完全解释了糖尿病动物周细胞总数的减少。高血糖诱导的周细胞减少是由于位于直毛细血管上的周细胞丢失，同时周细胞数量增加，最好从视网膜毛细血管的直部分离。高血糖导致参与形态学定义的迁移过程（M-PC）的周细胞数量增加。与非糖尿病XLacZ视网膜相比，糖尿病XLacZ视网膜在高血糖6个月后的M-PC数量增加了>69%（非糖尿病与糖尿病：117±38和198±79/mm²毛细管面积；P（P）< 0.05,图2D类).

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图2。

非糖尿病和糖尿病XLacZ小鼠周细胞亚群的定量。周细胞总数（T-PC，A类)，分支周细胞数量（B-PC，B类)，周细胞位于与内皮细胞广泛接触的直毛细血管上（S-PC，C)和迁移周细胞（M-PC，D类)在非糖尿病和糖尿病XLacZ小鼠中(□, 非糖尿病；▪, 糖尿病）6个月后出现高血糖*P（P）< 0.05, †P（P）< 0.01.

此外，我们根据XLacZ小鼠中LacZ的表达分析了不同周细胞亚群中周细胞的丢失。在上述每个亚组中，有LacZ阳性和阴性周细胞，如图3A类–F类在所有周细胞中，52%的非糖尿病和糖尿病视网膜中LacZ染色阳性，但只有LacZ阳性周细胞显著减少。LacZ阳性周细胞减少了20%（非糖尿病组和糖尿病组：1258±134和1008±172/mm²毛细管面积；P（P）< 0.01,图4A类). LacZ阴性周细胞的数量变化不大（非糖尿病组与糖尿病组：1115±158和994±110/mm²毛细管面积；P（P）> 0.05,图4A类). LacZ阳性和LacZ阴性B-PC的数量没有变化(图4B类). S-PC的减少是由于LacZ阳性和LacZ阴性周细胞的大量丢失(图4C). LacZ阳性S-PC减少32%（非糖尿病组与糖尿病组：799±152和543±181/mm²毛细管面积；P（P）<0.05），在糖尿病动物中LacZ阴性S-PCs减少了23%（非糖尿病组与糖尿病组：878±188和674±145/mm²毛细管面积；P（P）< 0.05). 周细胞中LacZ表达阴性的M-PC数量增加。LacZ阴性M-PC增加了2.5倍以上（非糖尿病与糖尿病：21±10 vs.79±43/mm²毛细管面积；P（P）<0.01）在糖尿病视网膜中(图4D类).

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图3。

插图(A类–F类)考虑周细胞亚群在XLacZ视网膜中的位置和LacZ表达。分支周细胞(A类和D类)，与内皮广泛接触的直毛细管上的周细胞(B类和电子)和迁移周细胞(C和F类)分为LacZ阳性（例如T-PC⁺,D–F型)和LacZ阴性（例如T-PC⁻,A类–C)周细胞染色。原始放大倍数400×。（请参见http://dx.doi.org/10.2337/db08-0325以获得此图形的高质量数字表示。）

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图4。

考虑周细胞亚群在非糖尿病和糖尿病XLacZ视网膜中的位置和LacZ表达的定量。周细胞总数（T-PC，A类)和B-PC数量(B类)、S-PC(C)和M-PC(D类)在高血糖6个月后进行量化(□, 非糖尿病；▪, 糖尿病）*P（P）< 0.05, †P（P）< 0.01.

Ang-2调节对周细胞迁移的影响。

Ang-Tie系统在周细胞募集和附着中起关键作用。高血糖会上调Ang-2。因此，我们检测了Ang-2变化对周细胞迁移的影响(图5).

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图5。

调节Ang-2表达的非糖尿病和糖尿病视网膜中迁移周细胞的定量(□, 非糖尿病；▪, 糖尿病）*P（P）< 0.05, †P（P）<0.01，以及§P（P）<0.001，与非糖尿病野生型婴儿相比；‖P（P）< 0.05, ¶P（P）与糖尿病野生型幼崽相比，<0.01。Ang2LacZ，Ang2LacZ小鼠Ang-2的下调；mOpsin，在mOpsinhAng2小鼠中Ang-2过度表达。

正如预期的那样，与非糖尿病WT小鼠相比，糖尿病WT鼠的周细胞迁移数量显著增加，高达70%（非糖尿病WT:51±7和86±19周细胞/mm）²毛细管面积；P（P）< 0.001). 因此，链脲佐菌素诱导的糖尿病动物周细胞迁移增加的程度与自发性糖尿病XLacZ小鼠中观察到的程度相当。非糖尿病视网膜中Ang-2的过度表达足以模拟糖尿病WT窝鼠视网膜周细胞的迁移，迁移周细胞的数量增加了78%（非糖尿病WT与非糖尿病mOpsinhAng2:51±7和90±26周细胞/mm）²毛细管面积；P（P）< 0.01). 此外，与非糖尿病WT小鼠相比，糖尿病小鼠过度表达Ang-2使迁移周细胞的数量增加了2.3倍（非糖尿病WT/糖尿病mOpsinhAng2:51±7和118±25周细胞/mm）²毛细管面积；P（P）<0.0001），与糖尿病胎仔相比增加了37%（糖尿病胎仔与糖尿病mOpsinhAng2:86±19和118±25周细胞/mm²毛细管面积；P（P）< 0.05). 非糖尿病Ang-2缺陷小鼠周细胞迁移的定量显示，周细胞迁移显著减少36%（非糖尿病WT与非糖尿病Ang2LacZ:51±7和37±10周细胞/mm²毛细管面积；P（P）<0.05）。值得注意的是，缺乏Ang-2的糖尿病小鼠完全缺乏高血糖诱导的周细胞迁移增加（糖尿病WT与糖尿病Ang2LacZ：86±19 vs.52±15周细胞/mm²毛细管面积；P（P）<0.01）与糖尿病WT窝鼠相比。然而，高血糖略微增强了Ang2LacZ小鼠周细胞的迁移（非糖尿病Ang2LacZ vs.糖尿病Ang2-LacZ：37±10 vs.52±15周细胞/mm²毛细管面积）。

讨论

在本研究中，我们描述了实验性糖尿病视网膜病变中周细胞丢失的一种新机制。我们证明糖尿病视网膜病变中的周细胞丢失仅限于位于直毛细血管上的周细胞亚群。高血糖引起的周细胞丢失（主要在直毛细血管上）伴随着周细胞数量的增加，从同一位置迁移到血管周围位置。迁移周细胞数量增加为LacZ阴性。此外，我们发现Ang-2对周细胞迁移至关重要，因为Ang-2缺陷小鼠完全缺乏高血糖诱导的周细胞迁移，而Ang-2的过度表达模拟了糖尿病视网膜中观察到的周细胞移动增加。

实验性长期高血糖加剧周细胞脱离，导致视网膜毛细血管周细胞覆盖率降低。越来越多的证据表明，周细胞脱离和从下面的血管迁移到血管周围薄壁组织是周细胞对不同类型的应激诱导物作出反应的一个普遍特征。在脑毛细血管中，由于缺血、缺氧或损伤，周细胞从毛细血管迁移(40,41). 作为对创伤性脑损伤的反应，约40%的毛细血管周细胞从其微血管位置迁移并保持在血管周围位置，而毛细血管上的剩余周细胞显示出退化迹象。在气管毛细血管中，VEGF信号传导的阻断导致周细胞从退化的毛细血管迁移到存活的血管上，留下空的基底膜管，与在糖尿病视网膜病变中观察到的情况类似(42). 这些数据表明，周细胞的附着是根据环境条件主动调节的。

在糖尿病视网膜中，周细胞丢失是最早和最具特征的形态学改变之一。我们之前的数据揭示了Ang-2/Tie-2系统在糖尿病视网膜血管形态变化调节中的重要性。在糖尿病大鼠视网膜中，Ang-2在周细胞丢失明显之前上调，并且Ang-2表达增加与血管周细胞耗竭相关(33,35). 玻璃体内注射Ang-2导致周细胞脱落，而Ang-2单倍体不足似乎可以防止糖尿病引起的周细胞脱落。现在，我们发现Ang-2在实验性糖尿病视网膜病变中调节周细胞迁移。在功能丧失实验中，我们发现Ang-2是高血糖诱导周细胞迁移所必需的，因为与糖尿病WT小鼠相比，Ang-2缺陷小鼠缺乏周细胞迁移增加。此外，功能增强实验表明，Ang-2的过度表达增强了非糖尿病和糖尿病动物的周细胞迁移。非糖尿病视网膜中Ang-2过度表达诱导的周细胞迁移程度与在WT糖尿病动物中观察到的情况相似，突出了Ang-Tie系统在细胞串扰中的重要性及其在糖尿病视网膜病变早期阶段的参与。然而，我们发现高血糖导致Ang-2过度表达和缺乏的视网膜周细胞迁移增加的趋势，这表明Ang-2以外的其他因素可能对周细胞迁移具有一定的重要性。最近对微血管内皮细胞的观察表明，高糖通过甲基乙二醛（一种重要的细胞内晚期糖基化终产物，AGE）修饰辅升压因子mSim3A来增加Ang-2的表达(43). 由于甲基乙二醛是糖尿病视网膜中主要的细胞内AGE，本研究将糖尿病的生化变化与Ang-2/Tie-2系统的激活增加联系起来，因此与我们的观察结果相联系，即高血糖促进周细胞从微血管中分离和迁移，导致糖尿病视网膜病变典型的周细胞丢失。

此外，我们的数据表明，高血糖诱导的周细胞损失在视网膜周细胞亚群中是不相等的，因为它仅限于位于视网膜微血管直毛细管上的周细胞。直毛细血管是周细胞迁移的唯一场所。根据我们的观察，高血糖使S-PC的数量每毫米减少约460个细胞²高血糖6个月后毛细血管面积增加，同时周细胞迁移数每毫米增加约80个细胞²毛细管面积。周细胞丢失和迁移数量之间的差距部分是由于消化过程造成的，因为消化过程消除了完全游离的周细胞。此外，视网膜消化制剂代表了永久性重塑血管的快照。实验性糖尿病视网膜病变中周细胞迁移对周细胞丢失的定量贡献以及游离周细胞的命运尚待确定。

XLacZ小鼠中的LacZ标记了约52%的周细胞，因此是限制性周细胞标记物，如其他标记物。然而，周细胞总数和LacZ表达的定量显示，糖尿病视网膜中只有LacZ阳性周细胞显著减少。因此，表达LacZ的周细胞的定量可以为实验性糖尿病视网膜病变中周细胞损失的定量提供一种简化的方法。此外，我们发现，从LacZ阴性的周细胞中，迁移的周细胞数量增加。这与已发表的数据一致，这些数据表明LacZ表达细胞的增殖和迁移与转基因下调有关，血管损伤导致周细胞亚群中标记物表达的变化(29).

糖尿病视网膜病变早期周细胞丢失的原因尚未完全阐明。大量研究表明，细胞培养中葡萄糖和AGEs水平的升高会触发周细胞死亡，人类糖尿病视网膜和实验性糖尿病视网膜病变中周细胞凋亡增加(44–47). 然而，周细胞凋亡不能解释实验性糖尿病视网膜病变周细胞丢失的总程度及其时间进程。在糖尿病视网膜病变的动物模型中，在高血糖超过6个月后的后期检测到周细胞凋亡(31). 与这一观察结果不一致的是，在实验性糖尿病3个月后，周细胞明显减少(33). 周细胞迁移作为糖尿病视网膜病变周细胞丢失的一种替代或补充机制，为周细胞丢失总程度与糖尿病视网膜周细胞凋亡的公开数据之间的差异提供了可能的解释。

总之，我们的数据提供了形态学证据，表明周细胞迁移是糖尿病视网膜周细胞丢失的一种新机制。我们进一步表明，这种机制是通过Ang-2/Tie-2途径进行信号调节的。这一过程的确切机制以及静止和迁移周细胞的命运仍有待研究。

致谢

笔记

印刷前在http://diabetes.diabetesjournals.org2008年6月16日。

F.P.和Y.F为这项工作做出了同等贡献。

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参考文献