公共科学图书馆-遗传学。2008年9月；4（9）：e1000176。
肾肿瘤细胞瘤19号染色体体细胞配对与ELGN2介导的氧敏感反应解除相关
,#1 ,#2 ,#三,4,5,6 ,三 ,三 ,1 ,2 ,三 ,三 ,7 ,7 ,8 ,三 ,9 ,10,11,12 ,12,13 ,1 ,三,4 ,2和7,*
朱莉·M·科曼
1美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所种系改良和细胞遗传学实验室
瑞安·C·拉塞尔
2加拿大安大略省多伦多市多伦多大学实验医学和病理生物学系
闵行滩
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
4新加坡国家癌症中心NCCS-VARI转化研究实验室
5新加坡国家癌症中心肿瘤内科
6新加坡国立大学社区、职业和家庭医学系分子流行病学中心
大卫·佩蒂略
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
迈克尔·韦斯特法尔
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
凯瑟琳·科尔泽
1美国密歇根州大急流城Van Andel研究所种系修饰和细胞遗传学实验室
朱莉·梅特卡夫
2加拿大安大略省多伦多市多伦多大学实验医学和病理生物学系
张忠发
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
松田大辅
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
卡尔·戴克马
7计算生物学实验室，美国密歇根州大急流城Van Andel研究所
希瑟·L·豪斯曼
7计算生物学实验室，美国密歇根州大急流城Van Andel研究所
埃里克·科特
8美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所分子流行病学实验室
劳拉·弗格
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
理查德·J·卡诺斯基
9美国密歇根州大急流城光谱健康医院泌尿科
斯特芬妮·理查德
10Génétique肿瘤学EPHE、法国肾癌联合会、AP-HP、法国克里姆林宫泌尿科服务
11CNRS FRE 2939，法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所
12法国肾癌联合会，法国巴黎
安妮克·维埃利尔丰德
12法国肾癌联合会，法国巴黎
13法国巴黎科钦AP-HP解剖病理实验室
帕梅拉·斯威特克
1美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所种系改良和细胞遗传学实验室
Bin Tean Teh公司
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
4新加坡国家癌症中心NCCS-VARI转化研究实验室
迈克尔噢
2加拿大安大略省多伦多市多伦多大学实验医学和病理生物学系
凯尔·A·弗格
7计算生物学实验室，美国密歇根州大急流城Van Andel研究所
布鲁斯·克鲁曼，编辑器
1美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所种系改良和细胞遗传学实验室
2加拿大安大略省多伦多市多伦多大学实验医学和病理生物学系
三美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症遗传学实验室
4新加坡国家癌症中心NCCS-VARI转化研究实验室
5新加坡国家癌症中心肿瘤内科
6新加坡国立大学社区、职业和家庭医学系分子流行病学中心
7计算生物学实验室，美国密歇根州大急流城Van Andel研究所
8美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所分子流行病学实验室
9美国密歇根州大急流城光谱健康医院泌尿科
10Génétique肿瘤学EPHE、法国肾癌联合会、AP-HP、法国克里姆林宫泌尿科服务
11CNRS FRE 2939，法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所
12法国肾癌联合会，法国巴黎
13法国巴黎科钦医院AP-HP病理分析实验室
美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心
#贡献均等。
构思并设计了实验：BTT MO KAF。执行实验：JK RR DP MW KK DM LF。分析数据：JK RR JM ZZ HH EK KAF。贡献的试剂/材料/分析工具：MHT KD EK RK SR AV PS BTT MO KAF。撰写论文：PS BTT MO KAF。
收到日期：2008年3月27日；2008年7月18日验收。
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- 补充资料
图S1：肾肿瘤的区域转录异常。（0.06百万PDF）
GUID:BB634F8E-A26E-4DA6-A73A-630C1D33B9D9
图S2：EGLN2在嫌色细胞癌中的表达。（0.22 MB PDF格式）
GUID:9D8D5132-8C70-46C3-9DFF-44D54F47DD9B
图S3：HIF1蛋白和HIF1 DNA结合活性水平对氧浓度变化的响应。（0.22 MB PDF格式）
GUID:D6B5976F-3157-41CB-9CEE-018797EB7001
图S4：BNIP3L表达与HIF表达相关。（0.15 MB PDF格式）
GUID:BFE22553-4A54-4032-A4C5-12814EAB6B1E
图S5：嗜酸细胞瘤中抑制的低氧反应基因被EGLN2抑制。（0.01 MB PDF格式）
编号：F7334A9C-7534-4A72-92ED-4FD46649B2E1
表S1：RCC中的19号染色体FISH模式。（0.04 MB PDF格式）
GUID:FAFFD312-D820-4033-A9C5-50042A3C9B86
表S2：嗜酸细胞瘤的19号染色体FISH图谱。（0.04 MB PDF格式）
GUID:6E9DC5D1-68EA-4FA3-AF6A-D63C8FCF2E93
表S3：与癌症相关的基因定位到染色体19q。（0.07 MB PDF格式）
GUID:2F326106-523F-4CE8-8534-49FEA715FA49
摘要
染色体异常，如结构和数量异常，是癌症中常见的现象。在癌细胞中观察到在间期同源染色体的紧密结合，这是一种称为体细胞染色体配对的现象，但体细胞配对的功能后果尚未确定。基因表达谱研究表明，19号染色体的体细胞配对是肾嗜酸细胞瘤（成人肾脏的一种肿瘤）中反复出现的染色体异常。体细胞配对与配对区域内基因表达的显著中断相关，并导致脯氨酰羟化酶ELGN2（一种调节缺氧诱导因子（HIF）氧依赖性降解的关键蛋白）的放松调节。肾嗜酸细胞瘤中ELGN2的过度表达增加了泛素介导的HIF破坏，同时抑制了几个HIF靶基因的表达，包括促死亡基因BNIP3L型基因。与19号染色体体细胞配对相关的转录变化模拟了DNA扩增后发生的转录变化。因此，除了数量和结构染色体异常外，染色体空间动力学的改变应被视为与肿瘤发生相关的基因组事件。识别EGLN2型作为一个在成对染色体区域内定位的显著放松调控的基因，它直接暗示了肾嗜酸细胞瘤生物学中氧敏感网络的缺陷。
作者摘要
肾嗜酸细胞瘤和肾嫌色细胞癌（RCC）约占肾切除肿块的10%。然而，与这些肿瘤发展相关的分子缺陷尚不清楚。在这里，我们利用遗传学和计算分析的最新进展筛查肾嗜酸细胞瘤和嫌色细胞癌中存在的染色体异常。我们发现，尽管嫌色性肾细胞癌细胞含有额外的19号染色体拷贝，但肾肿瘤细胞瘤细胞含有罕见的染色体异常。这两种染色体异常都会导致EGLN2型，一个位于19号染色体上的基因，对细胞对氧水平变化的反应至关重要。在其他类型的肾肿瘤中发现了氧感应缺陷EGLN2型也直接暗示了这些肿瘤中氧传感网络的缺陷。这些发现很重要，因为肾嗜酸细胞瘤中的染色体缺陷也可能存在于其他肿瘤细胞中。此外，对EGLN2型揭示了一种独特的方式，即氧感应的扰动与疾病相关。
介绍
细胞对氧张力变化的适应对细胞的完整性、维持和生存至关重要。低氧诱导因子（HIF）是一种由α和β亚基组成的异二聚体，是普遍存在的氧敏感途径的主要转录因子[1]虽然HIFβ是组成型表达和稳定的，但HIFα由于氧依赖性降解（ODD）结构域而对氧不稳定，该结构域经历快速的氧依赖性泛素介导的破坏[2]–[5]因此，HIFα的稳定性决定了HIF的转录活性[6]HIFα稳定性的关键调节因子是脯氨酰羟化酶结构域包含酶（PHD/EGLNs），在氧气存在下，该酶在ODD结构域内的保守脯氨酸上羟基化HIFα[7],[8]羟基化HIFα被von Hippel-Lindau（VHL）蛋白识别。VHL是E3泛素连接酶ECV（Elongins/Cul2/VHL）的底物一致性成分，该酶特异性地将脯氨酰羟基化HIFα聚泛素化，然后通过26S蛋白酶体进行破坏。
HIFα调节蛋白的解除与癌症的发展密切相关。缺陷的种系遗传VHL（甚高频）染色体3p25上的等位基因是VHL疾病的病因，其特征是透明细胞肾细胞癌（RCC）、小脑血管母细胞瘤、嗜铬细胞瘤和视网膜血管瘤的发病率很高[9]易感细胞中剩余的野生型VHL等位基因的失活导致肿瘤形成。体细胞双等位基因失活VHL（甚高频）还导致散发性透明细胞癌的发生，这是成人肾癌的主要形式[10]–[12]缺乏功能性VHL的细胞由于不能降解HIFα而表现出许多低氧诱导基因的高表达。除VHL外，脯氨酰羟化酶PHD/EGLN家族的失调也与细胞异常生长有关。以红细胞过多为特征的红细胞增多症的发展与PHD2/EGLN1的种系突变失活有关[13],[14]嗜铬细胞瘤是肾上腺髓质的一种神经内分泌肿瘤，与PHD3/EGLN3的失调有关[15].
虽然VHL的双等位基因失活存在于大多数透明细胞癌中，但肾癌是一种异质性疾病，根据形态学和细胞遗传学特征可分为几个亚型[16],[17]嫌色性肾细胞癌和肾嗜酸细胞瘤是两种相关的肾肿瘤，约占所有肾肿块的10%。与透明细胞RCC相比，VHL（甚高频）在这些肿瘤亚型中未发现低氧诱导基因的突变和/或表达增加，与肿瘤发展相关的分子遗传缺陷尚不清楚。肾嗜酸细胞瘤中分子遗传缺陷的鉴定尤其具有挑战性，因为这些细胞通常被描述为核型正常，并且在这种肿瘤亚型中很少存在可用于搜索肿瘤修饰基因的细胞遗传学异常区域。
为了确定与肾肿瘤发展相关的分子缺陷，我们分析了各种肾肿瘤的基因表达数据。该分析显示肾嗜酸细胞瘤和嫌色细胞癌沿第19染色体有显著的转录中断。在嫌色细胞性肾细胞癌中，断裂反映了19号染色体的扩增，而在肾嗜酸细胞瘤细胞中，断裂则反映了19q号染色体在间期的紧密联系或配对。EGLN2型位于配对区域内的细胞在肾嗜酸细胞瘤细胞中显著过度表达，并与许多低氧诱导基因（包括促死亡基因）的失调有关BNIP3L型因此，肾嗜酸细胞瘤中的染色体19q配对揭示了通过改变EGLN2的表达来破坏氧稳态的独特机制。
结果
对肾嗜酸细胞瘤和嫌色细胞癌的基因表达谱数据进行扫描，以确定RNA生成的区域性增加或减少，这通常表明存在染色体扩增或缺失[18]–[24]与之前的细胞遗传学研究一致，肾嗜酸细胞瘤细胞基本上没有反映DNA扩增或缺失的转录异常。相反，1、2、6、10和17号染色体的缺失在嫌色细胞癌中常见。在我们的染色体恐惧症RCC样本中，这些公认的染色体丢失强烈反映在基因表达谱数据中(). 此外，在肾嗜酸细胞瘤和嫌色性肾细胞癌中经常发现涉及chr 19基因定位的转录异常，但在肾细胞癌的其他亚型中没有发现(和图S1). 在肾嗜酸细胞瘤中，转录异常主要涉及19号染色体的q臂，而在嫌色性肾细胞癌中，该异常涉及整个染色体().
嗜酸细胞瘤和嫌色细胞癌的转录异常。（A） 肾嗜酸细胞瘤（ON，n个 = 10） 和嫌色RCC（CR，n个 = 10） 相对于未患病的肾脏(n个 = 10） 使用比较基因组微阵列分析（CGMA）方法进行鉴定，如材料和方法.Plotted是结果t吨-每个染色体臂的统计数据。仅显示最重要的结果(P（P）<0.005). （B） 对于chr 19上的每个基因，平均对数2-将嗜酸细胞瘤或嫌色细胞癌RCC与非病变肾脏的转化表达率与基因组位置相关。红色圆圈表示着丝粒的位置。将平滑曲线拟合到日志中2-转换数据以突出显示包含过多上调基因的区域。（C） 肾嗜酸细胞瘤（ON）和嫌色细胞癌（CR）中DNA拷贝数总体增加（绿色）或减少（红色）的基因组区域。SNP衍生的DNA拷贝数按照材料和方法。所有肿瘤样本均取自女性患者，但所示单个男性样本除外（M）。（D） 对于chr 19上的每个SNP，平均对数2-转化DNA拷贝数比率与嗜酸细胞瘤的比较(n个 = 4） 或嫌色RCC(n个 = 3） 根据（C）中所述的基因组位置绘制合并正常参考。
总RNA产量的区域性增加通常表明存在潜在的DNA扩增。由于之前未报告19号染色体的获得是肾嗜酸细胞瘤或嫌色细胞癌的复发性异常，因此使用高密度单核苷酸多态性（SNP）阵列对这些样本的子集进行DNA拷贝数分析。根据SNP数据，在嫌色细胞癌样本中检测到19号染色体的全部扩增(). 荧光原位杂交（FISH）使用定位于19号染色体p和q臂的局部特异探针证实了这种全染色体扩增(表S1). 相反，在肾嗜酸细胞瘤样本中未检测到DNA拷贝数的变化(). 作为DNA拷贝数分析的阳性对照，只检测了来自女性患者的嗜酸细胞瘤（ON）样本，并在这些样本中清楚地检测到X染色体的相对增益().
为了更详细地确定19号染色体在肾嗜酸细胞瘤细胞中的状态，使用一组FISH探针对该染色体进行了进一步评估。当使用特定于chr 19p臂的探针时，经常观察到两个明显且分离良好的FISH信号，这是二倍体细胞间期的典型特征(和表S2). 相反，当使用特定于chr 19q臂的探针时，经常会观察到一个大的单个FISH信号（单线）或两个非常接近的FISH（近端双线）信号。大约35%的被检测细胞含有单重态信号，而另外18%的细胞含有近端双重态信号(表S2以及未示出的数据）。
肾嗜酸细胞瘤的体细胞染色体配对。肾嗜酸细胞瘤接触制剂上三色间期FISH的代表性显微照片。白色箭头表示大的单线或近端双线信号。在所有图像中，DAPI复染以蓝色显示。（A、B）用19p13.3（绿色）和19q13.31（红色）探针标记。在多个细胞中量化19q13.31信号的图像区域(n个 = 25）在同一图像平面中。显示了面积平均值和标准误差。（C，E，F）用19p端粒（绿色）和19q端粒（红色）探针或19p12（绿色）标记，并用α卫星探针标记chr 19，该探针也与染色体1和5（红色）交叉杂交。插图突出了着丝粒图案。（D） 常见FISH模式的示意图。（G，H）用于chr 19 p臂（红色）和chr 19 q-arm（绿色）的全臂染色体涂料（WCP）。插图显示了一个正常的单元格。成对染色体的示意图如下所示。虚线表示垂直于图像平面的染色体区域。
采用半定量图像分析检测大FISH单峰的特征(). 该分析表明，单态FISH信号的大小平均是两个分离良好的19q FISH讯号大小的1.5倍(P（P） = 0.02). 使用针对染色体q臂的多个探针（包括着丝粒和端粒探针）观察到了这种大信号(). 大FISH单倍体与体配对染色体研究中观察到的FISH信号有惊人的相似性[25]–[27]体细胞配对是指同源染色体的紧密结合，通常与减数分裂前期的染色体相结合。然而，在正常人细胞和一些肿瘤细胞的间期也观察到体细胞配对[26],[28]–[32]大的FISH单线态的存在反映了由两个非常接近的染色体区域产生的重叠FISH信号[26],[27]缺乏DNA拷贝数变化的证据，再加上使用多个位置特异性探针检测到的大FISH单倍体和近端双倍体，表明chr 19q是身体配对的。
为了证实chr 19的q臂在肾嗜酸细胞瘤细胞中是体细胞配对的，利用全臂染色体涂片（WCP）同时观察chr 19 p臂和q臂。使用这种方法，在肾嗜酸细胞瘤细胞中经常观察到两个不同的p臂，这是典型的二倍体间期细胞(和表S2). 然而，大多数细胞含有一个位于两个p臂信号附近的单个q臂信号。虽然WCP的扩散性质阻止了荧光信号的量化，但这种模式与特定于位置的FISH分析一致，并进一步表明染色体的q臂在这些细胞中非常接近或成对。
伴随体细胞配对的基因表达变化表明，一个或多个与肿瘤发展相关的基因的放松调控映射在配对的chr 19q区域内。由于氧敏感网络的放松调节在其他类型的散发性肾细胞癌中是常见的事件，因此从Entrez基因数据库中鉴定出与HIF调节相关的基因以及与chr 19q相关的基因，并测试其表达缺陷（参见材料和方法). 我们还通过额外的文献检索确定了与肾癌相关的其他基因(表S3). 两种分析都确定EGLN2/PHD1是该区域的可能候选基因。为了验证脯氨酰羟化酶EGLN2/PHD1在肾嗜酸细胞瘤细胞中的调节显著解除，对这些肿瘤中EGLN2蛋白的水平进行了评估(). 对匹配的嗜酸细胞瘤-正常组织对的分析显示，与在相应的正常组织中观察到的水平相比，嗜酸细胞瘤肿瘤中的EGLN2水平显著增加。在检测的3个嫌色细胞中，有2个也观察到EGLN2的高表达(图S2). 这些结果与在透明细胞RCC中发现的EGLN2水平形成对比。与基因表达数据一致，在患者来源的透明细胞RCC样本中几乎没有检测到EGLN2蛋白，而在匹配的正常样本中，通过Western blot分析可以观察到低基础量的EGLN2().
肾嗜酸细胞瘤中EGLN2的过度表达。（A） 通过基因表达微阵列测定EGLN2的相对表达。（B） 对从嗜酸细胞瘤（T）或患者匹配的正常组织（N）样本（第3–8列，顶面板）和外源性表达的EGLN2对照（第1–2列，顶板）制备的全细胞提取物进行抗-EGLN2免疫印迹分析。用含有人EGLN2的质粒或单独的空载体（MOCK）转染U2OS；EGLN2表现为45kDa的单带。作为负荷对照，对全细胞提取物进行抗木犀草素免疫印迹。星号（*）表示背景带。（C） 对肾透明细胞癌（T）或与患者匹配的正常组织（N）样品制备的全细胞提取物进行抗EGLN2免疫印迹分析，如（B）所述，但需要较长的胶片曝光时间才能显示正常组织中的EGLN2蛋白。（D） 使用或不使用富含EGLN2的细胞提取物处理体外翻译的Gal4-HA-HIF-1αODD（WT）和Gal4-HA-HIF-1βODD（PA），并与体外翻译的35S标记的HA-VHL。反应混合物用抗Gal4抗体进行免疫沉淀，结合蛋白在SDS-PAGE上溶解，并通过放射自显影术进行可视化（3-6道）。体外翻译35S标记的HA-VHL也用抗HA或抗Gal4抗体作为输入对照物进行免疫沉淀（通道1和2），并通过放射自显影术进行可视化。（E） 体外泛素化35在不含VHL或用VHL重组的S100细胞提取物中进行S标记的Gal4-HA-HIF-1αODD（WT），用增加量的外源EGLN2处理。除通道6外，所有反应混合物均得到纯化的泛素。反应混合物用抗Gal4抗体进行免疫沉淀，在SDS-PAGE上进行解析，并通过放射自显影术进行可视化。*表示未表征的修饰Gal4-HA-HIF-1αODD；IP：免疫沉淀；AR：放射自显影术。
EGLN2是已知的三种脯氨酰羟基化酶之一，可在翻译后修饰HIFα，这是VHL介导的HIFα破坏所必需的。为了探讨EGLN2表达增加是否影响HIF-1αODD通过VHL的结合和泛素化，在体外翻译35标有S的HA-VHL和在体外将翻译的未标记Gal4-HA-HIF-1αODD混合在EGLN2富集的提取物中（参见材料和方法). EGLN2的富集导致VHL与野生型ODD的关联增加，但没有导致突变ODD，其中对VHL结合至关重要的脯氨酸残基变为丙氨酸（P546A）(). 此外在体外HIF-1αODD泛素化分析用于确定VHL-HIF-1βODD相关性增加是否导致HIF-1γODD泛素化增加。EGLN2水平的增加导致VHL介导的HIF-1αODD泛素化的剂量依赖性增加(). 这些结果表明，嗜酸细胞瘤中EGLN2的过度表达可进一步降低HIFα水平，使其低于正常组织中的水平。
在透明细胞RCC中，由于VHL功能失活导致HIFα增加，从而诱导转录程序模拟细胞暴露于缺氧条件。相反，在肾嗜酸细胞瘤中，EGLN2表达增加的功能作用是降低HIFα水平。为了研究HIFα降低的细胞效应，我们重新评估了以前发表的测量HIF-1 DNA结合活性、HIF-1α蛋白水平和HIF-1β蛋白水平的数据，这些数据是在暴露于缺氧和缺氧条件下的细胞中测量的[6]肾皮质的缺氧状态估计为3-5%的氧气[6]缺氧状态的诱导与HIFα和HIF活性水平的显著增加有关(). 具体而言，氧气浓度降低6倍（氧气含量为3%至0.5%）导致HIF-1α水平增加约4倍（密度测定单位为2.5至9.8）。此外，我们注意到，在诱导过氧化条件下，HIF-1α水平以类似的方式发生变化：氧浓度增加6倍（氧含量为3%至18%）导致HIF-1β水平下降3倍以上（密度测定单位为2.5至0.75）。如果HIF剂量反应数据以对数标度而非线性标度绘制，则HIF-1α降低与高氧状态之间的关联更容易评估(). 对数转换数据遵循直线，表明HIFα水平和氧浓度遵循幂律关系（即。，f（x） = 斧头k个)而不是指数关系（即。，f（x） = 灵魂x个). 幂律关系的生物学含义是n个-氧浓度的倍数变化导致成比例n个-HIF-1α水平和HIF活性的折叠变化(图S3). 此外，这些结果表明，虽然HIF-1α的增加与缺氧条件有关，但HIF-1β的减少与缺氧条件相关。
与高氧细胞状态相关的HIF水平降低。（A） HIF-1α蛋白水平（•）、HIF-1β蛋白水平（▴）和HIF-1 DNA结合活性（⧫）的归一化密度测定，如Jiang等人的文章。大（•）突出显示了两幅图中3%的氧HIF-1α蛋白水平。（B） （A）中给出的密度测定数据和氧浓度数据为对数2-转换并重新绘制。还显示了最佳拟合线的汇总统计信息。透明细胞RCC中HIF靶基因的相对基因表达水平(n个 = 10） 和肾嗜酸细胞瘤(n个 = 10） 与非病变肾脏的比较(n个 = 12). 对于每个基因，红色表示表达增加，蓝色表示表达减少。（E） 的相对表达式BNI3PL公司由基因表达谱确定。
为了确定EGLN2过度表达是否在肾嗜酸细胞瘤细胞中诱导HIF介导的高氧细胞反应，我们检测了肾嗜酸细胞瘤细胞和透明细胞肾细胞癌中几个已知HIF靶基因的表达模式，以进行比较[33]与透明细胞肾细胞癌中存在的VHL缺陷一致，基因集富集分析显示，透明细胞肾细胞核癌中HIF-1靶基因显著上调(P（P） = 0.0001;). 显著上调的基因包括碳酸酐酶IX(CA9公司)，铁氧化酶(人物配对关系)，血管内皮生长因子A(VEGFA（血管内皮生长因子）)和葡萄糖转运蛋白(GLUT1公司). 然而，在肾嗜酸细胞瘤细胞中，不同群体的HIF靶基因显著下调(P（P） = 0.01;). 具体来说，HIF靶基因血红素加氧酶1(HMOX1型)，烯醇化酶1(ENO1公司)和Cbp/p300相互作用的交易激活因子(引用2)显著下调，但诸如第9页,VEGFA（血管内皮生长因子）、和GLUT1公司不是。此外，最近发现的肿瘤抑制因子BNIP3L型肾嗜酸细胞瘤细胞下调三倍().BNIP3L型是Bcl-2家族中受氧调节的成员(图S4). BNIP3L是一种促死亡基因（诱导凋亡、坏死和自噬特征），在异种移植研究中，敲除该基因足以将非肿瘤细胞系转化为肿瘤细胞系[34]–[36]在支持方面，缺氧模拟治疗显著诱导了BNIP3L型,HMOX1型,ENO1公司、和引用2(和图S5)，异位瞬时表达EGLN2型生理性缺氧（周期性0-7%氧气暴露[37])与转染空质粒的细胞相比，这些基因的表达水平降低(和图S5). 这些结果表明EGLN2的过度表达可以下调HIF1反应因子，如BNIP3L。此外，当HIF靶基因上调时，如VEGFA（血管内皮生长因子）这些结果表明HIF靶基因不同亚群的下调与肾嗜酸细胞瘤的发生有关。
BNI3PL由EGLN2介导的氧敏感反应调节。（A）BNIP3L型在生理性缺氧（周期性0–7%氧气）或高氧（21%氧气）条件下，通过qRT-PCR检测转染EGLN2或空质粒（MOCK）质粒的U2OS细胞的表达水平（左侧面板）。BNIP3L型用qRT-PCR测定在有或无CoCl的高氧条件下维持的U2OS细胞的表达水平2（右侧面板）。BNIP3L表达归一化为β-肌动蛋白，MOCK转染细胞中的表达任意设置为1。误差条表示标准化值与一式三份MOCK之间的标准偏差。（B） 实验在CAKI细胞中进行，通过Western blot分析检测到BNIP3L水平。用编码EGLN2或空质粒（MOCK）的质粒转染CAKI细胞，裂解，等量的细胞裂解物在SDS-PAGE上分离，并用指示的抗体进行免疫印迹（左侧面板）。在高氧条件下生长的CAKI细胞用或不用氯化钴处理2用SDS-PAGE溶解等量的细胞裂解物，并用所示抗体进行免疫印迹（右侧）。
讨论
适当的氧感应反应对维持正常细胞功能至关重要。缺氧诱导因子（HIF）是缺氧适应性反应的主要驱动因素，其失调与包括癌症在内的多种疾病的发病机制有关。虽然缺氧肿瘤微环境——通过无处不在的氧感应途径——导致HIF活性的调节，但越来越多的肿瘤抑制基因中的功能丧失突变也会影响HIF功能。已在肿瘤细胞中发现PTEN、PML、TSC和VHL的突变，这些突变通过涉及Akt/PI3K、mTOR和泛素途径的多种不同机制导致HIF的放松调节。新的证据表明，致癌突变直接影响EGLN。例如琥珀酸脱氢酶(SDH公司)导致琥珀酸在细胞内积累，从而抑制EGLNs，导致HIF-1α的稳定和激活[38],[39]EGLN1中的灭活种系突变已被鉴定可引起红细胞增多症[13],[14]EGLN3的失调与嗜铬细胞瘤（肾上腺的一种神经内分泌肿瘤）的发生有关[15].
在这项研究中，我们发现chr 19q的体细胞配对是肾嗜酸细胞瘤中的一种复发性细胞遗传学异常，导致配对区域内转录的剧烈变化。染色体连接的功能后果在形式上尚不清楚，但它可能会破坏染色质结构，导致顺式和反式调节大量基因转录的调控区域。识别EGLN2型作为一个在成对chr19q区域内定位的显著放松调控的基因，它直接与肾嗜酸细胞瘤的病理生物学中的氧敏感网络缺陷有关。这些结果表明，除了数量和结构染色体异常外，体细胞配对应被视为与肿瘤发生相关的染色体事件。
虽然EGLN2的丢失不会导致HIF1α积累减少，可能是由于EGLN3的代偿活性，但本研究的数据表明，ELGN2的过度表达导致HIF1水平降低。最近，一种称为Siah2的E3泛素连接酶被鉴定为靶向EGLN2进行泛素介导的破坏，从而揭示了HIF调节的另一个水平[40]Siah2的活性是在生理性缺氧（<10%氧气）下诱导的，导致EGLN2水平降低和HIF-1α稳定。本研究结果表明，通过体细胞配对过度表达EGLN2足以抵消生理性缺氧条件下Siah2的抑制活性。在高氧条件下（21%氧气；常用作实验常氧），Siah2活性通过一种已知机制减弱，导致EGLN2丰度增加，HIF-1α水平随之降低[40]。EGLN2在21%氧气下的异位表达并没有导致HIF靶基因表达的进一步降低（数据未显示），这可能是因为内源性EGLN2高度丰富，或者在高氧条件下每个可用的EGLN2.都已被激活。
HIF调节基因参与许多生理过程，包括血管生成、代谢、细胞增殖、存活和凋亡。因此，HIF调控的中断可能会影响几种有助于正常细胞转化为癌细胞的调控途径。避免凋亡是癌细胞的特征之一，是一个关键的致癌事件。BNIP3L是p53依赖性凋亡的调节器，BNIP3L的沉默与肿瘤发生性增强和凋亡反应降低有关[36]我们在这里表明BNIP3L是部分受EGLN2调控的几个HIF应答基因之一。因此，我们认为BNIP3L的下调是染色体激活诱导EGLN2上调的结果，BNIP3L的下调有助于抑制凋亡，促进嗜酸细胞瘤细胞的生存和生长。
HIF活性的破坏与VHL疾病、散发性透明细胞肾癌和遗传性乳头状肾癌相关[38],[41],[42]本研究揭示了肾嗜酸细胞瘤和嫌色细胞癌（表现为DNA扩增介导的EGLN2上调）中氧感应反应的失调，从而支持HIF通路的功能障碍，这是肾癌发病机制中的一个常见且可能是中心主题。
材料和方法
鱼类和WCP
细菌人工染色体（BAC）RP11-157B13（19p12）、RP11-1137G4（19p13.3）、RP11-15A1（19q13.31）来自奥克兰儿童医院研究所(http://bacpac.chori.org)BAC CTC-429C10（19q13.41）从Invitrogen（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）购买。通过刻痕翻译将这些克隆标记为SpectrumGreen或SpectrumOrange（伊利诺伊州德斯普莱恩斯的雅培分子公司），并按说明应用于嗜酸细胞瘤样本的组织接触制备[49]，不同之处在于用VECTASHIELD（Vector Laboratories，Inc.Burlingame，CA）抗褪色4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对载玻片进行复染。端粒特异性DNA探针、chr 1,5,19α卫星探针和手臂特异性涂料购自Q-BIOgene（MP Biomedicals，Solon，OH）。根据制造商提供的协议，使用这些探针进行FISH。由于α卫星探针与1号染色体和5号染色体杂交，在所有研究中，19号染色体与一个位于着丝粒远端的探针RP11-157B13（19p12）共同标记。此外，对控制细胞中期扩散的着丝粒探针的分析表明，与1号染色体杂交会产生明显明亮的信号（数据未显示）。这些杂交特性可以区分chr 1和5杂交。
图像分析
为了进行图像量化，获得了三张分别包含五个、六个和三个细胞的单独显微照片，其中19q31.31 FISH信号位于同一图像平面。使用rtiff公司R环境的包[50]使用Ridler和Calvard方法自动从背景中分割荧光FISH信号[51]，使用连接分量算法识别单个斑点[52]，并计算每个特征的像素数。比较了12个双态FISH信号和8个单态FISH信号。使用单侧学生的t吨-测试。
细胞
U2OS骨肉瘤细胞和CAKI肾透明细胞癌细胞系取自美国类型培养物收集中心（马里兰州罗克维尔），并在37°C的Dulbecco改良Eagle’s培养基中保存，该培养基补充有10%的热灭活胎牛血清（西格玛，密尔沃基，威斯康星州），加湿5%的CO2大气。在37°C的湿化室中对细胞进行周期性缺氧处理，并用5%CO冲洗2余额N230分钟，然后是5%CO2和7%O2余额N230分钟为一个循环。细胞在这些培养箱中培养16小时[53].
抗体
多克隆抗EGLN2和抗BNIP3L抗体分别从Bethyl Laboratories（德克萨斯州蒙哥马利）和Sigma（威斯康星州密尔沃基）获得。多克隆HIF1α和单克隆HIF2α抗体分别来自BD Biosciences（加利福尼亚州圣何塞）和Novus（科罗拉多州利特尔顿）。从Abcam（马萨诸塞州剑桥）获得单克隆抗病毒抗体。
质粒
哺乳动物表达质粒pcEglN2是由Mircea Ivan博士的礼物Flag-EglN2通过PCR产生的，使用引物5′-GACGAGGATCCATGGACAGCCCGCGC-3′和5′-GACGATATTCCTAGGTGGCGTAGGCGC-3′然后将PCR产物连接到巴姆HI和生态pcDNA3（+）中的RI位点。质粒经直接DNA测序证实。
定量实时PCR
对于第一链cDNA合成，1µl寡核苷酸（dT）23将引物（Sigma）与5µg RNA和蒸馏H孵育2O（总反应体积为20µl），在70°C下，在热循环中保持10分钟（MJ Research，马萨诸塞州波士顿）。将混合物冷却至4°C，此时加入4µl 5×第一链反应缓冲液、2µl 0.1M DTT、1µl 10mM浓度的每种脱氧核苷三磷酸和1µl Superscript II逆转录酶（Invitrogen）。cDNA合成在42℃下进行1.5 h，然后在热循环中在70℃下进行15 min。将人类基因组DNA标准品（人类基因组DNA从德国曼海姆罗氏公司获得）或相当于20 ng总RNA的cDNA添加到定量PCR（qPCR）反应混合物中，最终体积为10µl，含有1×PCR缓冲液（不含MgCl）2)，3 mM氯化镁2，0.25单位铂金塔克DNA聚合酶、0.2 mM浓度的每种脱氧核苷三磷酸、0.3µl SYBR Green I、0.2µl ROX参考染料和0.5µM浓度的每个引物（Invitrogen）。扩增条件如下：95°C（3分钟）、40个95°C周期（10秒）、65°C（15秒）、72°C（20秒）和95°C循环（15秒。qPCR使用ABI Prism 7900HT序列检测系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行。使用Primer Express（Applied Biosystems）设计的基因特异性寡核苷酸引物如下：BNIP3L型底漆组(5′-CTGCACAAAACTTGCACATTG-3′和5′-TAATTTCCAACGGGTTCA-3′),HMOX1型底漆组(5′-GAATTCTCTTGGCTGGCTTC-3′和5′-TCCCTTCCTCTTCTCCAGAGA-3′),ENO1公司底漆组(5′-CAGCTCTAGCTTGCAGTCG-3′和5′-GACACGAGGCTCACATGACT-3′),引用2底漆组(5′-ACTGCACAAACTGCCATC-3′和5′-CAGCCAACTTGAAAGTGAACA-3′),内参底漆组(5′-GGATCGGCGGCTCACAT-3′和5′-CATACTCCTGCTCTGATCCA-3′),GLUT-1型底漆组(5′-CACCACCTCCACTCCTGTACT-3′和5′-CAAGCATTTCAAACCATGTTTTA-3′). SYBR Green I在qPCR的每个周期中以与当时存在的扩增cDNA（扩增子）数量成比例的量发出荧光。荧光信号在背景上具有统计显著性的点被定义为周期阈值(C类T型). 通过取平均值来确定各种转录物的表达水平C类T型每种cDNA样品的值一式三份，并根据标准图测量C类T型连续稀释的人类基因组DNA标准扩增值。自从C类T型值与初始拷贝数的对数成反比，实验mRNA的拷贝数可以通过标准曲线的线性回归得到。测定每个mRNA的拷贝数相对差异。将数值标准化为内参mRNA，表示为以三倍±标准偏差执行的平均值实验。
HIF脯氨酸羟化酶1（EGLN2/PHD1）的纯化
如前所述，从兔网织红细胞裂解物中纯化含有富集EGLN2的提取物[8]简单地说，在50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.1 M KCl和5%（vol/vol）甘油中将约1 L兔网织红细胞裂解物（威斯康星州俄勒冈州格林赫克塔雷斯）稀释至5 L，然后用0.213 g/ml（NH4)2SO公司4.在16000×离心后克在4°C下沉淀45分钟，所得上清液再沉淀0.153 g/ml（NH4)2SO公司4.在16000×离心后克在4°C下，将颗粒重新悬浮在缓冲液A中45分钟（40 mM HEPES-NaOH[pH7.4]和5%（vol/vol）甘油），与缓冲液A进行透析，使其电导率与含有0.2 M KCl的缓冲液A相当，并以0.5 L/h的速度施加到0.5 L磷酸纤维素（Whatman，P11）柱中，该柱在含有0.2 M氯化钾的缓冲液中平衡。用含有0.5 M KCl的缓冲液A以1 L/h的速度逐步洗脱磷酸纤维素柱，并收集100 ml部分。将在磷酸纤维素0.5KCl步骤中洗脱的蛋白质合并，并用0.4g/ml（NH4)2SO公司4.在16000×离心后克在4°C下45分钟，将颗粒重新悬浮在4 ml缓冲液A中，然后在35000×克在4°C下保持30 min，将所得上清液以2 ml/min的速度施加到TSK SW3000 HPLC柱（宾夕法尼亚州蒙哥马利维尔托索·哈斯；21.5×600 mm）上，该柱在含有0.15 M KCl的缓冲液a中平衡。以2 ml/min的速度洗脱SW3000柱，收集4 ml含有富集EGLN2的馏分。
体外结合试验
安在体外如前所述进行结合分析[3]TNT网织红细胞裂解物（Promega）翻译产物在有或无35S-蛋氨酸。HIF1α-（ODD）翻译产物与富含EGLN2的细胞提取物组分在37°C下孵育30分钟。Gal4-HA-HIF-1α（10µl）和HA-VHL（10μl）翻译产物与所示抗体和蛋白A-Sepharose在750µl EBC缓冲液（50 mM Tris[pH8]，120 mM NaCl，0.5%Nonide P-40）中孵育。在用NETN缓冲液（20 mM Tris（pH 8）、100 mM NaCl、0.5%Nonide P-40、1 mM EDTA）洗涤五次后，结合蛋白在SDS-PAGE上得到解析，并通过放射自显影术进行检测。
体外泛素化试验
安在体外如前所述进行泛素化分析[3].[35S]（35秒）蛋氨酸标记的网织红细胞裂解物Gal4-HA-HIF1α（ODD）（4µl）在RCC 786-O S100提取物（100–150µg）中培养。如有指示，通过增加EGLN2富集细胞分数的滴定来补充反应。其他反应补充剂包括8µg/µl泛素（Sigma）、100 ng/µl泛素醛（BostonBiochem，Inc.，Cambridge，MA）和ATP再生系统（20 mM Tris[PH7.4]、2 mM ATP、5 mM MgCl2，40 mM磷酸肌酸，0.5µg/µl肌酸激酶），在30°C下以20–30µl的反应体积反应1.5 h。
HIF剂量反应
来自Jiang等人的文章[6]以便携文档格式（PDF，Adobe Systems）获取，导入Canvas 9（ACD Systems），提取每个数据点的x和y图形设备坐标、x轴刻度（氧气浓度）和y轴刻度（密度测定）。使用线性插值将图形设备坐标转换为蛋白质密度测量和氧气浓度。根据提取的氧气浓度（0.5、1.9、2.9、3.9、4.8、5.8、7.9、9.9、11.9、13.9、19.9）与实际氧气浓度（0.5,2,3,4,5,6,8,10,12,14,20）的比较，提取的数据与原始数据的平均差异小于2%。记录密度测定和氧浓度数据2-转换后的线性模型与转换后的数据相吻合。最适合的幂律方程是HIF1α = 22.61O（运行）−0.85，其中HIF1α代表HIF-1α蛋白水平和O（运行）代表氧气浓度。
支持信息
图S1
肾肿瘤的区域转录异常。
（0.06 MB PDF格式）
图S2
EGLN2在嫌色细胞癌中的表达。
（0.22 MB PDF格式）
图S3
HIF1蛋白和HIF1 DNA结合活性水平对氧气浓度变化的响应。
（0.22 MB PDF格式）
图S4
BNIP3L表达与HIF表达相关。
（0.15 MB PDF格式）
图S5
嗜酸细胞瘤中抑制的低氧反应基因被EGLN2抑制。
（0.01 MB PDF格式）
表S1
RCC中的19号染色体FISH模式。
（0.04 MB PDF格式）
表S2
嗜酸细胞瘤中的19号染色体FISH模式。
（0.04 MB PDF格式）
表S3
与癌症相关的基因定位到染色体19q。
（0.07 MB PDF格式）
致谢
我们还要感谢国家癌症研究所和法国肾癌联合会的合作人类组织网络（Sophie Giraud、Sophie Ferlicot、Philippe Vielh、Delphine Amsellem-Ouazana、Bernard Debé、Thierry Flam、Nicolas Thiounn、Marc Zerbib、Gérard Benoît、St phane Dropy、Vincent Molinié）为分析提供样品。
脚注
提交人声明，不存在相互竞争的利益。
该项目的部分支持由范安德研究所、国家卫生研究院向KAF提供的R33-CA10113-01补助金、加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大癌症学会（CCS）和加拿大肾脏基金会（KFoC）向MO、格伯基金会、豪恩斯坦基金会提供的补助金、，密歇根经济发展公司，以及密歇根技术三走廊对英国电信、新加坡千禧年基金会和新加坡癌症协会对MHT的资助。
工具书类
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