国际实验病理学杂志。2004年4月;85(2): 47–64.
Smad3作为纤维化反应的介质
美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所细胞调节与致癌实验室
通信:Kathleen C.Flanders LCRC/NCI/NIH Bldg.41/Rm C-629 41 LIBRARY DR MSC 5055 Bethesda,MD 20892-5055 USA电话:+1 301 496 5453传真:+1 302 496 8395电子邮箱:vog.hin.icn.14秒@krednalf 收稿日期:2004年1月22日;2004年2月24日接受。
摘要
转化生长因子-β(TGF-β)在纤维化中起着核心作用,有助于炎症细胞的流入和激活、细胞的上皮-间充质转分化(EMT)、成纤维细胞的流入及其随后细胞外基质的形成。TGF-β通过跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶发出信号,激活称为Smad蛋白的新型信号中间产物,其调节靶基因的转录。Smad3是TGF-β/激活素信号的两种同源蛋白之一,靶向缺失Smad3的小鼠表明,TGF-?的大多数促成纤维活性是由Smad3介导的。Smad3缺失的炎性细胞和成纤维细胞对TGF-β的趋化作用没有反应,也不会自动诱导TGF-α。Smad3的缺失还干扰TGF-β介导的EMT诱导以及胶原蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂-1和金属蛋白酶组织抑制剂-1的基因。Smad3缺失小鼠对辐射诱导的皮肤纤维化、博莱霉素诱导的肺纤维化、四氯化碳诱导的肝纤维化以及链脲佐菌素诱导的1型糖尿病诱导的肾小球纤维化具有抵抗力。在EMT诱导的纤维化条件下,如增生性玻璃体视网膜病变、眼囊损伤和单侧输尿管梗阻导致的肾小球硬化,Smad3基因缺失小鼠也表现出消除纤维化反应。硬皮病、囊性纤维化和肝硬化动物模型提示Smad3参与了所观察到的纤维化。此外,通过过度表达抑制性Smad7蛋白或通过小分子卤富隆治疗抑制Smad3,可显著降低肾、肺、肝和辐射诱导纤维化动物模型中的反应。Smad3小分子抑制剂在治疗病理性纤维化疾病方面可能具有巨大的临床潜力。
关键词:纤维化、氟尿嘧啶酮、Smad3、Smad7、TGF-β、伤口愈合
转化生长因子-β(TGF-β)是一种112个氨基酸的同二聚体蛋白,首次被鉴定为诱导正常大鼠肾细胞非依赖性生长的因子。它现在被认为是一种典型的多功能细胞因子,调节多种重要的生物反应,包括细胞生长和分化、凋亡、细胞迁移、免疫细胞功能和细胞外基质(ECM)的产生(Roberts&Sporn 1990年;1998年马萨). TGF-β的多种生物学作用有助于其在许多纤维化疾病中发挥中心作用,包括肝硬化、慢性肝炎、肾小球肾炎、硬皮病和肺纤维化(Border&Noble 1994年). 许多纤维化病理与TGF-β水平升高有关,TGF-?最初将炎性细胞和成纤维细胞招募到损伤区域,然后刺激这些细胞分别产生细胞因子和细胞外基质。由于TGF-β不仅可以增加基质蛋白的合成,还可以增加蛋白酶抑制剂的分泌,同时减少蛋白酶的分泌,因此它是基质积累的有力刺激物(Roberts&Sporn 1996年). 虽然TGF-β诱导的反应在损伤后组织修复的正常生理学中发挥作用,但这一过程往往不能正确解决,导致慢性病理状况。
哺乳动物表达三种高度同源的转化生长因子β亚型(转化生长因子-βs 1、2和3),它们通常具有类似的生物活性在体外,同时引发不同的生物反应体内TGF-β配体基因被敲除的小鼠表现出不同的表型(Letterio&Roberts 1996年). 此外,由于血小板是TGF-β1的丰富来源,这种亚型通过损伤部位的血小板脱颗粒释放;因此,TGF-β1是被认为在伤口愈合和可能的后续纤维化中发挥最重要作用的同种型(Roberts&Sporn 1996年). TGF-β也是由40多个配体组成的大超家族的创始成员,包括激活素、抑制素、骨形态发生蛋白(BMPs)和生长分化因子(GDFs)(金斯利1994). 许多TGF-β家族成员通过细胞表面丝氨酸/苏氨酸激酶受体发出信号。一个被称为Smad的蛋白质家族将配体信号从细胞表面传递到细胞核。本综述将重点介绍转化生长因子-β信号转导因子Smad3在调节纤维化反应中的作用,包括Smad3依赖性基因调控、其在许多器官纤维化中的作用以及阻止不必要纤维化的可能治疗策略。
通过Smad发送信号
Smad这个名称来源于TGF-β样配体-吞噬中间体的缩写,最初在果蝇属(疯狂)和秀丽隐杆线虫(Sma)。八种哺乳动物Smads分为三个亚家族,五种受体激活Smads(R-Smads)、一种常见的介体Smad(Co-Smad)和两种抑制Smads(穆斯塔卡斯等。2001;Derynk&Zhang 2003年;Shi&Massague 2003年). 在R-Smads中,Smads 2和3是TGF-β和激活素的信号,而Smads 1、5和8是BMP配体的信号转导者(). 对于TGF-β信号传递,与组成活性ser/thr激酶II型受体结合的配体将I型受体招募到复合物中,在那里它被II型受体磷酸化,从而激活。Smads 2和Smads 3被SARA(Smad受体活化锚定)招募到激活的I型受体,并被位于R-Smads末端羧基末端的保守SSXS基序最后两个丝氨酸上的I型TGF-β受体激酶直接磷酸化。磷酸化的R-Smad从受体复合体中释放出来,形成由两个R-Smad和co-Smad(Smad4)组成的异聚复合体,该复合体转移到细胞核,在那里它可以与各种转录因子相互作用并影响转录反应。I-Smads(Smad6用于BMP途径,Smad7用于TGF-β/激活素途径)通过与I型受体结合并阻止R-Smads的募集和磷酸化发挥作用。I-Smad还将E3泛素连接酶Smurfs 1和2(Smad泛素化调节因子1和2)带到I型受体,随后泛素化并降解该受体。
转化生长因子-β(TGF-β)/Smad-signaling途径概述。在细胞表面,TGF-β配体与组成型活性II型受体的结合将I型受体募集到复合物中,在复合物中被磷酸化。激活的I型受体随后磷酸化Smad 2或3,这些Smad 2和3被SARA(Smad锚定受体激活)在C末端丝氨酸处招募。激活素还磷酸化Smads 2/3,而BMPs磷酸化Smad 1/5/8。受体激活的Smads随后与共同介质Smad4复合,该复合物转移到细胞核,在那里调节靶基因的转录并与多种转录因子(TF)结合。Smad6对BMP途径和Smad7对TGF-β/激活素途径抑制I型受体激酶对R-Smads的激活。降解R-Smads的E3泛素连接酶Smurfs 1和2也与Smads 6/7相互作用,泛素化I型受体。
三个Smad亚家族的结构域如所示R-Smad和co-Smad分别包含保守的氨基端和羧基端MH(mad同源性)1和2结构域,其侧翼是一个更分散的富含脯氨酸的中间连接子区域。在I-Smads中,MH1结构域被不与DNA结合的更分散的氨基末端取代。MH1结构域通过与MH2结构域的相互作用来调节自身抑制,防止其在缺乏配体的情况下磷酸化。MH1结构域可以直接与DNA结合,但Smad2的正常剪接变体除外,该结构域中的30个氨基酸插入阻止了DNA结合。最小Smad-binding元件(SBE)仅包含4个碱基对,即5′-AGAC-3′,但也有与其他富含G/C的序列结合的报道。该结构域中Smads 2或3的蛋白激酶C磷酸化消除其DNA结合活性。在磷酸化后暴露的核定位信号也存在于MH1结构域中,多种转录因子包括c-Jun、SP1、ATF-2和TFE3在此结合。
三类Smad蛋白的结构组织和结构域功能。受体激活的普通Smad蛋白的整体结构包括保守的MH1(灰色)和MH2(黑色)结构域以及中间的连接子(条纹)区域。抑制性Smad缺乏MH1结构域。受体激活的Smad被C末端SSXS位点上的I型受体激酶磷酸化。显示了拟定核本地化和核出口信号(分别为NLS和NES)的位置。图的底部列出了每个域的主要功能。
虽然羧基末端MH2结构域并不直接与DNA结合,但它参与了多种蛋白质相互作用。R-Smads中的这个结构域与I型受体相互作用,包含SSXS磷酸化位点,并介导R-Smad/Smad4低聚物的形成。此外,MH2结构域包含核输出信号,因此在Smad核质穿梭中发挥作用。I-Smads的MH2结构域缺乏SSXS基序,但确实稳定地与活化的I型受体激酶结合,以防止R-Smads的磷酸化。R-Smads和Smad4的MH2结构域与多种转录辅活化因子(包括p300、CBP和SMIF)以及转录辅抑制因子(如TGIF、c-ski和SnoN)相互作用。这些负调控因子可以干扰MH2结构域与转录辅激活子CBP/p300的结合,并招募组蛋白去乙酰化酶,还可以与R-Smad竞争与Smad4的结合(Shi&Massague 2003年).
尽管MH1和MH2结构域之间的中间连接区在Smad之间是不同的,但该区域包含许多磷酸化位点,这些位点现在被认为是介导观察到的Smad途径和各种其他信号机制之间的串扰(Lutz&Knaus 2002年;Derynk&Zhang 2003年). 例如,MAP激酶的Erk亚家族被Ras或肝细胞生长因子或表皮生长因子与酪氨酸激酶受体的结合激活,可以磷酸化Smads 1、2或3连接区的Erk共识位点(PXSP),并抑制R-Smads的核移位。类似地,Ca2+-钙调素依赖性蛋白激酶II在连接区磷酸化Smad2,抑制核移位和信号传导。c-Jun N末端激酶可以磷酸化c末端SSXS基序以外的Smad3,并增强核移位和转录激活。重要的是要记住,在许多情况下,磷酸化的影响依赖于细胞类型。例如,ERK抑制降低人系膜细胞中Smad2/3的磷酸化,但不改变小鼠乳腺上皮NmuMG细胞的磷酸化(林下等。2003).
连接区还包含一个保守的PY基序,该基序与Smad相互作用蛋白Smurf1和Smurf2的WW结构域相互作用(阿蒂萨诺和Tuen Lee Hoeflich 2001)催化泛素介导的Smads降解,一些Smads相关蛋白,如SnoN和TGF-β受体复合物本身。然而,核Smad2/3的大部分不是降解的靶点,而是被尚未鉴定的磷酸酶去磷酸化,然后重新定位到细胞质中。
Smad2公司与。Smad3公司
虽然Smads 2和Smads 3都介导来自TGF-β和激活素的信号,但这两个Smads显然具有非冗余功能。而Smad2基因敲除(KO)小鼠未能原肠化,形成中胚层并建立前后轴,导致E7.5和E8.5之间死亡(野村和李1998;沃尔德利等。1998;温斯坦等。1998),Smad3 KO小鼠存活,通常在1-6个月大时死于粘膜免疫缺陷(达托等。1999;杨等。1999). Smad3 KO小鼠对TGF-β的T细胞反应性降低,并且由于肥大软骨细胞分化缺陷导致骨骼异常,从而导致进行性软骨退行性疾病(杨等。2001).
由于Smad3通过其MH1结构域直接与DNA结合,而Smad2通过与转录因子结合间接激活转录,因此人们可以预期这两个Smad对靶基因的调节具有不同的作用。这已被证实,来自Smad 2或3KO小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)显示出不同的TGF-β基因诱导模式。TGF-β介导的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的诱导是Smad2依赖性的,c-fos、Smad7和TGF-(派克等。2001). 使用这些细胞和9000个基因芯片进行的微阵列分析表明,Smad3是TGF-β信号传导的基本介质,因为它通过TGF-?的直接早期靶基因的Smad3/4 DNA-结合基序特征直接激活编码转录调节器和信号转导子的基因。Smad2主要是通过TGF-β/Smad3对即刻早期和中期基因的转换调节(杨等。2003). 使用反义寡核苷酸敲低HaCaT角质形成细胞中Smads 2或3的表达,克雷奇默等。(2003)表明TGF-β诱导的生长停滞由Smad3介导,Smad3调节c-Myc、p21的表达Cip1号机组Rb的磷酸化状态。Smad2对任何与生长抑制相关的即时事件都不需要,但对TGF-β诱导的血红素氧化酶-1表达是必需的。
决定TGF-β受体结合是否会通过Smad2或Smad3在特定细胞类型中激活信号的机制尚不清楚。根据Smad2 KO小鼠的胚胎致死率,Smad2可能比Smad3更参与发育过程中的信号调节。此外,使用Smad2-和Smad3-缺陷MEF,发现TGF-β激活SBE4-Lux报告子需要Smad3,但不需要Smad2,而激活反应元件Lux报告者需要Smad1,这表明Smad2和Smad3在信号传递中具有特殊作用(馅饼等。2001). 此外,最近的数据表明,Smads 2和3的磷酸化并不发生在位于质膜的受体上,而是发生在克拉他林依赖性内吞作用后的内胚体中(海耶斯等。2002;彭海特等。2002). 证明Smads 2和Smads 3独立磷酸化的数据表明,它们可能被内体不同亚结构域中的不同受体池磷酸化,如Smad2/3结合蛋白SARA所示(胡等。2002). 最近发现的一种蛋白质,TLP(TRAP-1样蛋白)(费利奇等。2003)通过选择性抑制Smad3/4复合物的形成,阻断Smad3依赖性转录,同时激活Smad2依赖性反应。TLP可能参与将Smad4定位于不同内体亚室中的特定受体/Smad复合物,从而使其可用于激活的Smad2,但不可用于激活Smad3。这些结果表明,可能还有其他辅助蛋白参与调节Smad2的平衡与。Smad3信令。
Smad3对细胞外基质基因表达的调控
纤维化疾病中细胞外基质的积累通常是由于转录激活增加导致纤维胶原mRNA水平升高所致。TGF-β在调节ECM基因表达中起着重要作用,越来越多的证据表明这是一个Smad3依赖性过程。使用包含265个已知ECM相关基因的cDNA表达阵列的差异杂交,维拉基亚等。(2001)在TGF-β1诱导的、依赖Smad3的人皮肤成纤维细胞中发现了一些胶原基因启动子。其中包括COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A2、COL6A1和COL6A3。在所有情况下,显性负Smad3和抑制性Smad7表达载体均阻断了TGF-β对启动子的激活,在Smad3缺失的MEF中,TGF-。
Smad3与人类COL1A2启动子的相互作用是最广泛的特征。在−353和−148 bp之间的近端区域包含SBE CAGA基序,需要TGF-β刺激成纤维细胞(陈等。2000). 转录辅激活子CBP/p300的参与是最大激活所必需的(高希等。2000). 此外,在−313至−250 bp的区域内,与COL1A2启动子结合的Sp1协同反式激活启动子(张等。2000). 同样,在人类肾小球系膜细胞中,Smad3刺激COL1A2启动子活性以响应TGF-β需要Sp1结合(Poncelet&Schnaper 2001年)在这些细胞中,TGF-β1刺激PKCδ的激活,正调控COL1A2启动子的Smad转录活性(润扬等。2003). 干扰素-γ(IFN-γ)的拮抗作用(高希等。2001;东(Higashi)等。2003)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(韦里奇亚等。2003)COL1A2启动子的TGF-β激活也通过对Smad3的影响发生。IFN-γ-信号通路与Smad3竞争有限量的CBP/p300,而TNF-α激活JNK以某种方式阻断TGF-β诱导的Smad3依赖性COL1A2上调。相反,TGF-β和TNF-α通过RelA和Smad3与启动子中不同增强因子的结合,协同增强人皮肤成纤维细胞中COL7A1的表达(Kon公司等。1999). 也有证据表明,鞘磷脂介质在调节TGF-β信号传导中发挥作用,因为Smad3和鞘氨醇1-磷酸磷酸酶在成纤维细胞中的共同转染导致COL1A2启动子活性显著增加(佐藤等。2003年a).
TGF-β不仅通过促进ECM的合成,而且通过下调基质降解酶的表达和增加MMP抑制剂的表达来抑制ECM的降解,从而导致纤维化。一些研究表明,这也可能是Smad3依赖的过程。在皮肤成纤维细胞中,MMP-1启动子的负调控由Smad3介导(在Smad3缺失的MEF中不发生)(Yuan和Varga 2001年)AP-1站点参与(霍尔等。2003). 相反,TGF-β通过Smad3与CAGA基序的结合上调纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)启动子的活性(丹尼等。1998)在几种细胞系中,Smad3和Sp1之间的结合是最大启动子激活所必需的(达塔等。2000). TGF-β对金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的诱导似乎也依赖于Smad3(韦里奇亚等。2001).
Smad3在伤口愈合中的作用
伤口愈合已用于研究Smad3丢失的影响体内,因为该模型涉及特定组织结构中各种细胞类型在定义的时间序列中的相互作用。TGF-β由参与伤口愈合过程的所有细胞类型产生,这些细胞也能对TGF-(Roberts&Sporn 1996年). 在伤口处,血小板脱颗粒释放出一团TGF-β1,将炎症细胞和成纤维细胞招募到该区域,并刺激这些细胞产生TGF-(). 事实上,局部应用转化生长因子-β可以改善各种受损愈合动物模型的伤口愈合(Roberts&Sporn 1996年). 这些观察结果表明,TGF-β信号传导下游介质(如Smad3)的缺失可能会损害愈合。出乎意料的是,Smad3 KO小鼠的皮肤切口伤口愈合速度比Smad3野生型(WT)窝友对照组更快(阿什克罗夫特等。1999). Smad3 KO皮肤上的切口比WT皮肤上切口的上皮化速度更快,因为Smad3缺失的角质形成细胞增殖更快,对TGF-β生长抑制的敏感性降低。Smad3 KO小鼠伤口床的炎症细胞流入减少,因为Smad3阴性单核细胞对TGF-β的趋化反应以及自身诱导TGF-α的能力受损。Smad3 KO小鼠肉芽组织中ECM的积累也减少。Smad3杂合(HT)小鼠的反应大约介于WT和KO小鼠的反应之间,表明Smad3在某些反应中的作用是有限的。
转化生长因子-β(TGF-β)/Smad3在伤口愈合和纤维化中的作用。血小板脱颗粒释放TGF-β1,对单核细胞和成纤维细胞具有趋化性,随后这些细胞会自动诱导TGF-?,成纤维细胞会诱导胶原蛋白和其他基质蛋白。Smad3丢失会阻止标记为X的进程。
肉芽组织形成后发生的伤口收缩对于减小伤口缺损的大小是必要的,以便最终闭合;然而,损伤后过度的组织收缩会导致萎缩性瘢痕。肌成纤维细胞,即表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的成纤维细胞在很大程度上负责伤口收缩。含有成纤维细胞的漂浮胶原蛋白凝胶通常用作在体外创面收缩模型和TGF-β治疗增加了该模型中的收缩。看来伤口愈合的这一方面也是Smad3依赖性的。成纤维细胞中Smad3的过度表达增强了胶原凝胶收缩,而Smad7的过度表达抑制了胶原凝胶的收缩(纯敬等。2003). 此外,TGF-β增强Smad2 KO、Smad2 WT和Smad3 WT的收缩,但不增强Smad3 KO MEF的收缩(线路接口单元等。2003).
Smad3是病理性纤维化状态的重要介体
伤口愈合的许多方面与纤维化疾病的愈合是相同的,包括炎症、血管生成和纤维化。在正常的生理伤口愈合过程中,当创面床中积累了足够的基质时,基质的生成被终止,疤痕被阻止。如果这种反应无法解决,或者组织受到慢性损伤,则可能导致病理性进行性纤维化。TGF-β被认为是许多纤维化疾病的重要介质,并且TGF-α水平的增加经常出现在发生不可控纤维化反应的组织中。TGF-β参与纤维化的最直接证据来自多种纤维化疾病动物模型,其中阻断TGF-?功能的药物可降低纤维化反应。例如,在几种实验模型中,给予TGF-β抗体或反义寡核苷酸可以减少肾纤维化,给予可溶性TβRII有利于肝和肠纤维化,而TGF-β抗体可以预防小鼠硬皮病移植物的皮肤和肺纤维化-与。-宿主病(法兰德斯和伯梅斯特2003). 通过Smad3缺失而降低TGF-β功能意味着Smad3 KO小鼠也可能对纤维化有抵抗力。这一假设得到了Smad3缺失干扰巨噬细胞趋化性和TGF-β自身诱导的证据的支持(阿什克罗夫特等。1999). 炎症细胞中TGF-β的自身诱导对于保持创面床中TGF--β配体的高水平至关重要。然后,TGF-β可以将成纤维细胞招募到该区域,该区域也可以自动诱导TGF-α并产生胶原蛋白。所有这些过程似乎都依赖于Smad3(). 事实上,现在有许多关于纤维化动物模型的报告,其中Smad3的缺失导致纤维化反应减弱。这些研究的结果将总结如下。
皮肤
用于治疗恶性肿瘤的放射治疗可能会导致病理性纤维化反应,从而影响患者的生活质量,并使以后的手术干预复杂化。我们实验室使用Smad3KO小鼠研究其在辐射诱导皮肤纤维化中的作用。局部照射30 Gy电离辐射6周后,Smad3 KO小鼠的皮肤表现出明显较少的表皮棘皮病(); 肥大细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的真皮内流以及TGF-β的表达低于WT同窝受照者的皮肤(法兰德斯等。2002). Smad3 HT小鼠的结果介于Smad3 WT和KO之间。此外,Smad3 KO皮肤的真皮中含有的肌成纤维细胞少于WT皮肤。与其他类型的Smad3阴性细胞一样,我们发现Smad3阳性皮肤成纤维细胞对TGF-β及其WT对应物的趋化作用没有反应。然而,根据α-SMA的表达判断,当用TGF-β诱导分化为肌成纤维细胞时,两种基因型的反应相同(佛兰德斯等。2003).
在暴露于30Gyγ射线照射6周后,Smad3-KO小鼠的皮肤比WT小鼠的皮肤显示出更少的表皮棘皮病和纤维化。辐照WT(a和b)和KO(c和d)皮肤的H&E染色。请注意,与KO皮肤相比,辐照后WT的表皮厚度和真皮密度增加。原始放大倍数×100。在(e–h)中,皮肤切片被Picrosius红色染色,并在偏振光下拍照。箭头表示表皮的位置。未经辐照的WT(e)和KO(f)皮肤显示出相似的真皮结构。相比之下,辐照后的WT(g)皮肤显示出较厚的胶原纤维,具有桔红色双折射,表明存在瘢痕表型,而辐照后的KO(h)皮肤的结构更类似于未辐照皮肤的结构。原始放大倍数×200。
由于Smad3 KO皮肤中含有较少的肌成纤维细胞,这些细胞被认为是ECM沉积的主要原因,因此我们提出,与WT皮肤相比,Smad3 KO皮肤中的瘢痕较少。用苦味酸红染色组织切片并在偏振光下观察证实了这一点。这种方法提供了胶原蛋白原纤维的厚度和组织模式的信息(佛兰德斯等。2003). 正常皮肤结构类似于Smad3 WT和KO小鼠的皮肤,其特征是细而弱的双清澈的黄绿色纤维呈网篮状(). 相反,皮肤照射6周后,WT的真皮(),但不是KO皮肤()其特征是较厚的胶原纤维的显著外观带有桔红色双折射,提示存在瘢痕表型。
我们还发现,当Smad3 WT和KO皮肤成纤维细胞接受5 Gy电离辐射和5 ng/ml TGF-β1联合治疗时,其基因表达模式存在差异。这种联合治疗是为了模拟体内辐射诱导TGF-β产生的情况(Barcellos-关闭等。1994;Randall&Coggle 1995年;豪尔·延森等。1998). Smad3 WT(而非KO)皮肤成纤维细胞显示出协同诱导TGF-β1和结缔组织生长因子(CTGF)mRNA水平(佛兰德斯等。2003). 正如已经提出的那样,CTGF和TGF-β的组合是最佳基质合成所必需的(莫里等。1999)Smad3KO皮肤成纤维细胞中诱导的这两种成纤维细胞因子水平的降低可能部分解释了照射后Smad3ko皮肤上观察到的瘢痕减少。Smad3也可能在瘢痕疙瘩基质过度堆积中起作用,因为下巴等。(2001)据报道,瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常人皮肤成纤维细胞相比,Smad3的磷酸化程度增加。
放射治疗和手术通常用于治疗恶性肿瘤,但放射组织伤口愈合受损可能会出现临床并发症(Tibbs 1997年). 我们发现,即使在先前受辐射的皮肤中,Smad3 KO小鼠的切口伤口仍能比WT小鼠更快愈合(佛兰德斯等。2003). 照射后五周,当照射引起的皮肤损伤愈合后,在照射区域进行切口。Smad3 KO小鼠的伤口较WT小鼠窄,面积较小,再上皮化速度快2-3倍。与野生型小鼠相比,Smad3-KO小鼠的创伤床显示出更少的炎症和更少的肌成纤维细胞。
系统性硬化(SSc)是一种病因不明的自身免疫性疾病,其特征是血管异常和过度ECM积聚导致进行性皮肤和内脏纤维化。越来越多的证据表明Smad3至少是纤维化的部分介质。人类SSc皮肤病变中Smad3表达上调体内和培养的SSc成纤维细胞在体外伴随Smad7表达降低(东等。2002). 与正常成纤维细胞相比,SSc成纤维细胞中Smad3磷酸化和PAI-1诱导增强,腺病毒介导的Smad7过度表达恢复了SSc成细胞中正常PAI-1的生成(东等。2002). 此外,在皮肤注射博莱霉素诱导的SSc小鼠模型中,Smad2/3在成纤维细胞中的定位主要是核定位,没有诱导Smad7来抵消Smad3的激活(高闲者等。2003). 也有证据表明,在SSc病变中高度表达的CTGF在SSc成纤维细胞纤维化表型的维持中发挥作用(丹顿和亚伯拉罕2001). TGF-β对CTGF的诱导依赖于Smad3,但SBE的突变并没有降低SSc患者皮肤成纤维细胞中观察到的高水平CTGF启动子活性(福尔摩斯等。2001)提示SSc成纤维细胞纤维化表型的维持可能与Smad3无关。
肝脏
高水平的转化生长因子-β经常出现在肝纤维化中,并且在许多肝脏疾病中被认为是纤维化的介导者(格雷斯纳等。2002). 据信,坏死肝细胞释放TGF-β可能是激活邻近静止肝星状细胞(HSC)的第一个信号之一,从而使其转分化为增殖性、成纤维性和收缩性肌成纤维细胞。HSC的原代培养物通过与组织培养塑料接触而自发激活,这被用作在体外纤维生成模型。在这个系统中,Smad3和Sp1的相互作用介导TGF-β刺激HSC中COL1A2启动子。然而,在实质性肝细胞中,Sp3而非Sp1与该调节元件结合,并没有激活启动子,表明细胞系特异性COL1A2转录(殷纳加奇等。2001). 使用Smad3磷酸化C末端或中间连接区特异性抗体,古鲁川等。(2003)结果表明,在HSC中,TGF-β依赖性Smad3在C末端的磷酸化降低,但在转分化过程中,p38 MAPK通路对中间连接区的磷酸化增加。他们提出,当HSC完全分化为肌成纤维细胞时,TGF-βRI介导的Smad3信号减少,p38 MAPK介导的Smad3信号占主导地位,刺激ECM的产生,导致肝纤维化。
Smad3在慢性纤维化肝病中似乎被激活,因为从肝硬化大鼠肝脏中获得的HSC表现出Smad3的结构性磷酸化和核定位,以及COL1A2和PAI-1基因的转录增加(殷纳加奇等。2001). 当服用CCl导致急性肝损伤时4,Smad3-KO小鼠的肝I型胶原mRNA诱导量约为Smad3-WT小鼠的一半,而α-SMA的表达量相似(施纳布尔等。2001). 因此,正如Smad3KO皮肤成纤维细胞中报道的那样,通过α-SMA表达评估,Smad3对HSC激活不是必需的(佛兰德斯等。2003),但似乎是I型胶原蛋白最大表达所必需的。急慢性CCl后Smad7在HSC和肌成纤维细胞中的不同表达模式4给药可能会导致慢性病患者出现纤维化。虽然Smad7在急性肝损伤的HSC中被诱导,但在慢性疾病的肌纤维母细胞中Smad7的水平仍然很低,这可能解释了为什么纤维化信号没有被抑制(多桥等。2002).
肾
肾间质纤维化是指正常肾小球组织被ECM所替代,由许多临床实体引起,包括尿路梗阻、肾小球肾炎和糖尿病。这种情况是渐进的,可能致命。高血压或超滤过等应激因素可损伤内脏上皮细胞或足细胞,引发一连串信号事件,导致系膜细胞扩张和ECM积聚(施纳佩尔等。2003). TGF-β被认为在肾小球硬化中起作用,因为它的表达与一些肾小球疾病中系膜基质的增加有关,肾内输注TGF-α基因可导致大鼠硬化,而输注TGFβ反义寡核苷酸可减少实验性肾病中的硬化(施纳珀等。2003). Smad3刺激人肾小球系膜细胞COL1A2启动子活性以响应TGF-β(Poncelet&Schnaper 2001年). 在这个系统中,TGF-β还激活了PI3K-PDK1-Akt通路,该通路磷酸化了中间连接区的Smad3并增强了Smad3转录活性,导致I型胶原表达增加(润扬等。2004). Smad7在小鼠系膜细胞中的过度表达消除了TGF-β对COL1A2启动子活性的依赖性刺激(陈等。2002).
Smad3的激活是1型和2型糖尿病小鼠模型的一个特征。在分贝/分贝作为2型糖尿病遗传模型的小鼠,与对照小鼠相比,Smad3在肾小球和肾小管细胞中的核定位增加,核蛋白与SBE的结合增加(商行等。2001). 在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠(1型糖尿病)肾脏中观察到Smad3的核定位和SBE的激活也有类似的增加,这些增加可以通过胰岛素治疗来阻止(伊索诺等。2002). 当Smad3 KO小鼠用链脲佐菌素治疗时,糖尿病引起的肾小球基底膜增厚、蛋白尿、纤维连接蛋白和COL4A3表达上调均被减弱,提示局部抑制Smd3可能有助于糖尿病肾小球疾病的预防或治疗(藤基等。2003). 糖尿病患者的高循环葡萄糖水平实际上可能激活Smad3,因为在高糖诱导的Smad3磷酸化和核移位中培养肾细胞(锂等。2003)以及胶原蛋白I合成的激活(锂等。2003)和纤维连接蛋白启动子活性(伊索诺等。2002). 这两种基质诱导效应都被阻断了在体外Smad7的过度表达。
Smad3还参与其他病因诱导的肾间质纤维化。例如,在人类局灶节段性肾小球硬化症中,足细胞损伤是该病发生的第一个事件,观察到TGF-β1和磷酸化Smad3显著增加(基姆等。2003). 在单侧输尿管梗阻(UUO)中,TGF-β的上调被认为会诱导肾小管的上皮-间质转化(EMT),然后沉积ECM。UUO后,Smad3 KO小鼠可免受小管间质纤维化的影响,这可以通过阻断EMT和减少单核细胞内流和胶原积累来证明(佐藤等。2003年3月). 与Smad3 KO小鼠或假手术动物的肾脏相比,UUO后Smad3 WT小鼠的肾脏显示TGF-β1表达增加了三到六倍。来自Smad3 WT小鼠的肾小管上皮细胞的原代培养物在TGF-β处理后进行EMT,如E-钙粘蛋白表达的损失以及α-SMA和Snail表达的诱导所证明的,这在从Smad3 KO小鼠制备的细胞中没有发生。此外,培养的上皮细胞的机械拉伸,模拟UUO后尿液积聚引起的肾小管扩张,在Smad3介导TGF-β1上调后诱导EMT。
眼睛
眼部伤口的愈合通常由EMT启动。众所周知,晶状体上皮在外伤后会发生病理性EMT,例如白内障手术和人工晶状体植入,这可能导致ECM的产生,导致囊膜组织收缩和含有人工晶状体的囊膜混浊。同样,在增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)中,视网膜色素上皮(RPE)细胞的EMT可导致视网膜纤维化和牵引脱离,PVR是视网膜再附着手术失败的常见原因。塞卡语等。(2001)观察到,在小鼠晶状体前囊穿刺后8–24小时,Smads 3和4从细胞质转移到靠近晶状体前囊破裂的细胞核。此外,在包膜愈合过程中,在人类再生晶状体纤维附近的晶状体上皮细胞中也可以看到核Smad3和4,在外植体培养中,外源性TGF-β诱导前囊标本晶状体上皮细胞Smad3的核移位(塞卡语等。2002). 两项使用Smad3 KO小鼠的研究表明,Smad3信号在眼部EMT中的重要性。晶状体囊受伤后(塞卡语等。2004)Smad3 WT小鼠的视网膜脱离、晶状体上皮细胞和RPE细胞分别经历EMT,蜗牛、α-SMA和I型胶原的诱导证明了这些反应在Smad3 KO小鼠中完全被阻断。在WT小鼠中,晶状体缺损在5天内用成纤维细胞样细胞闭合,而在KO小鼠中,缺损被更多的上皮样细胞闭合,但直到注射后8周才完全闭合。此外,从Smad3 KO小鼠分离的晶状体上皮细胞的原代培养物在TGF-β治疗后没有进行EMT,WT小鼠的细胞也没有进行EMT-β治疗。这些研究表明,临床上可能需要抑制Smad3信号通路来预防继发性白内障和PVR。
肺
肺纤维化的特征是间充质细胞增殖,其中一些细胞转分化为肌成纤维细胞,导致肺泡和肺间质中胶原过度积聚。损伤引起的炎症反应有时会引发这些纤维增生事件。囊性纤维化是一种以侵袭性炎症反应、细菌结合和细胞表面糖基化改变为特征的疾病,在囊性纤维化小鼠模型中,鼻上皮Smad3的表达显著降低(凯利等。2001). 囊性纤维化表型上皮细胞以及表达显性阴性Smad3的A549细胞无法支持TGF-β1介导的白细胞介素-8(IL-8)或一氧化氮合酶-2启动子的抑制。由于Smad3表达减少,TGF-β无法抑制这些有效炎症介质的激活,这可能是囊性纤维化严重炎症的原因。
在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中,与Smad3WT小鼠相比,Smad3KO小鼠表现出较少的纤维化损伤,I型胶原和纤维连接蛋白mRNA和蛋白的表达降低(赵等。2002). 每个基因型的肺部炎症细胞内流和TGF-β1水平都有相似的增加。在另一种肺纤维化模型中,通过吸入表达活性TGF-β1的腺病毒诱导肺纤维化,Smad3 KO小鼠几乎没有出现纤维化损伤,而Smad3 WT小鼠积累ECM(P.Bonniaud和J.Gauldie,个人通信)。腺病毒给药4天后,WT小鼠肺部CTGF、COL3A1、TIMP1和PAI-1的mRNA表达增加,而Smad3 KO肺部的mRNA没有增加。此外,这些研究人员注意到,在4个月大的时候,Smad3 KO小鼠的外周空气空间显著增大,这是肺气肿的特征。在肺气肿中,ECM被认为是通过蛋白酶-抗蛋白酶活性的失衡而逐渐破坏的。事实上,未经治疗的Smad3 KO小鼠的肺部MMP-9和MMP-12水平高于Smad3 WT小鼠的肺,而与ECM增强相关的其他基因(CTGF、PAI-1和TIMP-1)的表达水平相似。在RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞系)的基因报告分析中,Smad3能够在脂多糖治疗后抑制MMP-12的表达(沃纳等。2000)显性负Smad3的表达阻断了TGF-β对MMP-12启动子的抑制作用(范伯格等。2000). Smad3信号的丢失似乎会消除TGF-β负调节这些蛋白酶表达的能力,导致Smad3 KO小鼠肺部观察到的ECM丢失。
心血管系统
大鼠心肌梗死诱导梗死瘢痕及边缘区残留心肌细胞TGF-β1、I型胶原和Smads 2、3和4的表达(郝等。1999). 此外,梗死区抑制性Smad7蛋白的表达降低(王等。2002). 心肌成纤维细胞不适当地表达这些分子,导致梗死瘢痕不断重塑,这可能是大面积心肌梗死后心功能进行性丧失的一种机制。
早期动脉粥样硬化病变的特征是炎症细胞内流、内膜平滑肌细胞(SMC)增殖和迁移以及ECM沉积。球囊损伤后过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的激活抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜的形成。傅等。(2001)PPARγ的配体刺激抑制了TGF-β诱导的人主动脉SMC中CTGF的表达,并且Smad3的过表达挽救了这种抑制。PPARγ与Smad3在物理上相关在体外谷胱甘肽-S公司-转移酶下拉实验表明,PPARγ通过直接干扰Smad3信号通路抑制TGF-β诱导的人主动脉平滑肌细胞CTGF表达。此外,在牛主动脉内皮细胞中,Smad3调节PDGF-B链启动子的TGF-β诱导(Taylor&Khachigian 2000年). PDGF-B具有刺激内皮细胞增殖和促进新生内膜形成的能力,因此与动脉粥样硬化的发病机制有关。
最近研究表明,内皮细胞中的TGF-β信号级联通过两条Smad途径介导(古曼斯等。2003). 用TGF-β刺激内皮细胞以不同的动力学和阈值水平激活两种I型受体ALK1和ALK5。ALK5通过Smad2/3通路发出信号,而ALK1激活Smad1/5通路。ALK1和ALK5在内皮细胞的转录调控模式中显示出明显的差异,ALK5诱导ECM、PAI-1和平滑肌相关基因,而ALK1诱导c-myc(古曼斯等。2002;奥塔等。2002). 这些结果表明,ALK1信号传导刺激内皮细胞增殖和迁移,而ALK5信号传导促进血管成熟。这增加了TGF-β诱导的信号传递的复杂性,TGF-?激活Smad通路的双臂。
抑制Smad3信号传导作为潜在的抗纤维化治疗
由于TGF-β的多效性生物作用由多种信号通路介导,靶向TGF-α表达/激活或与受体结合的治疗可能会诱发一些不必要的副作用。靶向TGF-β受体下游特定信号通路的药物更有可能达到预期效果,同时避免并发症。正如前面引用的研究所证明的那样,Smad3在介导纤维化疾病的病理生物学中起着至关重要的作用,抑制Smad3信号可能是干预纤维化疾病的主要靶点。显示纤维化过程中的多个步骤是Smad3依赖性的,并且无论疾病过程是由炎症(如辐射诱导纤维化)还是由EMT(如PVR)启动,都可以作为抑制剂的靶点。抑制Smad3的几种不同机制体内已报告并在下文中讨论。
Smad3介导了许多导致纤维化疾病的过程。这些包括:(1)上皮间质转分化(EMT),它在诱导肾间质纤维化和增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)中起重要作用;(2) 炎症细胞和成纤维细胞的招募以及这些细胞中转化生长因子-β(TGF-β)的自身诱导,这些细胞参与辐射诱导的纤维化和肺纤维化的诱导,以及(3)TGF-α诱导胶原合成。Smad3抑制剂可以在多个部位发挥作用,抑制纤维化。
细胞因子
几种抗纤维化细胞因子可以调节Smad通路。用于治疗慢性丙型肝炎的IFN-α的抗纤维化作用是通过Smad3的作用介导的。殷纳加奇等。(2003)表明IFN-α诱导Stat1的磷酸化,与Smad3竞争有限量的CBP/p300,从而抑制活化HSC中的基础和TGF-β/Smad3刺激的COL1A2转录,为IFN-α的抗纤维化作用提供分子基础。BMP-7通过抑制TGF-β对E-cadherin启动子的抑制作用对抗TGF-?诱导的小鼠远端小管上皮细胞EMT(泽伊斯伯格等。2003). 在存在TGF-β的情况下,用BMP-7治疗使E-钙粘蛋白表达恢复到正常水平,并与磷酸化Smads 1、2和3的核定位相关,表明两条Smad途径同时运行。此外,BMP-7治疗肾病血清肾炎小鼠(一种与EMT相关的进行性慢性肾损伤模型)可以防止肾小管萎缩和间质纤维化的积聚。在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中,腹腔注射IL-7可降低肺TGF-β和胶原含量(黄等。2002). 在从特发性肺纤维化患者分离的人肺成纤维细胞中,IL-7通过诱导Smad7抑制TGF-β诱导的胶原生成;在IL-7的存在下,显性阴性Smad7成纤维细胞恢复了TGF-β诱导的胶原合成(黄等。2002).
Smad7矢量
虽然一些细胞因子可能通过诱导Smad7减少纤维化,最终抑制Smad3的活性,但一些研究已将表达Smad7的载体直接引入细胞或动物。达到足够水平的Smad7体内通过高效转染/感染这些表达载体是一项挑战,但在这些类型的基因治疗研究中已经报道了一些令人鼓舞的结果。局域网等。(2003)结扎输尿管后,立即使用超声微泡(Optison)介导系统,通过肾动脉将强力霉素调节的Smad7基因或空白对照载体转移至大鼠肾脏。通过调整饮用水中多西林的剂量,肾脏中70-90%的细胞中都有Smad7转基因表达。UUO后,Smad7的诱导导致Smad2/3核移位和肾小管间质纤维化的完全抑制,如α-SMA和胶原蛋白I和III的表达降低所证明的。在输尿管结扎术后一天,通过将腺病毒CMV-Smad7注射到盆腔,然后电穿孔,引入Smad7,也可以使用该模型减少纤维化(寺田等。2002). 在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中,与给予腺病毒Smad6的小鼠相比,在开始给予博莱霉素的时候,一次性气管内注射携带Smad7 cDNA的重组腺病毒,可抑制胶原蛋白的表达,且无形态纤维化反应(Nakao公司等。1999). 有趣的是,与对照组相比,腺病毒Smad7的给药并未改变肺部炎症或TGF-β的产生。当结扎胆总管诱导大鼠肝纤维化时,在结扎3周后,将腺病毒Smad7注射到门静脉和尾静脉时,胶原蛋白和α-SMA的表达减少了50%(杜利牌手表等。2003). 当结扎后1周才给予Smad7时,在已建立纤维化的动物中观察到较小但显著的减少30%。Smad7的腺病毒表达也阻止了HSC原代培养物的转分化,虽然它没有降低α-SMA的表达,但Smad7过度表达似乎破坏了肌动蛋白细胞骨架的纤维组织。
小分子抑制剂
出于对抑制纤维化疾病的基因治疗策略或系统性细胞因子给药的安全性、有效性和可能的副作用的担忧,Smad3小分子抑制剂成为吸引人的治疗药物。在小鼠或大鼠的饮食中添加1,25-二羟维生素D3 14天,导致肾脏中维生素D受体、Smad3和生物活性TGF-β蛋白水平降低(阿斯琴布伦纳等。2001); 这可能定义了维生素D3延长慢性排斥大鼠肾移植模型中移植肾存活的部分机制。
根据其调节Smad-signaling途径的能力,用于治疗其他疾病患者的几种药物也可能具有抗纤维化特性。在大型临床试验中,血管紧张素转换酶抑制剂可改善进展性肾病患者的临床结局。血液调节肽的血浆水平N个-在高血压动物模型中,接受治疗的患者中乙酰-色氨酸-赖氨酸-脯氨酸(Ac-SDKP)增加,Ac-SDKP改善心脏和肾脏纤维化。卡纳萨基等。(2003)发现Ac-SDKP治疗人系膜细胞可抑制TGF-β诱导的PAI-1和COL1A2 mRNA的增加以及Smads 2和Smads 3的核移位,并伴有Smad7的核输出。这些观察结果可以解释Ac-SDKP的抗纤维化特性。化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)在治疗和预防增生性瘢痕和瘢痕疙瘩方面也显示出一些疗效。在皮肤成纤维细胞中,5-FU以JNK依赖的方式拮抗TGF-β驱动的COL1A2转录并抑制Smad3/4 DNA复合物的形成,为5-FU作为抗纤维化药物的临床疗效提供了分子解释(温岭等。2003).
一类新的水溶性小分子抑制剂,与p38的咪唑抑制剂有关,最近被证明可以抑制TGF-βI型受体ALK4和ALK5的激酶活性。这一类的初始抑制剂SB-431542抑制TGF-β诱导的Smad3磷酸化和核移位以及TGF-α诱导的COL1A1 mRNA水平(研磨等。2002). 一种新合成的抑制剂,SB-505124,作为ALK5 ATP结合位点的竞争性抑制剂开发,在抑制Smad2/3信号传导方面比SB-431542强3-5倍(Byfield公司等。2004). SB-505124还抑制TGF-β诱导的MAPK通路成分,但不通过Smads 1、5和8改变BMP诱导的信号传导。它还消除了因TGF-β治疗而导致的FaO细胞死亡,但不包括TNF-α治疗。SB-505124可能具有作为治疗药物的潜力,并且在阐明TGF-β信号通路的复杂通路和串扰方面也将是一个有价值的工具在体外在动物模型中体内.
卤富金酮是一种用作抗球虫抑制剂的低分子量植物生物碱,在几种纤维化疾病动物模型中抑制胶原蛋白合成(Pines&Nagler 1998年). 现在的研究表明,卤富隆可以抑制Smad3的激活。在几种培养的细胞系中,卤富吉酮降低了TGF-β诱导的Smad2和3的磷酸化,并快速诱导了Smad7mRNA的表达(泽维尔等。2004). 这些研究人员还发现,在小鼠腹腔注射卤富隆可以减少电离辐射诱导的由纤维化引起的后腿收缩(). 在本试验中,将同一动物的辐照腿与未辐照对侧腿的收缩程度进行比较。对照组受照射的腿延长了未受照射腿的70-80%,而卤富隆治疗的小鼠延长了90%。即使在停止注射氟尿嘧啶酮后,这种延长的情况也得以维持。重要的是,对小鼠皮下肿瘤进行放射治疗的有效性并未受到氟尿嘧啶酮的影响,这表明氟尿嘧啶酮可作为一种治疗剂用于保护接受放射治疗的恶性肿瘤患者的正常组织免受不必要的纤维化。
氟尿嘧啶酮治疗可防止辐射引起的腿部挛缩。与未照射C3H/Hen雌性小鼠的对侧小腿相比,对右腿和小腿伸展部分进行35Gy照射。每日腹腔注射溶媒(白色条)或卤富隆(1µg/小鼠/天)(黑色条)。箭头表示停止每日注射的时间*P(P)与对照组相比<0.05。
在硬皮病紧致皮肤小鼠模型中,腹腔注射卤富隆也能有效抑制皮肤自发纤维化和皮肤增生(麦加哈等。2002). 在培养的真皮成纤维细胞中,卤富隆抑制TGF-β诱导的胶原蛋白和COL1A2启动子活性的上调,以及Smad3的磷酸化和活化,但不抑制Smad2。为了开始开发局部治疗模式,研究发现,在皮肤紧致的小鼠模型中,经皮应用哈龙(0.01%的乳膏)在减少皮肤COL1A1基因表达和皮肤厚度方面几乎与全身给药一样有效(松树等。2003).
已经对卤富隆进行了多项临床试验(松树等。2003). 健康志愿者局部使用0.1%的卤富隆,无皮肤刺激或全身吸收。一名慢性移植物患者-与。-宿主病,每天在硬化颈部皮肤上局部涂抹0.03%卤富隆6个月,可改善颈部旋转,并降低治疗皮肤活检中COL1A1基因的表达水平。然而,在停止治疗3个月后,胶原蛋白水平已恢复到基线水平。氟尿嘧啶酮的短暂作用可能是慢性刺激纤维生成的结果。在一项针对系统性硬化症患者的II期试验中,每日局部应用氟尿嘧啶酮导致12名患者中有5名在3个月后平均总皮肤评分降低。安全性结果表明,生命体征和实验室评估没有出现临床相关的变化。口服氟尿嘧啶酮的第一阶段研究表明,在较高剂量下,氟尿嘧啶具有良好的耐受性,并出现一些胃肠道不良反应。
氟尿嘧啶酮作为一种抗纤维化治疗药物具有很大的潜力。在各种动物模型中,全身给药耐受性良好,而局部给药在人类中耐受性良好。此外,在纤维化动物模型中,卤富隆对非纤维化动物的胶原蛋白水平影响最小,而对纤维化器官具有较强的抑制作用。它主要影响刺激的胶原蛋白合成,而不会改变通常较低的胶原蛋白生理水平。在大多数动物模型中,卤富隆被用作预防剂,在纤维化刺激之前或与之一起服用。两项有希望的研究表明,卤富隆可能有助于逆转现有的纤维化。根据胶原蛋白水平和皮肤形态的变化,在紧致皮肤小鼠中,卤富隆导致先前存在的纤维化状态降低(麦加哈等。2002). 在已建立硫代乙酰胺诱导肝纤维化的大鼠中,饮食中添加卤富隆可使肝内羟脯氨酸水平测定的纤维化状况几乎完全缓解(布鲁克等。2001).
结论和观点
越来越多的证据表明,通过阻断Smad3抑制TGF-β信号传导可以减少纤维化反应在体外和体内由于TGF-β可以通过多种途径发出信号,包括Smad2/3、MAP激酶和PI3激酶,令人惊讶的是,消除依赖Smad3的一个特定信号臂可以产生如此深远的影响。由于激活素也通过Smad3发出信号,因此阻断Smad3诱导的一些反应可能是激活素信号改变的结果。对不同细胞类型中TGF-β信号转导机制的持续研究将有助于我们准确理解特定信号通路介导的细胞过程,并可能有助于开发具有非常特殊生物作用的治疗药物。需要进一步研究的问题包括确定来自TGF-β的Smad信号的特异性与。激活素、连接区磷酸化对Smad活性的影响以及在一定条件下TGF-β通过Smads 1/5/8信号传递的能力(高曼斯等。2003).
虽然仅阻断Smad3信号传导的治疗剂是以最小副作用抑制纤维化的理想药物,但抑制Smads 2和Smads 3作用的药物在纤维化动物模型中使用时已取得成功。表达Smad7的病毒载体有望阻断Smads 2和Smads 3,并且卤富金酮抑制TGF-β诱导的几个细胞系中Smads 2中和Smads3的磷酸化(泽维尔等。2004). MEF中的微阵列研究表明,这些细胞中95%以上的TGF-β依赖性转录效应是Smad3依赖性的(杨等。2003); 因此,阻断Smad2可能只有最小的影响。事实上,在动物模型和人类中系统施用卤富隆的耐受性良好(松树等。2003).
然而,通过抑制Smad3对TGF-β信号的长期部分抑制可能会产生潜在的严重不良影响。在致癌的初始阶段,TGF-β被认为具有抑癌作用(韦克菲尔德和罗伯茨2002). 然而,持续表达嵌合Fc:TβRII TGF-β拮抗蛋白的转基因小鼠没有严重疾病,肿瘤发生率或进展也没有变化(杨等。2002). 此外,TGF-β是一种强效免疫抑制剂,在慢性炎症性疾病的发病机制中发挥作用,因此阻断TGF-β可能刺激自身免疫性疾病的发展。莱奥内等。(2001)据报道,在炎症性肠病患者的活动性病变中,Smad7蛋白的表达增加,而在同一患者的内镜下正常粘膜区域中不存在该蛋白。正常粘膜中可见丰富的磷酸化S-mad3,但在病变样本中未见;Smad3活性的丧失可能会阻断TGF-β的抗炎作用并导致疾病。为了避免这些和类似的潜在并发症,可局部应用Smad3抑制剂的纤维化条件可能最适合治疗。在接受放射治疗的患者中,治疗导致失明的纤维化眼病、改善伤口愈合和保护正常组织都是Smad3抑制剂可以改善预后的条件。