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国际实验病理学杂志。2006年8月；87(4): 317–324.
数字对象标识：10.1111/j.1365-2613.2006.00491.x号
预防性维修识别码：PMC2517374型
PMID：16875497

Hfe-/-与β2m-/-小鼠：铁状态和肝脏病理的年龄进展

佩德罗·罗德里格斯,*† 塞利亚·洛佩斯,† 克劳迪娅·马斯卡伦哈斯,* 保罗·阿罗西奥,‡ 格拉萨·波尔图,*§和玛丽亚·德索萨*†
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

血肿患者的肝脏铁超载可能具有高度的变异性，但一般来说，它发生在老年患者身上。本研究的目的是比较β2米-/-和生命周期-/-老年组小鼠特别注意肝脏病理。肝脏铁含量β200万-/-,生命周期-/-并对不同年龄（3周至18个月不等）的对照B6小鼠进行了检查。此外，还对18个月龄小鼠的其他参数（血液学指标、组织病理学、脂质含量和铁蛋白表达）进行了研究。这个β200万-/-该菌株表现出较高的肝脏铁含量、肝细胞核铁内含物、线粒体异常。此外，在该菌株中，肝脏脂肪变性是常见的现象。在肝脏中生命周期-/-小鼠单个核细胞浸润大，铁蛋白染色阳性，常见。常见的脂肪变性β200万-/-小鼠可能反映了其肝脏铁含量较高。大的肝单个核细胞浸润见于生命周期-/-铁蛋白染色可能表明淋巴细胞的铁隔离能力，并有助于澄清两个菌株中老年动物肝脏铁超载和脂肪变性进展的差异。

关键词：β2m，血红蛋白，铁超载，淋巴细胞，脂肪变性

β200万-/-小鼠出现自发性肝铁超载，其分布类似于遗传性血色素沉着症（HH）的肝脏病理学。因此，它们已成为研究铁超载障碍的优秀模型(德索萨等。1994;Rothenberg&Voland 1996年;桑托斯等。1996). 随着发现生命周期基因（非经典MHC I类基因）和C282Y突变形式未能与β200万(费德勒等。1996)，对早期发现的解释β200万KO小鼠被认为是由于Hfe功能受损，因为缺乏β2m分子。然而，随后对KO小鼠铁超载模型的研究表明，这不足以解释β200万-/-老鼠。小鼠双敲除（KO）生命周期和β200万比KO小鼠积累更多的组织铁生命周期独自一人(征收等。2000).Mhc公司I类基因敲除动物的肝脏铁水平也较高，这表明经典MHC I类分子参与了铁代谢的调节。存在额外的β2m相互作用的分子参与了铁吸收的调节米兰达等。(2004)证明了这一点β2毫米拉格1（-/-）和血红蛋白Rag1（-/-）具有异常高的铁过载状态。此外，铁代谢相关基因的差异表达分析β200万-/-和生命周期-/-使用专门的基于铁芯片cDNA的微阵列的小鼠显示铁基因表达谱的差异(穆肯塔尔等。2003,2004)在两个模型之间。虽然十二指肠铁转运蛋白（DMT-1和铁转运蛋白1）的表达增加Muckenthaler公司等。(2004)，可以解释铁吸收增加的记录β200万-/-老鼠(桑托斯等。1996)，在中未观察到类似情况生命周期-/-具有相同遗传背景的小鼠(赫尔曼等。2004). 在该研究中，β200万KO小鼠。

对铁超载动物模型进行的大多数研究都使用了年轻成年小鼠。然而，年龄是HH和其他铁超载疾病表达的关键因素，这些疾病通常与人类的相关肝病有关。在本文中，我们对12个月以上的小鼠自发铁超载的两种模型进行了比较研究。所检查的模型为β200万-/-和生命周期-/-老鼠保持正常饮食。该研究侧重于肝脏病理学，揭示了细胞内铁分布模式、脂质积累和单核细胞浸润的差异。

动物、材料和方法

老鼠

这个β200万-/-,生命周期-/-小鼠（均回交到B6背景）和C57Bl/6（B6）小鼠在分子和细胞生物学研究所（IBMC）动物设施中繁殖和饲养。本研究中使用的小鼠来自几个年龄组（3周、3.5个月、9个月和18个月），并以标准饮食喂养随意对于血液学参数，杀死年龄最大组（18个月）的6至8只动物。为了进行组织学分析，对11至18只动物的组织进行了检查。所有动物实验都是按照该研究所的动物伦理准则进行的。

组织学和电子显微镜

18个月龄小鼠的肝脏、脾脏和胰腺样本[B6，生命周期-/-和β200万-/-]固定在缓冲甲醛中。常规组织学检查后，石蜡切片用苏木精-伊红染色。用Perls蓝染色法检测铁。

在电子显微镜下，将来自相同动物组的小块肝脏在4°C条件下固定在2.5%戊二醛缓冲液（0.1M，pH 7.2）中至少24小时。用二羧酸缓冲液清洗组织两次，并将其固定在同一缓冲液中的1%（w/v）OsO4中。样品在分级系列乙醇中脱水后嵌入Epon树脂（TAAB Lab Equipment Ltd，Berkshire，Berkshare，UK）中。半薄截面（1μm） 并用亚甲基蓝染色。切割超薄切片（60 nm），并与2.5%醋酸铀酰和柠檬酸铅进行对比。在蔡司EM10电子显微镜下进行超微结构分析（德国奥伯科钦蔡司）。

铁的测量

简单地说，研究B6、，生命周期-/-和β200万-/-收集菌株并将其储存在−70°C下供进一步使用。肝脏非血红素铁的测定采用了苯二氮杂菲法(托伦斯和博思韦尔1980).

转铁蛋白饱和度和血液学测量

血液样本通过心脏穿刺从18个月大的小鼠[B6，生命周期-/-和β200万-/-]在麻醉下。对于红细胞参数，在EDTA管中采集血液，并在Coulter-S计数器（加利福尼亚州Fullerton Coulter Electronics）上评估血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积（HCT）和平均红细胞体积（MCV）。对于铁含量，200μl来自每只动物的血清用于通过使用Cobas-Fara化学分析仪的铁锌法测定血清铁和总铁结合能力（TIBC）。转铁蛋白饱和度计算为（血清铁/TIBC）×100。

肝铁蛋白免疫组织化学

肝脏样本固定在缓冲甲醛中，石蜡切片用H和L小鼠铁蛋白亚基（P.Arosio）的多克隆抗体免疫。所有切片均采用亲和素-生物素复合物法染色。在免疫组化染色之前，用二甲苯将载玻片脱蜡，并通过分级醇，然后在微波炉中在pH 8（759W）、EDTA 1mM中培养20分钟，以进行表位检索。将样品置于三缓冲盐水（TBS）中，为了减少非特异性结合，将1:5稀释的正常猪血清涂抹20分钟。随后，将切片与多克隆兔抗Fer-H或Fer-L抗体以1:100稀释度孵育过夜。然后，在去除多余的血清并在TBS中洗涤后，将猪抗兔免疫球蛋白与生物素结合（DAKO，Glostrup，Denmark）涂抹30 min，稀释1:200。在额外洗涤后，用二胺联苯胺（DAB）亚基（DAKO）显色2分钟。洗涤后，使用迈尔苏木精对切片进行30分钟的复染，并将其安装在Aquatex®（默克，达姆施塔特，德国）。

定量脂泡显微镜分析

使用配备彩色电荷耦合器件（CCD）相机的徕卡DMLB显微镜（英国剑桥徕卡公司）在×100倍放大下检查肝脏切片。在LeicaQWin图像分析仪（Leica Cambridge，Lda.）中，一个方形图像框（面积为26276.5μ米2)已使用。对于每只小鼠，在随机选择的肝小叶中的五个相似的显微镜视野（即在同一区域的切片中）评估空泡。结果表示为平均值±SEM（面积μ米2). 使用LeicaQWin程序中开发的例程对脂质含量进行计算机图像分析。设置亮度阈值，并在数字化图像上叠加临时二值彩色图像。感兴趣的区域（白色）用假彩色勾勒出来。这允许操作员检查测量区域的准确性。因此，获得阳性面积的平均值，并表示为平均值±SEM。

统计分析

所有统计分析均使用MINTAB软件进行。使用Mann–Whitney分析治疗效果U型-对连续变量的多重比较进行随后的Bonferroni校正检验，对比例进行卡方检验。结果以平均值±SEM表示。在P（P）< 0.05.

结果

肝脏铁含量

在3周龄时，对照菌株和敲除菌株之间没有显著差异(图1). 在3.5个月时生命周期-/-和β200万-/-与B6相比，小鼠出现了铁超载。在3.5到9个月之间β200万-/-小鼠的肝脏铁浓度进一步增加，而生命周期-/-将观察值保持在3.5个月。这些差异在18个月大的小鼠中仍然存在(表2). 肝脏铁含量随年龄变化的动力学如所示图1两种菌株在3周时表现出相似的起始点，两者都迅速增加生命周期-/-和β200万-/-菌株，随后是较老菌株的平稳期生命周期-/-老年小鼠铁浓度进一步增加β200万-/-动物。较旧的β200万-/-小鼠的铁含量在统计学上显著高于生命周期-/-对应方(图1).

表2

18月龄小鼠肝脏组织学分析、铁含量

组织学分析铁
应变n个单核浸润，%脂肪变性病灶，%全身性脂肪变性，%真空区，μ米2每个字段铁，μ克/克干重
B6号机组187（39）页6（33）页第2（11）条130±172安 399±140安
生命周期-/-118（72）b3（27）条第1（9）条  81±75安1142±344磅
β200万-/-155（33）页9（60）b7（47）b1782±2752磅1468±479摄氏度

肝脏铁含量和空泡面积表示为平均值±SE。

在每一列中，不同的字母表示各组在P（P）< 0.05.

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肝脏铁浓度与。年龄在B6，生命周期-/-和β200万-/-菌株。肝脏样本(n个=8−12）在0.7、3.5、9和18个月时从所有菌株中收集。对于铁的定量，使用了二苯菲咯啉法*统计显著差异(P（P）<0.05）生命周期-/-和β200万菌株。

血液学指标

对红系参数的评估表明，18个月大的婴儿β200万-/-与B6或生命周期-/-菌株(表1). HCT水平从B6增加到生命周期-/-和来自生命周期-/-至β200万-/-. 然而，MCV值在生命周期-/-然后是β200万-/-这反过来又高于B6(表1).

表1

18月龄小鼠的血液学指标

红细胞参数血清铁水平
应变n个红细胞，×1012我血红蛋白（毫摩尔/升）HCT，%MCV，飞行硅，μ克/分升TIBC公司，μ克/分升Tf饱和，%
B6号机组88.12±0.37安培12.1±0.6安36.0±2.0安44.3±0.8安培167±32安440±43安37.8±4.8安
生命周期-/-68.20±0.13安13.1±0.3安39.4±1.2磅48.0±1.0磅329±31磅383±28磅87.4±1.9磅
β200万-/-89.82±0.72磅15.3±0.9磅45.2±2.9摄氏度46.0±0.9摄氏度403±50磅539±46摄氏度73.4±12.0磅

数值表示为平均值±SE。

红细胞，红细胞；血红蛋白；HCT，红细胞压积；MCV，平均红细胞体积；SI，血清铁；TIBC，总铁结合能力；Tf-Sat，转铁蛋白饱和度。

在每一列中，不同的字母表示各组在P（P）< 0.05.

正如预期的那样，血清铁和转铁蛋白饱和度在生命周期-/-和β200万-/-小鼠与B6对应物进行比较。有趣的是，TIBC水平在β200万-/-（539±46），其次是B6（440±43）生命周期-/-小鼠（383±28）只。各自的差异具有统计学意义(表1).

组织学和EM

从对18个月大小鼠的Perls染色的肝脏切片的分析中可以清楚地看出β200万-/-和生命周期-/-肝细胞中有可稳定的铁，但库普弗细胞中没有，这表明铁超载模式类似于人类HH，这种情况在B6小鼠中没有观察到（数据未显示）。然而，染色强度在β200万-/-动物与生命周期-/-与铁含量值一致(表2). 此外，在β200万-/-小鼠肝细胞核可见蓝色染色，这种情况在生命周期-/-或B6菌株(图2a、b). 此外，肝脏的超微结构分析经常显示肝内线粒体异常（增大且无可见内嵴）β200万-/-肝细胞(图2c、d).

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18个月大的肝脏切片β200万和生命周期-/老鼠。用Perls方法对铁进行染色的切片，蓝色染色表明铁沉积严重：（a）β200万-/-菌株，黑色箭头显示蓝色染色的肝细胞核内含物；（b）生命周期-/-小鼠（原始放大倍数×400）。肝实质细胞的电镜观察；（c）β200万-/-小鼠，白色箭头表示线粒体异常，无可见嵴；（d）生命周期-/-应变（原始放大倍数×8000）。肝切片HE染色；（e）β200万-/-小鼠，实质内可见大空泡，表明全身脂肪变性；（f）生命周期-/-应变，星号表示脂肪变性病灶（原始放大倍数×40）。

肝脏切片分析显示，肝脏脂肪变性在β200万-/-老鼠比在生命周期-/-或B6菌株。虽然在这三个组中可以观察到脂肪变性病灶，但观察到全身脂肪变性的动物数量在β200万-/-老鼠(图2e，f和表2). 此外，通过油红染色确定的脂质所占面积的形态分析表明β200万-/- (表2).

18个月龄小鼠的肝脏组织学检查也显示存在单核细胞浸润，通常与大血管相关。有趣的是，单核肝浸润的频率生命周期-/-小鼠（11只动物中的8只）与β200万-/-（5/15）或B6（7/18）（参见表2). 此外，还可以检测到Perls蓝阳性的散在细胞，这表明单核细胞浸润中的铁含量(图3a).

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18个月大的肝脏单核细胞浸润生命周期-/老鼠。（a） Perls法对肝脏切片进行铁染色，深蓝色染色表明浸润内有大量铁沉积（原始放大倍数×100）。（b–d）抗铁蛋白免疫组化（原始放大×100）。（b） 仅结合抗体。（c） 抗鼠Fer-L染色显示单核浸润内皮区（黑箭头）和肝细胞中的重铁蛋白L染色。（d） 抗鼠Fer-H染色显示在单核浸润处（白色箭头）有明显染色，但在内皮和实质区没有。

用Perls法对心脏和胰腺切片进行染色的研究表明，一些18个月大的婴儿生命周期-/-小鼠心脏有铁沉积，这种情况在β200万-/-以及年龄相似的B6小鼠。

免疫组织化学

回答以下问题：单核细胞的存在是否与观察到的铁含量变化差异有关β200万-/-和生命周期-/-用L和H铁蛋白的多克隆抗体对小鼠的肝脏石蜡切片进行染色。免疫组织化学染色显示浸润区内有两个明显的分隔区(图3).

用抗Fer-L标记的肝脏切片显示了实质的可见染色和浸润的强烈标记。Fer-L阳性单核浸润区主要局限于内皮和内皮周区域(图3c). 相反，抗Fer-H的切片显示，位于聚集体外部的单核细胞本身被严重染色。肝细胞中未观察到H-铁蛋白的强标记(图3d). 总之，这些结果表明，单核浸润同时含有H和L铁蛋白。

讨论

本次老年人对比研究的结果β200万-/-和生命周期-/-小鼠在铁分布、铁过载程度、肝脏单核细胞浸润和肝脏脂肪变性方面存在差异。

事实上，肝脏铁浓度在不同年龄段达到了高原生命周期-/-和β200万-/-菌株（分别为3.5个月和9个月）可能表明铁吸收水平存在差异。此外，在肝铁稳定后β200万-/-小鼠的肝脏铁含量高于生命周期-/-对应一种可能解释其他研究结果的情况(征收等。2000). 反常的是，在β200万-/- (桑托斯等。1998)和在生命周期-/-老鼠(巴赫拉姆等。1999). 由于没有一项研究同时比较了这两个菌株，在相同的住房条件下，尚不清楚它们是否有类似程度的铁吸收破坏。由开展的表达谱研究Muckenthaler公司等。(2003,2004)在里面β200万-/-和生命周期-/-十二指肠组织显示，十二指肠铁转运蛋白（DMT1和Ferroportin）在β200万-/-中未观察到的情况生命周期-/-老鼠。然而，不能忽视所看到的差异的重要性。或者β200万-/-老鼠可以用缺乏β2m结合分子，而非Hfe本身，这也是由以下研究得出的结论：Muckenthaler公司等。(2004)最近，有研究表明，小鼠缺乏经典MHC本身会导致中度肝脏铁超载(卡多佐等。2002)指出MHC蛋白和其他未知蛋白的重要性β铁代谢中的2m结合分子。

除了肝脏铁含量升高外β200万-/-小鼠，从组织学分析中可以明显看出肝细胞有核铁内含物，这种情况在生命周期-/-在这项研究中，尽管之前没有评论，但对老鼠进行了说明(德索萨等。1994).

肝细胞中的核内含物高铁-/-小鼠最近被广泛描述为马根斯等。(2005)必须强调的是，在本研究中，动物并没有因服用铁而超载。本报告和之前报告中的核包裹体德索萨等。(1994)铁超载是自发形成的，因此模拟了人类疾病的临床自然史。此外，在β200万-/-电子显微镜研究显示，线粒体经常受到破坏，内部组织异常。这些发现进一步表明肝铁超载的严重程度β200万-/-肝脏与生命周期-/-对应方。

本研究中血液学指标的比较突出了老年小鼠品系之间的差异。以B6小鼠作为基线对照，很明显生命周期-/-呈现出与血色素沉着症患者相似的特征，即红细胞计数和血红蛋白浓度正常，HCT、MCV和转铁蛋白饱和度升高。相比之下β200万-/-如先前报道的那样，小鼠表现出与较高血红蛋白浓度相关的红细胞数量显著增加（8）。此外β200万-/-小鼠HCT和MCV升高；然而，这些值与在生命周期-/-老鼠。正如预期的那样，这两个菌株的血清铁和转铁蛋白饱和度都升高(桑托斯等。1996;周等。1998). 有趣的是，TIBC在β200万-/-高于对照小鼠。该观察结果与在生命周期-/-通常归因于对升高的铁库的反应的应变。TIBC在β200万-/-老鼠，不像生命周期-/-应变，可能是由于存在结构性的铁吸收升高，超过了转铁蛋白转运能力的阈值，从而可能动员其他铁结合蛋白。最近的研究表明，结合珠蛋白是一种与血红蛋白具有高亲和力的血浆蛋白，可以改变小鼠的血色素沉着症表型，对在小鼠体内观察到的铁负荷有显著贡献生命周期-/-应变，应变(托洛萨诺等。2005). 研究这种铁结合蛋白在β2（-/-）以及高铁-/-老鼠。

肝脏脂肪变性在β200万-/-老年小鼠，这种情况在老年小鼠中没有观察到生命周期-/-或B6小鼠作为人类肝病模型也很有意思。人们认为，人体的铁储存疾病通过产生活性氧物种导致器官损伤，活性氧物种可导致脂质氧化损伤。通过增加脂质过氧化的主要产物，如丙二醛，在超载动物（通过补铁饮食或腹腔注射右旋糖酐铁）中已经证明了肝脏脂质过氧化(Valerio&Petersen 1998年;可汗等。2002;索恰斯基等。2002)或硫代巴比妥酸活性物质，在18个月大的婴儿中观察到生命周期-/-老鼠(勒博等。2002). 此外，研究表明，在铁超载小鼠中，硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）mRNA水平及其相应活性增加(鸽子等。2001年a). 由于SCD1参与了不饱和脂肪酸的生物合成，因此有人认为SCD1表达和活性的增加可能反映了细胞对更新被脂质过氧化降解的不饱和脂肪酸类需要的一种补偿机制。因此，我们很容易推测β200万-/-小鼠与该菌株中的明显脂质过氧化有关。作为反应，脂质的生物合成可能会增强，从而导致肝脏脂质以大量肝脂肪变性的形式积聚。这在中未观察到生命周期-/-老鼠。

有趣的是，H和L铁蛋白表达区域不同。狭窄的血管周围，据报道在12个月内铁积聚生命周期-/-老鼠(鸽子等。2001亿)被L-fer阳性单核细胞占据。很容易推测肝脏单核细胞浸润可能是铁负荷反应的一部分。这一发现和以前的结果特别来源于患者的结果(波尔图等。1994)和拉格牌手表（-/-）小鼠(桑托斯等。2000;米兰达等。2004)为铁超载中淋巴细胞数量的实验模型提供进一步证据。然而，在实验模型中，如本文所研究的，这一结论是基于出生时在所有隔室中检测的淋巴细胞数量，而在患者中，只有少数例外(卡多佐等。2001)淋巴细胞数量只在外周血中测量。

总之生命周期-/-以及β200万-/-小鼠表明β200万-/-该菌株呈现严重的肝脏铁超载图像，具有较高的肝脏铁含量和其他组织细胞学特征，如细胞核铁内含物和线粒体异常。肝脏脂肪变性在β200万-/-该菌株可能反映了肝脏高铁含量导致脂质过氧化，进而导致脂质生物合成和积累。观察发现，在生命周期-/-应变，不在β200万-/-，可能与已知的CD8淋巴细胞组成低数量有关β200万-/-老鼠。不幸的是，在目前的研究中无法描述淋巴细胞表型。事实上，这些大薄片的铁蛋白染色呈阳性，这让人很容易推测，淋巴细胞的固铁能力在β200万-/-小鼠，从而导致该毒株老年动物肝脏铁超载和脂肪变性的更严重进展。

致谢

作者感谢Miguel Duarte（显微镜设置）、Bianca Machado（动物解剖）、Cidália Silva和Jülia Reis（血液学参数）的帮助。本研究得到欧盟QLG1-CT-1999-00665项目的支持；Calouste Gulbenkian基金会/FCT血色素沉着症项目（葡萄牙）和INNOVA基金会/APBRF（美国）。

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文章来自国际实验病理学杂志由以下人员提供威利