延髓腹外侧区的前BötC被假设为呼吸节律产生的核心在体外和体内1——4神经激肽1受体（NK1R）表达的前BötC神经元在清醒和睡眠呼吸暂停期间以共济失调节律存活的成年大鼠，其缓慢（~天）、毒物诱导的神经元变性>80%1,5这种病理性呼吸模式是由正常控制呼吸相关肌肉的神经元驱动的，包括那些潜在的意志或情绪行为，还是由对缓慢神经退行性变的补偿重组驱动的，目前尚不清楚。为了消除缓慢损伤导致的适应，我们迅速（~分钟）降低了表达Sst的前BötC神经元谷氨酸能亚群的兴奋性6该群体与表达NK1R的神经元重叠；28±2%的前BötC-Sst神经元表达NK1R，41±1%的前BötC-NK1R神经元表达Sst（5-6周龄大鼠，n个=3；补充图1与新生大鼠preBötC的重叠相一致7我们假设前BötCSt神经元对正常呼吸至关重要，并预测沉默这些神经元会导致清醒成年大鼠急性呼吸暂停；随着缺氧和高呼吸暂停随着呼吸暂停加重，我们推测其他机制，特别是与意志或情绪驱动有关的机制，会恢复呼吸，就像中枢性先天性低通气综合征的情况一样8基因型神经元亚群的快速可逆沉默可以阐明其在行为中的作用。这可以通过靶向表达Allotostatin受体（AlstR）来实现，这是一种G蛋白偶联受体，在哺乳动物中既不表达也不被任何内源性配体激活9——11表达AlstR的哺乳动物皮层和脊髓神经元可以迅速可逆地失活在体外12,13和体内麻醉下10通过服用尿囊收缩素，打开K+通道9,13使其超极化。我们在靶向前BötC神经元中表达AlstR和增强型绿色荧光蛋白（EGFP），并研究了应用allotostatin对成年大鼠呼吸的影响。
为了在成年大鼠前BötC神经元中获得稳定可靠的外源基因表达，我们使用腺相关病毒2（AAV2）以确保高感染效率和低细胞毒性或炎症的长期表达10,14首先，我们描述了使用带有突触蛋白启动子的AAV2来驱动EGFP表达（Syn-EGFP；补充方法在线）。在BötC前注射Syn-EGFP后3周内10，在距离注射部位约250µm的神经元胞体中可以检测到EGFP。邻近区域（例如，Bötzinger复合体；). 与转基因小鼠模型固有的广泛表达相反（例如，参见参考文献。12)这些病毒微注射产生靶基因的位点特异性表达，靶基因高度定位于注射部位周围的三维空间，因为我们在脑干、脊髓或小脑的其他部位没有发现EGFP表达(补充表1在线）。
前BötC神经元被含有Syn或Sst启动子的AAV2感染。(一)微量注射Syn-EGFP AAV2 3周后，成年大鼠preBötC（黄色圆圈）中EGFP的表达（绿色）。7N，面神经核；AmbC，模糊核致密；BötC，Bötsinger杂岩；LRt，外侧网状核。(b条)Syn-AlstR-EGFP AAV2感染的前BötC细胞（绿色）呈NeuN免疫反应性（红色）；也就是说，它们是神经元。(c（c）)一些Syn-AlstR-EGFP AAV2感染的前BötC神经元（绿色）为NK1R免疫反应性神经元（红色）。(d日)感染Sst-EGFP AAV2的前BötC神经元（绿色）呈Sst免疫反应性（红色）。(e（电子）)小部分Sst-AlstR-EGFP AAV2感染的前BötC神经元（绿色）为NK1R免疫反应性神经元（红色）。使用共焦显微镜获得图像。插图是显示神经元的高倍放大。维恩图表示神经元的相对数量和相关标记的重叠(b–e类)归一化为NeuN免疫反应(n个前BötC每侧约有3000个神经元）。黄色箭头表示神经元共存，白色箭头表示神经元不共存相关标记。比例尺代表50µm。
调节前BötC神经元兴奋性体内，我们利用突触素启动子构建了一个AAV2构建物，以驱动带有与EGFP基因连接的内部核糖体进入位点的AlstR cDNA（Syn-AlstR-EGFP）10在前BötC中注射病毒4周后检测到EGFP。几乎所有EGFP阳性细胞（99±1%，n个=7只大鼠）对神经元特异性标记物NeuN呈免疫反应()，占100µm内所有神经元的64±8%，占250µm注射部位所有神经元的20±2%(n个= 7). 这种病毒感染模式可能取决于前BötC神经元不同亚群中AAV2感染偏好的基因型差异，以及感染概率随距离注射部位的距离而降低。我们发现，21±4%表达NK1R的前BötC神经元也表达EGFP，10±2%表达EGFP的神经元也对NK1R呈免疫反应(n个= 9;). 在表达Sst的前BötC神经元中，20±4%也表达EGFP，15±4%表达EGF的神经元也表达Sst阳性(n个=3；补充图2和补充表2在线）。前BötC附近酪氨酸羟化酶免疫反应阳性的神经元2,6，感染不良；只有2±1%的EGFP神经元对酪氨酸羟化酶呈阳性反应，<5%的神经元对酪氨酸羟化酶阳性（4±3%；n个=7）表达的EGFP(补充图2).
突触蛋白酶启动子对Sst神经元没有选择性。为了专门针对这些神经元，我们用AAV2载体中的小鼠Sst启动子替换了突触素启动子(补充图3在线）。EGFP仅在每侧465±26个前BötC神经元中表达(n个=6）注射Sst-EGFP后3周()或注射Sst-AlstR-EGFP后6周(补充图3). 我们发现100μm注射部位66±7%的神经元和250μm注射位置16±1%的神经元表达EGFP(n个= 6;补充图3)81±8%的preBötC Sst神经元表达EGFP，80±6%的preBótC EGFP神经元为Sst阳性(n个= 4;补充图3和补充表2). 一些前BötC NK1R神经元（16±5%，n个=5）EGFP阳性，11±3%(n个=5）个EGFP神经元对NK1R呈免疫反应()；酪氨酸羟化酶无阳性神经元(n个= 6;补充图3).
在受感染的前BötC神经元中激活AlstR能改变麻醉大鼠的呼吸模式吗？在麻醉大鼠中，呼吸的意志和情绪驱动受到抑制？我们使用Syn-AlstR-EGFP AAV2检测了大量神经元（每侧590±62个）失活对呼吸的影响。将Syn-AlstR-EGFP注射到preBötC后4-6周，对麻醉大鼠应用Allatostatin。潮气量（即吸气峰值振幅）在30秒内趋于减少，在~90秒内降至50%，而频率在~60秒内趋于减少。在~2.5分钟出现呼吸暂停时，潮气量在2分钟降至50%(n个= 5;补充图4在线）。呼吸暂停1.5分钟后，对大鼠进行机械通气。每10分钟停止呼吸机1分钟（如果发现心律失常，则停止1分钟），以检查是否有自发呼吸，但在40分钟之前没有观察到呼吸，此时大鼠开始呼吸(n个=5；补充图4). 我们观察到，5只大鼠中有3只在应用allotostatin的20秒内表现出明显的短暂过度换气(P（P）< 0.05;补充图5在线）。向注射了Syn-EGFP的麻醉大鼠注射allotostatin并没有改变其呼吸模式(补充图4).
前BötC神经元中AlstR的病毒表达会改变成年大鼠的呼吸模式吗？当我们在未经病毒注射的情况下给清醒大鼠注射尿囊收缩素时(n个= 4;补充图6或在大鼠体内注射Syn-EGFP到preBötC后4-6周(n个= 4;补充图7在线），我们没有观察到呼吸有实质性变化。相比之下，清醒大鼠在前脑BötC注射Syn-AlstR-EGFP后4-6周给予类似的allotostatin后，30秒内幅度（214±89%）和频率（157±43%；补充图7)之后两者都逐渐减少。90秒时，呼吸恢复到基线水平（振幅为117±53%；频率为106±29%）。在2到2.5分钟之间，振幅和频率降低到基线的50%。4.5分钟时，这些清醒的大鼠出现呼吸暂停(补充图7). 尽管处于清醒状态，这些大鼠仍然没有呼吸，即使他们不间断的呼吸暂停发展到严重缺氧（皮肤发蓝）；呼吸暂停1.5分钟后，他们进行机械通气以防止窒息。较低剂量的allotostatin（0.34µmol/kg体重）影响振幅（66±17%对93±6%，P（P）< 0.05,n个= 6,补充图8在线），但对频率几乎没有影响(P（P）=0.084），并且没有导致呼吸暂停；进一步降低剂量没有效果(补充图8). 在短暂过度换气的早期，心率升高，但在呼吸暂停发作前受影响最小(补充图9在线），表明呼吸暂停的诱导不是心血管变化的继发因素。因此，快速沉默异质的前BötC神经元亚群可导致持续性呼吸暂停。
接下来，我们测试了沉默Sst神经元是否会导致呼吸暂停。我们微量注射了Sst-AlstR-EGFP(补充图3)成年大鼠preBötC。与注射Syn-AlstR-EGFP的麻醉大鼠相比，这些大鼠在麻醉期间随后（约6–8周）注射allotostatin后产生了类似的呼吸抑制，但进展为长时间（约4分钟）的呼吸暂停（约60分钟）(n个= 4;). 两只麻醉大鼠在应用allotostatin的20 s内表现出明显的短暂换气过度(P（P）< 0.0001,补充图5). 注射后6-8周对清醒大鼠进行类似的allotostatin给药后，产生了短暂的过度换气（振幅，150±20%；频率，215±54%），持续约3分钟后，通气量显著下降，在约5分钟时进展为呼吸暂停(n个= 6;). 尽管处于清醒状态，但这些大鼠没有呼吸，它们需要机械通气以防止窒息。Sst-EGFP–注射麻醉(n个=4）或清醒(n个=4）应用allotostatin后，大鼠未表现出任何实质性呼吸抑制(). 因此，在清醒的成年大鼠中，选择性和快速沉默前BötC Sst神经元会导致持续性呼吸暂停。
在麻醉和清醒的大鼠中，表达AlstR的preBötC-Sst神经元的快速沉默诱导了呼吸暂停。在之前（6–8周）双侧预BötC微量注射Sst-AlstR-EGFP后，给予Allatostatin（0.42µmol/kg，小脑延髓池内）。(一)应用allotostatin对麻醉大鼠呼吸模式（气流）的影响；呼吸暂停持续时间（约60min）采用机械通气。(b、 c（c）)服用Allatostatin导致两种频率逐渐下降(b条)和潮气量(c（c）)直到应用allatostatin后约4分钟出现呼吸暂停。机械通气后，大鼠恢复自然呼吸(n个= 4). 应该注意的是，在n个=4只麻醉的Sst-AlstR-EGFP大鼠中有2只在服用allotostatin后的约20 s内通气量有小而显著的短暂增加(补充图5)这在分组数据中不明显(b条和c（c）). (d日)应用allotostatin后清醒大鼠呼吸模式（潮气量）的变化。(e、 （f）)归一化频率的变化(e（电子）)和振幅(（f）)绘制了allatostatin的应用曲线。数值为平均值±s.d.（Sst-AlstR-EGFP，n个= 6; Sst-EGFP、，n个= 4). 通风、机械通风。误差线表示±标准偏差。
前BötC是异质的，由几个表型不同的神经元亚群组成，一些重叠，如NK1R和Sst表达的神经元，以及一些特异性神经元，如谷氨酸能和甘氨酸能神经元。NK1R-or-Sst表达亚群的扰动实质上扰乱了正常的节律发生。我们还不能说这是因为它们具有独特或共同的功能作用，还是因为它们是更大的前BötC神经元群的一部分，当某些阈值百分比的神经元沉默或受损时，它们无法产生节律，如感染Syn-AlstR AAV2的大鼠的结果所示（其中只有一小部分受感染神经元表达Sst或NK1R）。无论如何，节律发生的基本神经回路位于前BötC。
我们假设我们的方法成功地使前BötC神经元沉默，但这需要电生理记录来证实。我们认为，前BötC Sst神经元的直接抑制是诱发快速发作持续性呼吸暂停的原因，这些神经元对于呼吸节律的逐时产生非常重要，呼吸节律是血气和pH调节的基础，尤其是在清醒的哺乳动物中。值得注意的是，清醒大鼠在持续进行性缺氧的情况下根本无法呼吸，这表明，在这些情况下，可能驱动呼吸的其他机制，例如与自愿和/或情绪呼吸控制相关的机制，都不存在或被阻断。
