美国国家科学院院刊。1997年12月23日；94(26): 14300–14305.
一种与转录因子IIF相互作用的C末端结构域磷酸酶的基本成分酿酒酵母
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雅克·阿尔坎鲍尔
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
罗斯·S·钱伯斯
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子与医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
迈克尔·S·科博
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
袁浩
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加州大学伯克利分校生物化学和分子生物学系分子和细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
米雷勒·卡地亚
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
戴安娜·博洛廷
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
布伦达·安德鲁斯
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
卡罗琳·M·凯恩
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
杰克·格林布拉特
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
*Banting and Best医学研究和§加拿大安大略省多伦多市学院街112号多伦多大学分子和医学遗传学系M5G 1L6；‡加利福尼亚大学伯克利分校生物化学与分子生物学系分子与细胞生物学系，邮编94720；和¶加拿大安大略省多伦多市研究所病童医院遗传学系M5G 1X8
†J.A.和R.S.C.对这项工作做出了同等贡献。
由加利福尼亚大学伯克利分校Michael J.Chamberlin传达
1997年8月13日收到；1997年10月31日接受。
摘要
磷酸酶的基本成分之一，能特异性地去磷酸化酿酒酵母RNA聚合酶II（RPII）大亚基C末端结构域（CTD）是一种新的多肽，由一个称为飞行控制面板1Fcp1蛋白定位于细胞核，与酵母通用转录因子IIF（Tfg1）的最大亚单位结合。体外，转录因子IIF在Fcp1和第二个互补组分存在时刺激磷酸酶活性。Fcp1的两个不同区域能够与Tfg1结合，但C末端Tfg1-binding结构域对活性来说是不必要的体内和在体外序列比较表明，Fcp1的173–357残基与许多生物体中预测的功能未知的蛋白质中存在的氨基酸基序相对应。
RNA聚合酶II（RPII）的启动子依赖性转录需要六种通用转录因子（参考文献。1). 优先与启动子结合的RPII形式在其最大亚单位的C末端七肽重复结构域（CTD）上没有被广泛磷酸化(2–4). 相反，CTD在启动期间或启动后不久被磷酸化，并且延长的RPII通常具有磷酸化的CTD(5,6). CTD磷酸化可能是一个调节过程：热休克诱导果蝇属hsp70基因导致RPII在启动子下游暂停并带有未磷酸化的CTD，用磷酸化CTD转录下游序列(7). 活化剂诱导的CTD磷酸化也可能促进RNA链延长(8–11). 在转录终止之前或之后，CTD去磷酸化可能必须发生才能再生能够重新启动转录的酶。
转录因子IIF（TFIIF）（RAP30/74）直接与RPII结合，并帮助在启动子处将RPII组装成预启动复合物(12–14). 延伸的RPII也与TFIIF相互作用，从而刺激其链延伸率(15,16). TFIIF还刺激从人类细胞中纯化的CTD磷酸酶的活性(17,18)和酵母(19). 酵母CTD磷酸酶活性需要两种成分(19)其中一个在这里描述，由一个必需基因编码，与人类CTD磷酸酶活性所必需的人类蛋白质密切相关（J.a.、H.Xiao、G.Pan、G.Dahmus、M.C.、S.Zhang、R.G.Roeder、M.Dahmuss和J.G.，未发表的工作）。TFIIF可以调节CTD磷酸酶活性，这突出了RPII磷酸化循环在调节转录的起始和延伸反应中的重要性。
材料和方法
重组yFcp1质粒的构建和制备。
酵母生长和操作基本上如所述(20). 酵母通过醋酸锂法转化(21).
使用质粒JA739在酵母中表达完整的Fcp1 ORF镀锌10发起人。A类Bgl公司编码yFcp1的II-cut PCR片段（使用引物5′-CCCAGATCT扩增自动液位计ACCCACAAATAGGTCTCC-3′和5′-CCCACAATCGATACGACTCGAGCTGCTA公司ATC-3′；ATG和Stop密码带下划线）插入巴姆质粒pYGal的HI位点。PYGal是pFL39的衍生物(TRP1第6层; 22）并携带镀锌10启动子（插入生态RI和Sma公司I站点）和PGK公司转录终止信号（在速度我和Hin公司dIII站点）（来自多伦多大学詹姆斯·弗里森）。质粒JA754[表达来自镀锌10启动子的N末端标记有六个组氨酸残基，其后是血凝素（HA）表位，该启动子含有插入到Sma公司位于yFcp1 ORF上游的JA739站点。质粒JA756编码缺失C-末端66氨基酸的截短Fcp1蛋白，通过替换Spe公司我-萨尔JA754中的I yFCP1片段Spe公司我-Xho公司我将编码Fcp1的457–666氨基酸的PCR产物与密码子666下游的合成TAG Stop密码子进行切割。质粒JA798编码缺失C-末端275氨基酸的截短Fcp1蛋白，含有回文寡核苷酸5′-C标签CCTAGGCCTAGG-3′编码插入Spe公司质粒JA754的I位点。
编码Fcp1氨基酸1-732的质粒JA782融合到HA表位，通过分离Nco公司我-Hin公司来自质粒JA754的dIII yFCP1片段，并将其插入T7启动子下游Nco公司我和Hin公司质粒pET23-d（Novagen）的dIII位点。编码T7启动子下游Fcp1氨基酸1-666的质粒pJA785通过插入Nco公司我-Hin公司来自pJA756的dIII片段Nco公司我和Hin公司pET23d的dIII位点。编码Fcp1氨基酸1–457的质粒pJA801含有回文寡核苷酸5′-C标签CCTAGGCTAGG-3′编码插入Spe公司pJA782的I站点。通过将以下双链寡核苷酸插入Nco公司JA782（5′-C）的I位置自动液位计CACCACACACACA-3′和5′-CATGTGGTGGTGTGGTG-3′；引发剂ATG密码子下划线）。
质粒pDB3和pDB4分别表达内源性氨基酸1-732和1-626FCP1（飞行控制程序1）启动子，通过克隆FCP1（飞行控制程序1）到pDB2中。质粒pDB2含有FCP1（飞行控制程序1）启动子区（相对于ORF起始密码子中的第一个核苷酸为−303至−10）和插入到生态RI和Spe公司低拷贝质粒pRS313的I位点(23). 用PCR扩增启动子区，引物为5′-TCGGATCCAACGTAGATGCAACC-3′和5′-CGCAGATCTGTGTACACGTCGC-3′。使用引物5′-TCGGATCCTCCAGATGCCGTATCTTTCC-3′和5′-CGCCAGATCTAGCAGCTAATGGCTCGAGAG-3′扩增下游区域。使用美国型培养物收集Cosmid 8021进行扩增。这个Nco公司我/Xho公司包含全长ORF的pJA782的I片段FCP1（飞行控制程序1）被克隆到Sma公司我用pDB2站点制作pDB3。这个Nco公司我/Nde公司pJA782的I片段包含飞行控制面板1ORF被克隆到Sma公司我用pDB2站点制作pDB4。
分别表达来自内源性yFcp1启动子的yFcp1（1-732）和yFcp（1-666）的质粒pJA794和pJA796含有738-bp，Nco公司编码yFCP1启动子和上游区域的I-cut PCR片段（使用引物从酵母基因组DNA中扩增：5′-GGGCGATGTCCATTTAGACAGTCACC-3′和5′-GGGCGAGTCTGCTTTGTGTTTACACGTCG-3′）插入到Nco公司质粒pJA754和pJA756的I位点。表达yFcp1（1–457）的质粒pJA804含有回文寡核苷酸5′-C标签CCTAGGCCTAGG-3′编码插入Spe公司质粒pJA794的I位点。
将用于表达重组Fcp1及其缺失衍生物的质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3），并根据Novagen的指示诱导细胞。收集细胞，在冷蒸馏水中清洗，再悬浮在50 mM三乙酸盐中，pH 7.8/20%甘油/0.5 M醋酸钾/5 mM咪唑/0.1%Triton X-100/5 mM2-巯基乙醇/1 mM苯甲基磺酰氟中，并通过超声波对细胞进行裂解。通过12000×离心提取液回收不溶性重组yFcp1蛋白克持续20分钟，然后在与上述相同的缓冲液中用6 M尿素重新溶解颗粒。通过离心去除不溶性物质，并将上清液加载到Ni次氮基三乙酸盐（NTA）-琼脂糖柱（Qiagen，Chatsworth，CA）上。用含有6 M尿素和20 mM咪唑的同一缓冲液洗涤柱，并在同一缓冲溶液中用100 mM咪唑啉洗脱重组Fcp1。重组Fcp1按所述进行复性(24).
编码Fcp1的458–732、667–732和458–666氨基酸的质粒融合到大肠杆菌硫氧还蛋白（TR）通过插入巴姆HI-和生态RI将PCR片段剪切到巴姆HI和生态pET32-a（Novagen）的RI位点。在每种情况下，以质粒JA782为模板，扩增引物如下：5′-GGGGG-ATCCGTTGATGACGATGAACTAC-3′和5′-GGGGAATTCTA公司氨基酸458–732的ATCATCCAGCATCATCAA-3′[TR-yFCP1（458–73）]；5′-GGGGG-ATCCGACGAAAGTGATGACGAACAAC-3′和5′-GGGGAATTCTA公司氨基酸667-732[TR-yFCP1（667-732）]的ATCATCCAGCATCATCCATCAA-3′；5′-GGGGG-ATCCGTTGATGACGATGAACTAT-3′和5′-GGGGAATTCTA公司氨基酸458-666[TR-yFCP1（458-666）]的GTCGTGCGTCATCTTCGTC-3′。停止密码带下划线。人类FCP1表达质粒[hFCP1a（443–842）]编码插入到巴姆pRSETC（Invitrogen）的HI站点及其隔离和构造将在其他地方介绍。产生蛋白质在体外如下所述。编码酵母RAP74（TFG1）与谷胱甘肽融合的C-末端87氨基酸的质粒pJA728S公司-转移酶（GST）通过插入Bgl公司II-cut TFG1 PCR片段（使用引物从酵母基因组DNA中扩增：5′-CCCAGATCTCG全球合作协议TCGAATACAGTCC TTCGCC-3′和5′-CCCAGATCTCTA公司CTCTTTCTTTAATTCCATGTGTC-3′；编码Ala-649的密码子和终止密码子下划线）巴姆pGEX-3X的HI位点（法玛西亚）。编码与GST融合的人类RAP74的C末端82个氨基酸的质粒pJA8将在其他地方描述。
蛋白质亲和色谱法。
制备含有GST、GST-yRAP74（649–735）或GST-hRAP74的色谱柱（40μl），固定在浓度为3–4 mg/ml的谷胱甘肽-脑葡萄糖上(25)使用固定化蛋白质大肠杆菌用pGEX-3X、pJA728或pJA8转化。用300μl含有0.1 M NaC1和5 mg/ml BSA的ACB缓冲液（10 mM Hepes，pH 7.9/1 mM EDTA/1 mM DTT/10%甘油）平衡色谱柱，然后用400μl含有0.1M NaC1及1 mg/ml BSA的ACB缓冲器平衡色谱柱。用20μl来自TNT转录翻译系统（Promega）的兔网织红细胞裂解物装载色谱柱在网织红细胞裂解液用含有0.1 M NaC1和1 mg/ml BSA的ACB缓冲液稀释10倍后，用0.4μg各种质粒DNAs[T7-HA-yFcp1、pJA785、pJA801、TR-yFcp1（458-732）、TR-y FCP1、TR-yFcp1或hFCP1a（443-842）]编程，用400μl含有0.1M NaC1的ACB缓冲液洗涤柱。用120μl含有1 M NaC1的ACB和120μl含1%SDS的ACB缓冲液依次洗脱结合蛋白。通过SDS/PAGE和放射自显影术分析输入蛋白、NaC1和SDS洗脱液的等分样品。
酵母的破坏飞行控制面板1基因。
质粒JA744用于破坏内源性飞行控制面板1基因分两步构建。在第一步中Bgl公司II切割PCR片段，与紧邻上游的基因组区域相对应FCP1（飞行控制程序1）ORF（使用以下两种寡核苷酸从酵母基因组DNA中扩增：5′-CCCAGATCTGTCCCATGTTTAGACAGATGCTCACC公司-3′和5′-CC CAGATCTAATCTGCTTTGCGTGTTTACGCTTC公司-3′; 每个寡核苷酸的与基因组DNA杂交的部分加下划线）在LEU2基因上游插入巴姆质粒JJ250的HI位点(26). 随后通过插入Hin公司dIII切割PCR片段，与位于下游的序列相对应FCP1（飞行控制程序1）ORF（使用以下两个寡核苷酸引物从酵母基因组DNA扩增而来：5′-CCCAAGCTTCAGCTCAGATGCCGTATCTTCCACA公司-3′和5′-CCCCAAGCTTGAGCTCCTTAGAATGAATCTATGTGT公司-3′）LEU2基因下游进入Hin公司dIII站点。由此产生的质粒pJA744携带了飞行控制面板1基因组位点，其中飞行控制面板1ORF被LEU2基因取代。这种干扰的等位基因飞行控制面板1通过消化从质粒骨架中释放Sma公司我和囊我曾经中断过FCP1（飞行控制程序1）二倍体酵母菌株W303的等位基因(垫子一/垫子α罐1–100/can1–100 his3–11,15/他的3–11，15 leu2–3112/列2–3112 trp1–1/trp1–1个ura3/ura3 ade2–1/ade2–1)使用一步基因阻断方案(27). PCR证实了干扰（数据未显示），产生JA830菌株。
间接免疫荧光。
准备细胞进行免疫荧光(28,29)稍作修改。固定细胞和清洗细胞在室温下用1:20稀释的预吸收液培养2小时(30)MMS101R单克隆抗HA抗血清（加利福尼亚州里士满Babco；由康涅狄格州纽黑文耶鲁大学Kevin Madden提供）。洗涤后，预吸收(30)应用二级抗体（来自Jackson ImmunoResearch的CY3-结合山羊抗鼠抗体，1:40稀释，由Kevin Madden提供）。洗涤后，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚对细胞进行染色并进行显微镜观察。
结果
酵母CTD磷酸酶的一种必需成分的鉴定。
从提取物中纯化CTD磷酸酶酿酒酵母导致对磷酸酶活性至关重要的两种组分的分离(19). 其中一个组分含有酵母TFIIF，但不能用高纯度TFIIF代替。当另一个基本成分纯化到均匀时，SDS/PAGE过程中表观分子量为100/103 kDa的多肽与活性共纯化（见图。A类，车道3）。将该多肽从凝胶中切除，然后去除SDS并复性，使CTD磷酸酶活性与含TFIIF的组分一起恢复（参考文献。19; 参见图。B，车道3）。如报告所述，在这种磷酸酶分析中，这种酶专门去除CTD中的磷酸盐32RPII最大亚单位的P-标记IIo形式，将其转化为去磷酸化IIA形式(19).
重组酵母Fcp1重组CTD磷酸酶活性。(A类)从酵母全细胞提取物中纯化的酵母Fcp1[yFCP1，分数62，MonoQ分数(19)]和重组Fcp1（ryFCP1）大肠杆菌用SDS/7.5%聚丙烯酰胺凝胶进行分离，并用考马斯蓝染色。箭头表示ryFcp1的位置，其中包含21个额外的氨基酸：六个组氨酸和一个HA标记。(B)检测yFcp1和ryFcp1的CTD磷酸酶活性。化验(19)措施删除32来自RPII最大亚单位的P。泳道1，来自酵母RPII最大亚基磷酸化形式的放射自显影信号。通道2和通道3，分别用复性重组（≈0.2μg）或纯化酵母（≈0.02μg）Fcp1处理后剩余信号；这些数量的蛋白质在化验中饱和了。
从SDS凝胶中提取的100/103-kDa多肽用蛋白酶lysC消化，所得多肽在Applied Biosystems C8 Aquipore-300柱上通过HPLC进行解析。获得了三个分辨率良好的肽的部分氨基酸序列。所有三个序列（KFWYLVERASDTGDD，氨基酸38–52；KEFFA，氨基酸254–258；KLXXXLATAXE，氨基酸405–415）均存在于酿酒酵母.该酵母基因在大肠杆菌与预期一样，N末端融合的流感病毒HA表位和多组氨酸标签导致重组蛋白的产生，其流动性仅略低于SDS/聚丙烯酰胺凝胶上的天然蛋白（图。A类，通道2，3），并能够在功能上替代酵母CTD磷酸酶活性所需的第二组分（图。B，车道1、2）。
这种新型酵母蛋白在其大部分长度上的氨基酸序列相似（32%的同源性和54%的相似性），与根据其与人类TFIIF的相互作用而克隆的人类蛋白相似（J.a.、H.Xiao、G.Pan、G.Dahmus、M.C.、S.Zhang、R.G.Roeder、M.Dahmas和J.G.，未发表的工作）。酵母蛋白也与TFIIF相关，如下所述。因此，这种新的酵母蛋白被命名为TFII的Fcp1F类-的关联组件C类技术总监第页磷酸酶。这种磷酸酶具有需要二价阳离子的2C型活性，并且对冈田酸和钒酸盐具有抗性(19). 然而，酵母和人Fcp1的氨基酸序列（图。A类)不类似于PP2C家族内外的任何已知磷酸酶。Fcp1也与另一种参与转录控制的磷酸酶Sit4无关(31). 因此，Fcp1本身就是磷酸酶，或者它激活了活性所需的其他部分中的CTD磷酸酶。奇怪的是，Fcp1蛋白含有BRCT基序，该基序存在于许多参与DNA修复的蛋白质中(32)（图。B).
酵母和人类Fcp1的三个区域表现出最高程度的相似性：N末端区域（36%同一性）对应于酵母Fcp1 124–352氨基酸，中间区域（32%同一）对应于酵母菌Fcp1 425–593氨基酸，C末端区域（25%同一性。B). 通过酵母或人类蛋白质中缺失的长序列分离这些区域，表明每个区域都可能是一个功能域。C末端保守区包含TFIIF的至少一个结合位点，中央保守区包含第二个TFIIF结合位点的全部或部分（见下文）。N端保守区没有已知的功能，但大部分包含与9个物种中其他15个功能未知的ORF序列相关的短序列基序（见图。C类).
Fcp1定位于酿酒酵母表达HA-taggedFCP1型来自低拷贝数质粒的基因。抗HA单克隆抗体的免疫荧光显示HA-Fcp1(左上，图。)与DNA共定位（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色左下方，图。)因此，它是一种酵母核蛋白。
Fcp1定位于细胞核。来自菌株JA830（fcp1ΔLEU2 pHAfcp1）异步培养的细胞，该菌株含有pJA794，从飞行控制面板1启动子和W303（无HA标签）被固定并用抗HA单克隆抗体染色。在非HA的W303中检测到弥漫性背景染色（“无标记”）；为了检测背景荧光，这个框架故意曝光过度。4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色显示HA-Fcp1特异性染色与细胞核共定位（HA｜Fcp1面板）。将4′，6-二氨基-2-苯基吲哚和抗-HA图像叠加到染色细胞的Nomarski图像上。
酵母Fcp1与RAP74的酵母同源物Tfg1相互作用。
酵母TFIIF刺激酵母磷酸酶活性(19)人TFIIF刺激人磷酸酶的活性(18). 为了测试酵母Fcp1和人类FCP1a是否可能具有类似的功能，检查了酵母Fcp 1与酵母TFIIF亚基Tfg1（33，酵母RAP74）的结合（图。A类).35含有全部或不同部分酵母Fcp1的S标记蛋白质通过翻译制备在体外并应用于含有酵母RAP74的C-末端氨基酸649–735的微亲和性柱(33)与GST融合。
Fcp1和RAP74之间的结合。(A类)各种35如图所示，在兔网织红细胞裂解物（输入）中合成酵母Fcp1和人FCP1a的S标记部分，应用于GST和GST-yRAP74（649-735）微亲和性色谱柱，并按照材料和方法。凝胶上加载的体积相当于输入量的5%和每个洗脱液的25%。仅包含全长的每个自动射线图的区域在体外显示了合成产物。(B)各种35如图所示，在GST和GST-hRAP74（436–517）微柱上对酵母Fcp1和人FCP1a的S标记部分进行色谱分析。按照所述对色谱柱和洗脱液进行分析A类.
事实上，酵母Fcp1结合到酵母RAP74的C末端区域，部分用盐洗脱，部分用SDS洗脱（图。A类，第1行）。此外，Fcp1的C端氨基酸667–732在体外作为与TR的融合蛋白，足以进行这种相互作用（图。A类，比较第5行和第7行）。然而，酵母Fcp1的氨基酸1–666仍然结合RAP74，而氨基酸1–457不能（图。A类，第2、3行），这意味着在酵母Fcp1的氨基酸458–666中存在第二个RAP74结合位点。当Fcp1的这个区域产生时在体外作为与TR的融合蛋白，它也足以结合RAP74（图。A类，第6行）。因此，酵母Fcp1有两个RAP74结合区（图。B). 该中心区域与RAP74之间的结合比涉及Fcp1 C末端区域的相互作用弱一些，对盐更敏感（图。和数据未显示）。
TFIIF刺激CTD磷酸酶的能力具有物种特异性(19). 然而，酵母Fcp1可以与人类RAP74的C端83个氨基酸结合（图。B，第1行），这种相互作用取决于酵母Fcp1的RAP74结合区域（图。B，第2行）。人FCP1a也能与酵母RAP74的C末端87氨基酸结合（图。A类，第8行）。因此，Fcp1-RAP74相互作用可能涉及酵母和人类蛋白质之间保守的氨基酸。
这个飞行控制面板1基因对酿酒酵母.
带有去磷酸化CTD的RPII在许多启动子上有效启动转录在体外(2,三). 因此，在转录终止之前或之后CTD的去磷酸化可能对基因表达至关重要体内.测试是否飞行控制面板1是必需的，该基因被LEU2插入其中一个FCP1型基因座。PCR证实了干扰（数据未显示）。减数分裂和孢子形成后，子囊的解剖揭示了一个基本基因所特有的活孢子和不活孢子的2:2分离模式（图。A类). 不可存活的孢子产生了32–64个细胞的微菌落，这表明野生型细胞中可能存在过量的Fcp1蛋白。正如所料，活孢子是吕2−（未显示数据）。可行LEU2级+当破坏的二倍体菌株被转化为表达飞行控制面板1在GAL10启动子的控制下，在含有半乳糖的培养基中生长（图。B). 因此，FCP1（飞行控制程序1）是一个必需基因，RPII CTD的去磷酸化可能是酿酒酵母然而，由于FCP1型只是CTD磷酸酶的一种成分，其本质可能是由于其调节一种额外底物的磷酸化体内.
酵母FCP1型至关重要。(A类)二倍体菌株JA830因一份飞行控制面板1诱导孢子形成，并对每个四分体的所有孢子进行生长测试。(B)用pJA754转化二倍体JA830，从GAL10启动子产生HA标记的Fcp1。诱导孢子形成，并测试孢子在含有半乳糖的培养基上的生长情况。(C类)对Fcp1的缺失结构进行了测试，以确定其对被破坏的菌株的互补性体内FCP1和磷酸酶活性在体外.指出了RAP74相互作用区域的每个结构和位置中的氨基酸。低拷贝是指细胞杂合FCP1（飞行控制程序1）用含有飞行控制面板1在内源性启动子（pJA794、pDB3、pJA796、pDB4和pJA804）的控制下；对细胞进行孢子化，并在选择性培养基上测试单倍体的生长。高拷贝是指细胞杂合飞行控制面板1用含有飞行控制面板1在GAL10启动子（pJA739、pJA756和pJA798）的控制下；在含有半乳糖的培养基上对细胞进行孢子化和单倍体生长测试。（+）是指生存能力的互补。这个在体外反应(19)Fcp1蛋白在大肠杆菌并按中所述进行净化实验程序; （+）表示检测到磷酸酶活性。nd，尚未完成。
缺失RAP74结合区的Fcp1截短仍有功能。
什么时候？飞行控制面板1由其自身的启动子在一个低拷贝数质粒上表达，存活率被全长挽救飞行控制面板1和删除[FCP1（飞行控制程序1）（1-666）和飞行控制面板1（1–626）]缺乏C末端RAP74结合位点（图。C类). 然而，缺失RAP74结合位点的缺失[飞行控制面板1（1-457）]即使在高拷贝表达时也不能挽救生存能力（图。C类). 两者都有飞行控制面板1（1-666）和飞行控制面板1（1–626）也起作用在体外去磷酸化CTD（见图。C类). 因为在体外重组Fcp1的分析在变性和复性后恢复，不可能进行准确的比较活性测定。然而，细胞飞行控制面板1（1–626）而不是野生型FCP1（飞行控制程序1）虽然可行，但对低温敏感（数据未显示）。因此，这种截断功能可能不太好体内与野生型Fcp1相比。蛋白质编码飞行控制面板1（1–457）不溶，因此未经测试在体外用于活动。
讨论
一种酵母核蛋白Fcp1已被鉴定为CTD磷酸酶活性所必需。这种磷酸酶的重要性体内通过发现FCP1型是一种必需的基因。目前尚不清楚Fcp1是一种磷酸酶还是该酶的重要调节成分。Fcp1没有已知的磷酸酶基序，但磷酸酶是一组不同的蛋白质，几乎没有共同的一级序列基序(34). 因此，酵母Fcp1残基173–357之间的短而保守的氨基酸序列（见图。)这可能是一个新的蛋白磷酸酶家族的特征，因为在人类Fcp1和其他15种预测的来自许多生物体的功能未知的蛋白质中发现了类似的序列。或者，这些短而保守的基序可以定义一个结构域，用于与特定磷酸酶或磷脂酶家族中的靶位点相互作用，该结构域尚待确定。如果是这样的话，那么Fcp1可能是一个信号分子，它将磷酸酶与RPII/TFIIF复合物偶联。
酵母Fcp1结合到RAP74的部分C末端进化保守结构域。此域的相邻部分绑定RPII(35)；也许RAP74稳定了Fcp1相对于聚合酶的位置，从而使其相关的磷酸酶能够去磷酸化CTD。磷酸酶活性在去除CTD中的磷酸基团时起作用(18,19)，但TFIIF本身并不是这种过程所必需的，至少对人类磷酸酶来说是这样(18). 因此，TFIIF对磷酸酶活性的刺激可能反映了磷酸酶和聚合酶之间稳定的结合作用。
RAP74和Fcp1之间的相互作用可能涉及酵母和人类蛋白质中保守的氨基酸，因为酵母Fcp1可以结合人类RAP74，而人类FCP1a可以结合酵母RAP74。然而，对酶活性的要求比简单的结合分析所表明的更复杂，因为酵母和人类磷酸酶都不能与来源于异源物种的RAP74或RPII一起发挥作用(19). 此外，酿酒酵母酵母不能存活FCP1（飞行控制程序1）替换为编码人类FCP1a的cDNA（J.a.，未发表数据）。
许多启动子招募的RPII具有去磷酸化的最大亚单位(2,三,7)因此，一个专门用于启动的RPII复合体(36–39)可能含有CTD磷酸酶。有充分证据表明，CTD磷酸化是从起始前向有效伸长过渡期间的一种重要调节修饰（参考文献中综述）。4和40). 许多转录激活物，包括HIV-1 Tat、单纯疱疹病毒VP16、人类p53和E2F1，可以结合TFIIH(8,9,41)其CDK7亚单位是RPII的CTD激酶（参考文献综述）。42和43). 此外，通过RPII刺激伸长的HIV-1 Tat蛋白(44,45)，也刺激这种激酶活性(11,46,47)TFIIH对CTD的磷酸化可能对RPII的伸长很重要体内(10,40). 第二个CTD激酶，P-TEFb，也需要用于HIV-Tat转录激活(48,49)这种激酶似乎也对生产性伸长至关重要(48,50).
此外，哺乳动物TFIIF的RAP74亚单位可以被TFIIH磷酸化(51)或TFIID的最大亚单位(52)磷酸化形式的TFIIF通过RPII刺激伸长在体外(53). 也许RAP74在RPII全酶背景下的磷酸化导致Fcp1解离，降低或消除伸长过程中的CTD磷酸酶活性。或者，RAP74的磷酸化可能只是抑制CTD磷酸酶活性。此外，TFIIB是CTD磷酸酶活性的抑制剂(18)并可防止CTD在从起始到延伸过程的过渡过程中脱磷酸化。通过RPII刺激伸长的活化剂，如Tat，可以通过刺激CTD激酶来实现(11,46,47)并抑制CTD磷酸酶，在启动子产生的伸长复合物中保持聚合酶的高度磷酸化形式。延伸复合物中聚合酶对磷酸酶作用的敏感性尚待测试，但调节聚合酶的磷酸化状态可能是沿着转录单元有效延伸的必要条件。
致谢
我们非常感谢Sharleen Zhou，她对纯化的Fcp1进行了蛋白质微测序。本研究得到了加拿大医学研究委员会（MA8556）和加拿大国家癌症研究所（006067）对J.G.的资助，以及国家科学基金会（DMB-920-5583）和美国癌症协会（NP-941至C.M.K.）的资助。J.A.获得了加拿大医学研究委员会的奖学金，M.K.获得了加拿大政府奖。
缩写
| 零售物价指数 | RNA聚合酶II |
| CTD公司 | RNA聚合酶II最大亚单位中重复七肽序列的C末端结构域 |
| TFIIF公司 | 转录因子IIF |
| 信托收据 | 硫氧还蛋白 |
| 哈 | 血凝素 |
| 消费税 | 谷胱甘肽S公司-转移酶 |
工具书类
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