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美国人类遗传学杂志。2008年8月8日；83(2): 170–179.
2008年8月1日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.ajhg.2008年6月23日
预防性维修识别码：PMC2495072型
PMID：18674751

Cilia基因突变ARL13B公司导致Joubert综合征的典型形式

文森特·坎塔格雷,1,17 詹妮弗·西尔哈维,1,17 斯蒂芬妮·比拉斯,1 多米尼克·斯威斯敦,1 莎拉·马什,1 朱利安·贝特朗,2 索菲·奥多伦特,三 塔妮娅·阿蒂埃-比塔赫,三 肯顿·R·霍尔顿,4,5 威廉·多宾斯,6 大卫·特拉弗,2 利哈德·阿尔·加扎利,7 巴萨姆·R·阿里,8 汤姆·H·林德纳,9 塔玛拉·卡斯帕里,10 埃德加·A·奥托,11 弗里德海姆·希尔德布兰特,11 伊恩·格拉斯,12 克莱尔·洛根,13 科林·约翰逊,13 克里斯托弗·贝内特,14 弗朗西斯科·布兰卡蒂,15国际Joubert综合征相关疾病（JSRD）研究小组，18 恩扎·玛丽亚·瓦伦特,15 C.杰弗里·伍兹,16和约瑟夫·格里森1,∗
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

Joubert综合征（JS）和相关疾病是一组常染色体隐性遗传疾病，与轴位脑MRI上的“臼齿征”相同，同时伴有小脑蚓部发育不全、共济失调和精神运动迟缓。JS被认为是一种纤毛功能紊乱，是视网膜、肾脏、手指、口腔、肝脏和大脑器官疾病谱的一部分。我们发现了ARL13B公司在两个家族中使用经典形式的JS。ARL13B公司属于Ras GTPase家族，在其他物种中是纤毛发生、体轴形成和肾功能所必需的。编码的Arl13b蛋白在发育中的小鼠小脑中表达，并定位于初级神经元的纤毛。人类野生型但非患者突变型的过度表达ARL13B公司救出了Arl13b蝎子斑马鱼突变体。因此，ARL13B型在多个器官中具有介导纤毛功能的进化保守作用。

介绍

Joubert综合征（JS[MIM213300])其特征是先天性小脑共济失调、张力减退、动眼神经失用症和精神发育迟滞。它是最常见的遗传性小脑畸形综合征，是常染色体隐性小脑共济失调组疾病的一部分。1JS的神经放射学特征是一种称为“臼齿征”（MTS）的中脑-中脑交界处的特殊畸形，包括小脑蚓部发育不全或发育不全、小脑上脚粗大且水平向，以及异常深的趾间窝。2MTS随后在一组称为Joubert综合征和相关疾病（JSRD）的综合征中被报道。其中包括（1）经典JS（MIM213300)（2）JS加Leber先天性黑蒙（LCA，即先天性视网膜盲[MIM204000]),三（3） JS合并肾结石（NPHP[MIM256700])（4）JS加LCA加NPHP（也称为小脑-眼-肾综合征608091)]),4（5） 小脑蚓部发育不全、少肾、先天性共济失调、眼球缺损、肝纤维化（COACH[MIM216360])综合征，5和（6）口腔-面部-手指综合征VI型6,7（MIM277170)其他特征如脑膨出和多指畸形在每个亚组中都有不同的表现。许多这些疾病之前都与编码纤毛放大蛋白的基因有关，因此JSRD被认为是一种候选纤毛疾病。最近发现JSRD可能是由于CEP290公司8,9（编码一个已知的中心体/纤毛蛋白），以及NPHP1型10,11（之前与NPHP睫状体病有关），固定夹1L12–14（编码与纤毛病视网膜色素变性相关的蛋白质的结合伙伴），以及TMEM67型（又名。MKS3公司)15（先前与梅克尔综合征睫状体病有关）进一步强化了JSRD是由睫状体功能缺陷所致的假设。

在这里，我们报告了JBTS8基因座的鉴定和ARL13B公司基因，编码ADP-核糖基化因子样蛋白13B。ARL13B是一种小GTPase，属于参与多种细胞功能的小GTPases Ras超家族中的Arf/Arl家族。ARL13B公司因此，它是第一个编码与JS相关的酶活性蛋白的基因，这表明它的研究可能有助于阐明重要的信号通路。此外Arl13b公司最近发现，零突变是致命的海宁在斑马鱼身上发现了表现出类似音速刺猬表型的小鼠突变体蝎子显示肾囊肿和弯曲尾巴的突变体，两者都与纤毛功能受损有关。识别ARL13B公司JS患者的突变，以及之前在小鼠和斑马鱼中的研究，表明了跨物种的极其广泛的表型，所有这些都与纤毛功能缺陷有关。该结果还表明纤毛介导的声波刺猬信号在小脑发育和人类JS发病机制中的作用。

材料和方法

基因组定位

MTI-001家族是根据利兹大学和加州大学圣地亚哥分校批准的人体研究方案招募的。通过盐提取法从外周血白细胞中提取DNA，并使用Illumina Linkage IVb绘图面板进行基因分型，16并使用easyLINKAGE-Plus进行分析17该软件在PC Windows界面中运行Allegro 1.2c版，以计算多点LOD分数。参数设置为全外显率常染色体隐性遗传，疾病等位基因频率为0.001。LOD得分超过2的基因组区域被视为候选区间。用Allegro 1.2c在相同参数下进行连锁模拟，500个标记的平均间隔为0.64 cM，共显性等位基因频率和参数计算。17其他受试者根据芝加哥大学、密歇根大学、利兹大学和巴黎内克尔医院批准的方案进行登记。对照样本来自一项高血压研究的健康美国成年人受试者、来自阿拉伯联合酋长国的健康阿拉伯对照组和来自利兹的健康巴基斯坦对照组，英国。

突变筛选

我们对10个编码外显子和剪接连接位点进行了直接双向测序ARL13B公司通过BigDye Terminator循环测序（Applied Biosystems）。我们筛选了124名确诊为有或无Joubert综合征特征的肾病患者（由美国密歇根州Friedhem Hildebrandt提供）和32名确诊为梅克尔综合征的患者（由法国内克尔医院Tania Attie-Bitach提供）通过双向排序。我们通过LightScanner检测（爱达荷州技术公司）筛选了44名确诊为Meckel综合征的患者，这些患者有或没有Joubert综合征的特征（由Colin Johnson提供，U.Leeds），随后对异常带进行双向测序。根据批准的人类受试者方案确定并管理所有患者样本。

候选基因和GenBank接入数

人类ARL6号机组有两个GenBank编号（NM_032146.1和NM_177976.3)编码相同的蛋白质，但第一个编码较长的转录物。人类ARL13B公司有两个GenBank编号（NM_144996.1和NM_144996.2），不同之处在于第二个条目缺少编码外显子2–3。斑马鱼13B年具有GenBank编号NM_173272.鼠标爱尔13bGenBank编号为NM_026577.2。

生物信息学

以结晶的ARL2-GTP为模板，用瑞士模型预测了预测的折叠和分子间相互作用。通过导入野生型和突变体的氨基酸序列并比较预测的氢键，用PyMOL软件操纵和呈现得到的ARL13B结构。

GTP结合分析

人类野生型和突变型ARL13B公司cDNA分别克隆到pGEX 6P1载体（GE Lifesciences）中，并根据制造商的建议分离GST标记的纯化蛋白。蛋白质从可溶相中提取，通过SDS-PAGE分析和考马斯染色验证完整性，并通过圆二色性分析验证野生型和突变蛋白具有类似的二级结构。如前所述，使用基于过滤器的分析进行GTP结合，18以变性（煮沸15分钟）Arl13b蛋白为阴性对照，Rac为阳性对照，用SigmaPlot Ver 10.0进行分析，用单因素方差分析进行统计分析。

斑马鱼特征

这个阿尔贝13b上海合作组织/+根据加州大学圣地亚哥分校（UCSD）批准的动物实验方案，从斑马鱼国际资源中心（ZIRC）获得了该线。单细胞胚胎阿尔贝13b上海合作组织/+将50 pg体外转录的人类野生型或突变转录物的带帽开放阅读框RNA（Ambion Message Kit）注射到交配物中。72小时后，研究人员对胚胎进行表型分析，但不知道基因型，然后对所有胚胎进行基因分型以进行相关性分析。

组织学

用4%多聚甲醛固定小鼠组织，然后处理15μm冷冻切片，并按所述进行免疫染色。19我们使用了两种不同的兔抗Arl13b多克隆抗体，一种是最近针对细菌表达的GST融合到小鼠Arl13b的208–428氨基酸而创建的，19另一种是针对一种表现类似的内部多肽创建的，因此只有第一种用于进一步的实验。两种抗体均未与纤毛发生反应海宁突变体19（未显示数据）。抗体使用浓度如下：Arl13b，1:2000；乙酰化微管蛋白（Zymed 32-2700），1:500；钙结合蛋白（Swant），1:600。按照所述的细胞密度梯度分离小脑颗粒神经元，20,21固定，并在电镀后的不同时间点进行免疫染色。

结果

3号染色体着丝粒区JBTS8位点的鉴定

在我们的系列中，我们排除了27个近亲JSRD家族中已知基因座的连锁，支持进一步的遗传异质性证据。最大的家族之一（MTI-001，图1A） 来自巴基斯坦，是本研究中第一个招募的人，在脑成像方面显示了一种经证实的MTS(表S1提供了最大预期LOD分数3.0，并且没有显示任何已知JSRD基因的突变(NPHP1、AHI1、CEP290、MKS3、RPGRIP1L). 我们通过Illumina Whole genome SNP Linkage IVb小组进行了0.64 cM分辨率的全基因组筛查，确定了染色体3p12.3-q12.3的区间为107–112 cM（80.0–103.3 MB），多点LOD评分峰值为3.0，称为JBTS8(图1B） ●●●●。

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映射JSRD家族MTI-001确定了包含ARL13B公司基因，其突变产生改变的GTP结合

（A） MTI-001由两个兄弟分别结过两次婚（第二代，双哈希指离婚）的双表亲婚姻组成；其中一人有两个同父异母的兄弟，另一人有二个同母异父的姐妹，随后他们各自娶了自己的堂兄弟（第三代）。这两对夫妇各自生育了一个受影响的后代（在第四代中填写了符号）以及健康的兄弟姐妹。分支1的一名受影响女孩死于相关的医疗并发症（单条散列线）。

（B） 染色体位置连锁结果的全基因组分析(x个轴）和多点LOD得分(年轴）在chr上显示显著的LOD得分（>3）。3.没有其他峰值达到显著性阈值。

（C） 候选区间的扩展视图显示，连锁信号由一个主峰组成，该主峰由rs1005343和rs938988 SNP标记（红色）的重组所定义，从而定义了107到112 cM的最小候选区间。

（D） chr上候选间隔的展开视图。3p12.3-q12.3，包含着丝粒，包含41个候选基因，包括ARL6号机组和ARL13B公司（红色）。箭头指示的转录方向。基因组结构ARL13B公司由10个编码外显子组成，延伸约70KB的基因组序列。

（E） 野生型ARL13B的同源性建模显示R（绿色）残基和预测氢键（红色虚线）与参与GTP结合的D（蓝色）残基。

（F） p.R79Q突变是一种基本的极性到中性极性替换（红色），预计会破坏这种氢键（红色箭头指示的虚线缺失）。

（G） 通过重组野生型ARL13B（绿色）或p.R79Q突变体（红色）进行GTP结合分析，显示动力学和结合能力发生改变。实验一式三份。误差条代表SEM。阴性对照为变性野生型ARL13B（黑色）。在500、1000和2000 nM GTP浓度下观察到野生型和突变型之间的统计差异(∗p<0.05，单因素方差分析）。

MTI-001患者在ARL13B公司基因

该区间包括着丝粒，共有41个基因，标记rs1905343和rs938988分别形成了p和q-arm断点(图1C） ●●●●。纤毛蛋白质组数据库中列出了该区间内的四个基因，22,23根据最初的工作，确定这些蛋白质定位于纤毛或预测其功能，24–30包括CEP97公司,MINA公司,ARL6号机组、和ARL13B公司，因此被认为是强有力的候选人(图1D） ●●●●。其中，只有ARL6号机组（ADP核糖基化因子样6）与一种人类疾病有关，其中突变是Bardet-Biedl综合征3（BBS3）的原因。31, 32因为主要的错义突变是在ARL6号机组由于JSRD是一种比BBS更严重的表型疾病，我们认为MTI-001中可能存在更严重的突变（如终止密码子或剪接位点突变）。因此ARL6号机组在该家族的受影响动物中进行了测序，但没有遇到序列变化。这个ARL13B公司基因（也称为ARL2L1系列，或Y37E3.5型在里面秀丽线虫)以前曾被证明在纤毛神经元中表达，并被特别发现定位于纤毛轴丝秀丽线虫感觉神经元，25,31所以我们认为这是下一个最可能的候选基因。序列分析确定了外显子3中的纯合c.G236A突变，预测该突变将导致p.R79Q（正电荷到非电荷）氨基酸替换(图S1). 288名个体（96名巴基斯坦血统、96名阿拉伯血统和96名美国混合血统）中未发现该突变，提供了>80%的能力将其与正常序列变体区分开来，33这表明它并不代表一个常见的等位基因。MTI-001所有成员的基因分型表明，这种纯合子突变与受影响者的表型分离，但在未受影响者或专性携带者中没有分离。

与R79Q突变相关的GTP结合受损

在MTI-001家族中发现的p.R79Q突变发生在高度保守的GTP-结合域内。34,35因此，我们质疑这种突变是否会影响GTP结合。由于ARL13B与ARL2在氨基酸序列上有36%的相同性和61%的相似性，我们使用ARL2的晶体结构来模拟p.R79Q突变对分子内作用力的影响。该模型表明，开关II结构域的R79（ARL2中的R74）与P环结构域的D30（ARL2中的D25）建立了氢键。这种相互作用在其他ARF家族蛋白中是保守的36由于p.R79Q取代，预计会因氨基酸电荷的改变而被破坏(图1E和1F），因此可能会中断GTP绑定。为了验证这一假设，我们将野生型和p.R79Q ARL13B人cDNA克隆到细菌表达载体中(图S2)，分离的重组蛋白(图S3)，根据它们与液相的分离，验证了它们都是可溶的，并且根据相似的圆二色性分析，它们具有相似的二级结构37（未显示），然后在建立的体外结合试验中测试其结合GTP的能力。我们发现ARL13B结合GTP的半最大浓度为～7.2×10−7M.在该浓度下，与突变蛋白结合的GTP量约为与野生型蛋白结合量的一半（三个比较中的每一个都p<0.05），而阴性对照刚好高于背景值(图1G） ●●●●。我们得出结论，p.R79Q突变干扰ARL13B的GTPase结合活性，这种突变可能导致其纤毛功能受损。

JS队列中的突变分析

我们检测了ARL13B型在JSRD的几个队列中。通过双向测序，我们从队列中筛选出182名JSRD患者，并在一个家系中鉴定出两个额外的突变。MTI-423家族中有一名女性患者在脑部成像中表现出经证实的MTS(图S4). 受影响的女性表现出一种复合杂合突变c.G246A（外显子3），该突变源于母亲的一个终止密码子p.W82X和父亲的一个c.C598T（外显字5），导致线圈结构域内带正电荷的未带电氨基酸p.R200C错义突变(图2A；图S1). 该家族没有发现任何已知JSRD基因的突变(NPHP1型,空气处理接口1,CEP290公司,TMEM67型,固定夹1L). 每一个ARL13B公司替代突变在所有哺乳动物的进化过程中都是完全保守的热带非洲爪蟾,达尼奥·雷里奥、和黑脊四齿龙(图2B） 在182名健康个体（364条染色体）的队列中，通过基因组DNA的直接双向测序，没有发现这些突变或任何其他预测的功能变化。早期的致命性海宁老鼠对ARL13B公司在早期胚胎发育中，可能提供了一个解释ARL13B公司JSRD队列中的突变和ARL13B公司患者。

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人类ARL13B基因在保守残基中的突变及其对进化保守功能的干扰

（A） ARL13B蛋白的结构域，具有GTP结合、线圈和富含脯氨酸的结构域。红色表示GTP结合相关的保守区域。顶部显示突变。

（B） ARL13B的进化保守性，表明每个突变残基至少保守性为达尼奥·雷里奥（斑马鱼）。

（C–F）野生型斑马鱼尾巴笔直，没有囊性肾脏。未注入阿尔贝13b上海合作组织/上海合作组织胚胎有弯曲的尾巴（红色箭头）和囊性肾脏（红色双箭头）。这个阿尔贝13b上海合作组织/上海合作组织注射人类野生型胚胎ARL13B公司RNA显示弯曲的尾巴得到了挽救，囊性肾脏缺失。人类p.R79Q和p.R200C突变体ARL13B型在大多数胚胎中，RNA未能挽救任何一种表型，尽管约15%-24%的胚胎显示出挽救表型的证据，表明存在低形态等位基因。中的控制氨基酸替代（p.S371I）ARL13B公司显示出类似于野生型的救援效果（未显示）。

ARL13B突变相关表型谱的描述

在已确定突变的患者中观察到的表型主要是典型的Joubert综合征。所有患者均显示MTS(表S1). 在MTI-001中，两名受影响者各显示一个小的枕部脑膨出。在另一个家族中，没有枕部脑膨出，也没有其他幕上脑异常，诊断性超声检查也没有肾脏异常（对两个家族都进行了检查）。尿浓度缺陷的研究可能是早期肾脏受累的一种更敏感的测量方法，但在这些患者中没有任何一例进行过研究，因此可能在未来出现肾脏症状。一名患有MTI-001的患者（现已死亡）在临床检查中显示出轻度非特异性色素性视网膜病变的迹象，尽管受影响的兄弟姐妹的视网膜电图正常，但受影响的儿童的视网膜电图也正常ARL13B公司视网膜功能尚不清楚。我们还筛选了124例JS伴肾结节患者和76例具有JS特征的重叠梅克尔综合征患者。在这两个队列中均未发现突变，这表明ARL13B公司仅限于典型的JSRD（包括脑膨出和视网膜病变）38并且在其他相关的睫状体疾病中无法识别，至少在这种检测水平上是如此。

人类野生型非突变ARL13B拯救斑马鱼蝎子突变体

为了测试ARL13B公司，我们利用斑马鱼(达尼奥·雷里奥). 人类和斑马鱼的比较ARL13B公司在90%以上的预测氨基酸序列中显示75%的相似性和59%的一致性。我们利用了蝎子斑马鱼突变体阿尔贝13b轨迹。39这个阿尔贝13b上海合作组织等位基因是由于逆转录病毒插入第一个外显子导致基因失活，吗啉反义治疗阿尔贝13b制作了阿尔贝13b上海合作组织/上海合作组织突变体。40这些突变体显示出完全渗透弯曲尾部和囊性肾表型，这在受精后72小时（hpf）（n=75，图2C和2E）。我们测试了将RNA注射到1细胞期胚胎后表型的挽救arl13b型sco公司/+×阿尔贝13b上海合作组织/+交配，产生1/4阿尔贝13b上海合作组织/上海合作组织胚胎，通过研究人员在72 hpf下对鱼类进行表型分析，对基因型不知情。注射与斑马鱼对应的RNA阿尔贝13bcDNA完全拯救了表型，这一盲法基因分型方案没有发现突变体（n=20）就证明了这一点。人体注射ARL13B公司RNA同样拯救了大多数胚胎的表型(图2D和2F）。在这些突变体中，97%的胚胎挽救了曲尾表型，88%的胚胎拯救了囊性肾（n=31）。将任一RNA注射到野生型同胞胚胎中均未出现明显的过度表达表型。因此ARL13B公司基因在胚胎发生的遗传水平上表现出进化上的保守功能。

为了测试患者错义突变的功能损害，我们注射了与人类开放阅读框的cDNA相对应的RNAARL13B公司在类似的分析中，每个突变都被引入编码区。我们选择使用人类而不是斑马鱼cDNA进行这项工作，因为它代表了对人类突变功能的更严格测试。与野生型人类RNA或对照非致病性氨基酸替代RNA相比，注射这些突变RNA中的每一个都会显著减少拯救。对于这个对照，我们选择了p.S371I颠倒，因为S371是进化上保守的氨基酸（类似于R79和R200），它发生在蛋白质的一部分中，没有已知的二级结构，p.S371I的改变不会改变残基的电荷。弯曲尾部表型挽救了17%和24%，囊性肾表型挽救了17%和15%阿尔贝13b上海合作组织/上海合作组织p.R79Q和p.R200C突变的突变体（p.R79Qn=29，p.R200Cn=34，图2C–2F）。相反，对于p.S371I对照替代物，弯曲尾表型被挽救了100%，囊性肾表型被拯救了91%阿尔贝13b上海合作组织/上海合作组织突变体（p.S371I的n=11，未显示）。这些数据表明，具有这些人类致病性突变的人类RNA不能像野生型或控制突变的人类RNA那样发挥作用，并表明这些致病性突变至少部分损害了胚胎发生期间蛋白质的功能，导致JSRD表型。

Arl13b在JS受影响的器官中表达，蛋白定位于纤毛

接下来，我们测试了在假定的发病时间点参与JSRD患者的小鼠组织中Arl13b的表达，以确定该蛋白的表达是否可以解释人类表型。Arl13b蛋白定位于已知存在的所有器官的纤毛，包括发育中的小脑(图3). 肾远端集合管的上皮细胞有很好的纤毛，我们观察到这些小管内纤毛结构的Arl13b染色(图3A） ●●●●。这种染色可能预测Arl13b在肾功能中的作用，尽管我们的患者中没有一个患有ARL13B公司突变显示肾功能受损的证据。视网膜光感受器的内外段，对应于细胞体和含视紫红质的圆盘，由连接纤毛桥接。我们观察到P10处连接纤毛的Arl13b染色稳健(图3B） 类似于LCA中的许多蛋白质。41,42有趣的是，其中一名患者患有ARL13B公司视网膜病变的突变证据(表S1). 重要的是跟踪其余患者，以确定他们是否在未来发展为累及这些器官。

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Arl13b在肾脏、视网膜和发育中小脑颗粒神经元纤毛中的定位

方框区域表示（A）和（B）中第三个面板所示的高功率场的位置。

（A） 肾小管显示Arl13b阳性纤毛伸入管腔（箭头），接近上皮细胞核（蓝色，DAPI）。

（B） 视网膜与光感受器连接的纤毛层显示出强烈的Arl13b染色（CC，箭头）。

（C） Arl13b染色EGFP-Centrin 2转基因小鼠P0小脑外颗粒层（EGL）。EGFP标记的中心粒（绿色圆点，箭头，左）在许多细胞中很明显，确定了基底体的位置。Arl13b阳性纤毛在许多细胞的基底体附近突出（箭头所示，右侧）。

（D） 急性分离的CGN显示纤毛（箭头），乙酰化微管蛋白（绿色）染色，Arl13b（红色）染色。乙酰化微管蛋白也能染色微管细胞骨架（箭头），Arl13b为阴性。

缩写：Co，cortex；os，髓质外条纹；即髓质内条纹；OM，外髓质；IM，髓内；GCL，神经节细胞层；IPL，内丛状层；INL，内核层；OPL，外丛状层；ONL，外核层；CC，连接纤毛；OS，外段；P、 产后一天。比例尺表示（A）–（C）中的20μm和（D）中的5μm。

为了测试发育中的小脑（JSRD的主要参与部位）的表达，我们检测了出生后小鼠的Arl13b定位。在P0时间点，小脑叶发育良好，由三个明确的层组成：外颗粒层（EGL）、浦肯野细胞层（PCL）和内颗粒层（IGL）。颗粒神经元前体在EGL内增殖并平行于小脑表面迁移。有丝分裂后颗粒神经元放射状迁移至小脑实质并通过PCL定居于IGL。我们检测到EGL和IGL颗粒神经元上的纤毛样结构呈强染色(图3C） 这与之前小脑的连续电镜切片一致，43,44以及最近使用腺苷酸环化酶III染色来标记纤毛的研究。45,46小鼠小脑发育过程中Arl13b的染色显示颗粒神经元群中的纤毛样结构，包括EGL和IGL(图S5). 小脑发育过程中纤毛样结构的染色具有时间依赖性，约40%的细胞在E16处显示出免疫阳性纤毛，P21时下降到不足1%的细胞。

为了确定这些ARL13B-免疫阳性结构代表纤毛，我们从一只表达EGFP的转基因小鼠的P0小脑中获取了切片，该转基因小鼠融合到了Centrin 2，Centrin是一种定位于中心粒的构成中心体/基底体标记物。47正如预期的那样，我们发现EGL中的大多数细胞包含一对容易识别的中心粒，靠近细胞核，代表基底体。我们在这些细胞中发现了一个免疫阳性的ARL13B结构，它发源于基底体周围的区域(图3C） 从而证明了两个结构之间的空间关系，并表明ARL13B标记纤毛。然而，在许多细胞中，在一对中心粒附近没有发现ARL13B，这表明ARL13B可能只在一小部分颗粒神经元中染色纤毛，或者只有一小部分的颗粒神经元含有纤毛。

为了区分这些可能性，我们使用细胞密度梯度从P5小鼠中分离小脑颗粒神经元前体，在不同时间点进行培养和固定。我们发现，这些原代培养的神经元中有一部分显示出纤毛，这可以通过标记一个突出于细胞体的结构来证明，该结构对乙酰化微管蛋白呈阳性反应(图3D） ●●●●。虽然纤毛中乙酰化微管蛋白染色呈强阳性，但它延伸到细胞体内的许多微管。基于这种染色的所有有纤毛的细胞也显示Arl13b免疫阳性，Arl13b染色主要局限于纤毛。因此，Arl13b似乎是许多细胞（包括发育中的小脑）纤毛的敏感和特异标记物。数据也支持Arl13b在JSRD发病机制中的作用，因此JSRD与其他人类纤毛病有着密切联系。

讨论

ARL13B公司编码ADP-核糖基化因子样蛋白13B（以前称为ADP-核苷酸基化因子类蛋白2-like 1），属于小Ras GTPase超家族。ADP-核糖基化因子（ARF）GTP-结合蛋白是GTPases Ras超家族中最具特征的成员之一，在膜转运途径中具有公认的作用。然而，ARL蛋白似乎具有不同的功能，许多在微管功能中起作用。48,49基因突变Arl13b公司最近被确定为鼠类的病因海宁胚胎发生期间显示神经管受损的表型。19编码的Arl13b蛋白定位于初级纤毛，在那里它可能与其他Arl蛋白的作用类似，在微管组装或运输中发挥作用。然而Arl13b公司hnn/hnn由于严重的纤毛表型，突变体在胚胎第13.5-14.5天是致命的，因此无法对以后的功能进行更详细的分析。

目前，在CEP290公司大约40%的患者同时表现出NPHP和LCA，50在里面空气处理接口110%-20%的患者大多没有NPHP，51,52而在TMEM67型,NPHP1型、和固定夹1L基因。虽然有两个额外的JS位点（JBTS）已被描述，但致病基因尚未报道，53–55只有不到10%的家族映射到这些位点。56因此，只有不到50%的患者可以得到分子诊断，并且基因型与表型的相关性尚未明确。我们的初步数据表明ARL13B型可能在不到1%的JS中发现，类似于ARL6号机组在BBS中，尽管确定ARL13B公司在更大的JSRD患者队列中。

与BBS3的发现相同，BBS3是唯一与ARL蛋白突变相关的其他疾病ARL13B公司迄今为止，这些都是错误的。31,32此外，我们的斑马鱼数据表明，错义突变可能是低形态等位基因，因为每一个错义突变的表达都会以中等效力挽救表型阿尔贝13b上海合作组织/上海合作组织突变体。这很可能反映了胚胎发生期间对蛋白质的需求，因为Arl3号机组和Arl13b公司突变小鼠在出生前通常是致命的。19,57因为Arl13b公司与Sonic hedgehog（Shh）信号有关，19因为嘘58,59此外，纤毛功能关键基因也与小脑颗粒神经元前体细胞的增殖有关，46,60我们的数据表明，Joubert综合征可能代表纤毛功能缺陷，介导Shh信号在增殖中的传递，尽管确切的信号机制和中断的发育途径尚待发现。

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补充数据包括国际JSRD研究小组的其他成员名单、五张图和一张表，可在http://www.ajhg.org/.

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文件S1。国际JSRD研究小组其他成员名单，五图一表：
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致谢

我们感谢马什菲尔德临床研究基金会和美国国家心脏、肺和血液研究所对基因分型的支持；UCSD神经科学显微镜成像核心（P30 NS047101）；Jeong-Soo Lee（Dana Farber癌症研究所）为斑马鱼拍摄阿尔贝13b克隆；Mark Lawson（UCSD）帮助进行SigmaPlot和统计分析；Daniel O'Connor（加州大学圣地亚哥分校）负责控制DNA样本；和Gleeson实验室的成员进行有益的讨论。遗传病研究中心（CIDR）提供了基因分型服务。CIDR的资金全部来自国家卫生研究院与约翰·霍普金斯大学签订的联邦合同，合同号为N01-HG-65403。F.H.由NIH资助R01-DK068306、R01-DK04614和R01-DK09272，是多丽丝·杜克杰出临床科学家。V.C.得到了法国医学研究基金会（FRM）奖学金的支持。S.L.B.获得了老龄化博士后训练神经可塑性基金（T32 AG00216）的支持。J.Y.B.得到了癌症研究所欧文顿研究所奖学金项目的支持。这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所、西蒙斯基金会和Burroughs Wellcome基金会转化研究奖（授予J.G.G.）的资助。作者报告没有利益冲突。

工具书类

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文章来自美国人类遗传学杂志由以下人员提供美国人类遗传学学会