美国生理学杂志《细胞生理学》。2008年7月；295（1）:C146–C150。
泊洛沙姆188可减少腰部肌肉收缩力下降中密度纤维板老鼠
,1 ,2 ,三和1,2
Rainer Ng公司
1生物医学工程系，2分子与综合生理学系三密歇根大学外科，整形外科，密歇根州安娜堡
约瑟夫·梅茨格
1生物医学工程系，2分子与综合生理学系三密歇根大学安阿伯分校整形外科外科
丹尼斯·克拉夫林
1生物医学工程系，2分子与综合生理学系，以及三密歇根大学安阿伯分校整形外科外科
约翰·福克纳
1生物医学工程系，2分子与综合生理学系三密歇根大学安阿伯分校整形外科外科
1生物医学工程系，2分子与综合生理学系三密歇根大学安阿伯分校整形外科外科
转载请求和其他通信地址：J.A.Faulkner，Univ.of Michigan，BSRB，Rm。密歇根州安阿伯市Zina Pitcher Place 2035，109号，邮编：48109-2200（电子邮件：ude.hcimu@kluafaj) 收稿日期：2008年1月11日；2008年5月16日接受。
- 补充资料
【补充图】
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摘要
Duchenne肌营养不良症是一种由缺乏蛋白质营养不良蛋白引起的遗传病。营养不良的肌肉极易受到收缩引起的损伤，在收缩活动之后，会破坏使钙离子渗漏到肌肉纤维中的质膜。由于细胞内钙浓度增加与肌肉功能障碍之间存在直接关系，因此可以通过识别和限制钙内流途径来实现治疗效果。我们的目的是确定肌膜损伤对营养不良骨骼肌收缩损伤引起的力赤字的贡献。使用营养不良的孤立腰部肌肉(中密度纤维板)我们首次证明了泊洛沙姆188（P188），一种膜封泊洛沙默，在整体上可以有效地减少力量不足中密度纤维板骨骼肌。在中密度纤维板暴露在无钙环境中的肌肉。这些结果，再加上之前观察到的钙进入中密度纤维板在类似的收缩方案中，肌肉纤维支持细胞外钙通过肌膜损伤进入并导致在中密度纤维板肌肉。该结果为针对肌营养不良蛋白缺乏骨骼肌纤维膜稳定的潜在治疗策略提供了基础。
关键词：肌营养不良，肌膜病变
杜氏肌营养不良（DMD）是一种X连锁遗传病，由肌营养不良蛋白基因突变引起。因此，DMD患者的肌肉缺乏肌营养不良蛋白，这是一种427-kDa蛋白，位于肌纤维质膜（肌膜）的细胞质表面下方(5). 肌营养不良蛋白是肌膜内嵌入的肌营养不良素相关糖蛋白复合物的组装所必需的(26). 肌营养不良蛋白糖蛋白复合物将肌动蛋白细胞骨架连接到基底膜，并被认为为肌膜提供机械稳定性(19,28). 尽管肌营养不良蛋白的确切功能尚不清楚，但缺乏肌营养不良素的年轻男性骨骼肌所显示的病理学是引人注目的。患有杜氏肌营养不良的男孩从2-5岁开始出现渐进性肌肉无力，12岁时被轮椅束缚，20多岁时死于呼吸或心脏衰竭(17).
这个中密度纤维板1984年发现的老鼠(9)，不表达肌营养不良蛋白，因此为研究肌营养不良蛋白缺乏的影响提供了一个重要的动物模型。对来自中密度纤维板老鼠，以下简称中密度纤维板肌肉，在结构和功能方面有记录的损伤，包括对收缩引起的损伤的高度敏感性(11,15,21). 我们之前已经展示过(11)迫使收缩性损伤产生的缺陷中密度纤维板肌肉与细胞外钙流入肌肉纤维有关。拉伸激活、储存操作和钙泄漏通道被认为是细胞外钙内流的进入位点(6,13,35). 然而，这些离子通道不太可能完全负责钙内流，因为体积庞大、膜不渗透的染料和酶也会穿过营养不良肌肉的肌膜(1,29,30). 这些观察结果表明，细胞膜中存在较大的非特异性钙进入途径，如肌膜损伤。
P188是一种8.4-kDa两亲性聚合物，定位于脂质单层(33)以及膜的受损部分(22). 当应用于受损细胞时，P188修复受损的细胞膜并促进骨骼肌的恢复(20)，成纤维细胞(25)，心肌细胞(34)和脊髓(7)从各种致伤协议中。我们的目的是通过应用P188来确定肌膜损伤在多大程度上导致营养不良骨骼肌对收缩诱导损伤的敏感性增加。为了最大限度地减少对应用化合物的肌内分布不均匀的担忧，我们利用了位于小鼠前爪的一块非常小的整块肌肉——腰肌（LMB）。用P188治疗LMB肌肉，然后在体外进行等长收缩，未经治疗的LMB肌肉产生力量不足中密度纤维板肌肉。我们假设，未经治疗的营养不良肌肉中的力赤字最高，P188治疗的营养不良性肌肉中的中等，野生型肌肉中的最低。
材料和方法
特殊无甲状腺男性中密度纤维板2–3月龄的小鼠（C57BL/10ScSn-mdx库存编号001801）和2–5月龄的野生型（WT）C57BL/10小鼠均来自杰克森实验室（缅因州巴尔港）。老鼠被安置在密歇根大学一个特殊的无色素屏障设施中。所有实验程序均由密歇根大学动物使用和护理委员会批准，并符合实验动物的护理和使用指南【DHHS出版物第85-23号（NIH），1985年修订，科学与健康报告办公室，马里兰州贝塞斯达，20892】。
LMB肌肉作为体外研究收缩诱导损伤的模型。
使用小肌肉（如LMB）可以最大限度地减少使用大肌肉时对扩散过程的要求。小肌肉较短的扩散路径有助于代谢物往返于其核心，从而保持其在体外的生存能力。在整个实验过程中，WT小鼠的LMB肌肉表现出持续保持力量的能力，这是肌肉整体稳定性的积极迹象。最初的实验设计包括一组关于更常用的趾长伸肌（EDL）的平行实验。在这些实验中，EDL表现出疲劳，在10次等长收缩后力损失约10%，然后在休息10分钟后力完全恢复（见在线补充图）。由于我们的目标是在没有混杂因素（如疲劳导致的力量损失）的情况下研究收缩引起的损伤，因此停止了对EDL肌肉的实验。
与小肌肉相关的较短扩散距离在基于药物的实验中也是有利的，特别是当测试大分子如P188时。这是因为肌肉核心的化合物浓度达到其在沐浴液中浓度的50%所需的时间与肌肉半径的平方成正比(16). 例如，典型半径为150μm的LMB肌肉需要的扩散时间是典型半径为600μm的EDL肌肉的16倍(10).
完整的单个肌肉纤维可以避免基于扩散的问题，并已用于研究膜靶向化合物在中密度纤维板肌肉(35). 尽管药物分布具有优势，但孤立的单个肌纤维的行为如果没有与相邻肌纤维的相互作用，可能无法准确表示整个肌肉的功能。像LMB这样的小型全肌保留了通常与单个肌纤维制剂相同的一些扩散优势和可视化优势，同时保持了体内全肌功能的更准确表示。
操作程序。
通过腹腔注射Avertin（三溴乙醇400 mg/kg）对小鼠进行麻醉。根据需要给予补充剂量的阿维汀，以保持小鼠对触觉刺激无反应。将小鼠的前爪和LMB肌肉从第三个手指上分离出来。随后用过量的阿维汀对小鼠实施安乐死，然后进行开胸手术。解剖在冷却的沐浴液中进行（～8°C，成分以mM计：137 NaCl，11.9 NaHCO三，5.0氯化钾，1.8氯化钙2，0.5氯化镁2和0.4 NaH2人事军官4). 根据物理尺寸，LMB肌肉质量估计为～0.2 mg。将隔离的LMB肌肉水平安装在定制的腔室中，远端肌腱连接到力传感器（改良型400A，Aurora Scientific），近端肌腱连接至伺服电机（318B，Aurora-Scientistic）。领带由10-0单丝尼龙缝合线组成。浴温保持在25°C，用Tyrode溶液（mM中的成分：121 NaCl，24 NaHCO三，5.0氯化钾，1.8氯化钙2，0.5氯化镁2和0.4 NaH2人事军官4). 用95%-5%的O起泡，pH值保持在7.32-CO公司2混合物。
等长收缩协议。
LMB肌肉通过两个铂板电极之间的电流进行电刺激。恒流刺激脉冲的持续时间为0.5ms，并对其幅度进行调整，以引起最大的抽搐反应。最佳长度(L（左）o个)通过调整肌肉长度来确定每一块肌肉的最大收缩力。为了实现最大的等长强直收缩，使用交替极性脉冲以超最大强度和频率刺激肌肉。用于诱导力不足的方案包括20次最大等长收缩，每次持续1秒，间隔1分钟。收缩之间的1分钟休息时间是消除疲劳所必需的，从而确保肌肉在20次收缩期间和之后产生力量的能力的任何下降都可归因于收缩引起的损伤。为了便于在不同质量的肌肉组之间进行比较，在收缩方案中，每个肌肉的绝对等长力被标准化为最大等长力（Po个)在20-收缩过程中由肌肉产生。
治疗组。
WT小鼠LMB肌肉分为两组。一组接触正常的Tyrode溶液，另一组接触名义上无钙的Tyrode溶液。LMB肌肉来自中密度纤维板根据对小鼠的治疗，将其分为五组：1)第188页，2)链霉素，三)P188和链霉素，4)名义上无钙的Tyrode，或5)正常的蒂罗尔。链霉素是一种拉伸激活通道的抑制剂，可减少EDL肌肉中收缩诱导的力量不足中密度纤维板老鼠(32,35). 本研究包括链霉素实验，以验证相对新颖的LMB肌肉制剂。Tyrode溶液中P188（新泽西拜耳）和链霉素（编号S1277，Sigma）的浓度分别为1 mM和200μM。对于所有的治疗，在开始收缩方案之前，允许肌肉在腔室中孵育15分钟。在暴露于P188（1 mM）或链霉素（200μM）的WT肌肉上进行的初步实验表明，这些化合物不会导致Po个在这些浓度下使用时。对于名义上无钙的实验，CaCl2从Tyrode溶液中删除，MgCl2增加至2.3 mM，以保持二价阳离子的浓度。
无钙实验中产生的力量不足有两个潜在的根源：收缩引起的力量不足和肌肉长期暴露在非生理环境中导致的“环境”力量不足。为了将收缩与环境力赤字分开，我们假设无钙环境对WT和中密度纤维板肌肉，从而使中密度纤维板无钙环境中的肌肉与相同无钙环境下的WT肌肉相比。收缩方案结束时中密度纤维板肌肉，表示为P的百分比o个除以WT肌肉的等长强直力，也表示为P的百分比o个此数据归一化程序隔离了收缩引起的力赤字，允许在中密度纤维板无钙和正常环境下的肌肉。
统计。
数据以平均值±SE表示。使用方差分析（ANOVA）进行统计分析，显著性水平先验设定为P（P）< 0.05. 当检测到显著性时，应用Holm-Sidak事后比较。
结果
组织学和等长力生产。
LMB肌肉直径约为300μm，由200至250根纤维组成(,A类和B类). 横截面中密度纤维板肌肉表现出典型的营养不良特征(8)包括单核细胞浸润区域和具有中央核的纤维群(). 平均绝对Po个未经治疗的中密度纤维板肌肉（10.8±0.4 mN，n个=8）小于WT肌肉（14.8±0.9 mN，n个= 6). 治疗中密度纤维板肌肉中含有链霉素或P188，或同时含有链霉素和P188，均不影响绝对Po个（未显示数据）。在名义上无钙的Tyrode溶液中，绝对Po个WT和中密度纤维板肌肉减少约30%至10.8±0.5 mN(n个=3）和7.2±1.3 mN(n个=4）。这种力的减少可能是由于从细胞外缓冲液中去除钙导致的兴奋-收缩耦合过程受损(18).
小鼠前爪第三趾的腰肌。A类：野生型（WT）肌肉显示在30号皮下注射针旁边。B类：苏木精和伊红染色的野生型蛔虫肌肉横截面。肌肉通常由200–250根纤维组成，直径约为300μm。C类:中密度纤维板肌肉。营养不良的特征包括存在中央核和单核细胞浸润。所有比例尺均为200μmB类和C类共享相同的比例。
收缩过程中产生WT和mdx肌肉。
在整个收缩过程中，WT小鼠LMB肌肉产生的力保持不变，没有疲劳或受伤的迹象(,A类和B类). 相反，未经治疗中密度纤维板随着协议的进展，肌肉力量表现出稳步下降(). 之间的比较中密度纤维板第七次收缩后，WT肌和WT肌在各个收缩间隔时的每种反应都显示出两种基因型之间的差异。在10分钟的恢复期后，力的大小保持不变，这表明中密度纤维板LMB肌肉不是由肌肉疲劳引起的，而是由收缩引起的损伤引起的(8).
WT和中密度纤维板腰部肌肉。A类：等轴测力产生的示例记录。为了清楚起见，仅记录第一个(1)最后一个(20)图中显示了等长收缩。B类：WT的强制生产(n个=6）和中密度纤维板(n个=8）在正常的Tyrode溶液中进行20次等长收缩的方案中，腰部肌肉。闯进x-轴表示10分钟的休息时间。进行双向方差分析以确定肌营养不良蛋白缺乏和收缩次数对力赤字的影响#WT与中密度纤维板匹配时间点的肌肉(P（P）< 0.05).
P188和链霉素的作用。
在等长收缩方案结束时，WT组的标准化力值最高，而未治疗组的标准值最低中密度纤维板组，分别为98%和69%的Po个分别为(). 这个中密度纤维板P188+链霉素组和无钙组的肌肉产生的标准化力与WT组的肌肉没有区别(). 治疗中密度纤维板单独使用P188或链霉素的肌肉产生的力值介于未治疗组之间中密度纤维板组和WT组().
强制生产中密度纤维板以及20次等长收缩结束时的WT腰肌。进行了单因素方差分析，然后对各组进行了两次独立的事后比较。在第一次比较中，将所有组与未治疗组进行比较中密度纤维板组（功率>0.8）。在第二组中，将所有组与WT组进行比较（功率>0.8）。*和#，与WT和未处理的差异中密度纤维板组，分别(P（P）< 0.05).
讨论
营养不良肌纤维的肌膜对细胞外钙的渗透性增加可能导致营养不良纤维对收缩诱导损伤的敏感性增加。与此假设相一致，我们之前已经证明，在类似于此处所用的收缩方案中，LMB肌肉从中密度纤维板小鼠主要归因于细胞外钙流入肌肉纤维(11). 由于细胞内钙浓度升高与肌肉功能障碍之间的直接关系(三,12,31)，可通过识别和限制钙内流途径实现治疗效果。在本研究中，我们证实了拉伸激活通道（SAC）(32,35)是一种这样的途径吗？并报道了肌膜损伤的额外参与是导致收缩力不足的因素中密度纤维板骨骼肌。
先前的研究已经确定P188是一种直接与单层相互作用的膜修补聚合物(33)和破坏膜(22). P188可有效稳定细胞膜，并可从一系列损伤诱导方案中促进多种细胞类型的恢复(7,20,25,34). 在本研究中，P188降低了中密度纤维板肌肉增加～50%(). 还观察到部队赤字减少中密度纤维板暴露在无钙环境中的肌肉。这些结果，再加上在类似的收缩方案中直接观察到钙进入营养不良的LMB肌纤维(11)，支持以下解释，即本研究中使用的收缩方案导致肌膜病变，允许细胞外钙流入，并且这些进入途径对在中密度纤维板肌肉。尽管有证据表明中密度纤维板肌肉的形成机制尚不明确。考虑到肌营养不良蛋白缺乏性肌膜的脆弱性(24,27)，损伤可能是由与收缩活动相关的机械应力引起的(23,29)或者，肌膜损伤可能是钙的继发后果2+进入肌肉纤维(32). 在这种情况下，钙的过度流入2+触发脂质损伤途径的活性(14)导致肌膜损伤。
与单独治疗相比，P188和链霉素联合治疗仅产生微小改善中密度纤维板肌肉(). 当P188和链霉素一起使用时，缺乏明显的加性效应，这表明，虽然SAC和膜损伤都有助于细胞内钙的增加，但仅阻断任一途径就足以降低观察到的力不足的程度。有几种可能的解释可以解释这一观察结果。一种可能性是，通过SAC或膜损伤的钙内流量不超过肌肉纤维维持细胞内钙稳态的能力。也就是说，内源性钙缓冲、隔离和挤压途径(4)结合快速膜修复机制(2)，可能使肌肉纤维保持正常的细胞内钙水平，只要钙进入途径之一被阻断。然而，当钙通过SAC和膜损伤进入时，可能会超过钙清除机制的能力，导致钙诱导的力不足。另一种可能是P188修复的大多数肌膜病变是SAC活性的结果。在这种情况下，链霉素对SAC的抑制或P188对肌膜损伤的修复都足以挽救肌肉，两者结合不会产生明显改善。最后，我们不能排除P188也作为SAC抑制剂的可能性。
通过使用一种分离的腰肌制剂，我们首次证明了P188，一种膜封性泊洛沙姆，在整体上可以有效减少收缩引起的力量不足中密度纤维板骨骼肌。这一观察结果支持这样的解释，即收缩会导致肌膜损伤，从而使细胞外钙进入肌纤维。这些结果为针对肌营养不良蛋白缺陷骨骼肌的膜稳定的潜在治疗策略提供了基础。
赠款
这项工作得到了国家卫生拨款研究所AG-000114、AG-015434和HL-086790的支持。
笔记
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，物品必须在此标记“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。
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