跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
细胞组织库。2008; 9(3): 229–245.
2008年3月18日在线发布。 数字对象标识:2007年10月10日/10561-008-9067-2
预防性维修识别码:PMC2493521型
PMID:18347928

太阳健康研究所脑捐赠项目:描述和经验,1987年至2007年

摘要

太阳健康研究所的大脑捐赠项目自1987年以来一直在持续运作,有1000多个大脑储备。所研究的人口主要居住在亚利桑那州凤凰城西北部的退休社区。该研究所隶属于Sun Health,这是一家非营利性社区拥有和运营的医疗服务提供商。受试者进行前瞻性登记,以便在一生中进行标准化临床评估。资金主要来自竞争性赠款。该计划将短期尸检大脑检索作为优先事项,整个采集的尸检间隔时间中位数为2.75小时。这样可以最大限度地利用资源进行分子研究;大约82%病例的冷冻组织适合进行RNA研究。内部进行的研究表明,即使死后间隔很短,大脑提取延迟的增加也会对RNA完整性产生不利影响,脑脊液pH值随着死后间隔的增加而增加,但不能预测组织的生存能力。

关键词:脑库、神经病理学、尸检、组织库、RNA、pH、脑脊液、尸检间隔

介绍

目的和使命

阿尔茨海默病(AD)和其他神经退行性疾病产生的临床综合征不是病理诊断现象。尸检大脑的神经病理学检查是获得确切诊断的唯一手段。脑库的目的是为基础科学家提供神经病理学特征的脑组织,使他们能够发现每种疾病特有的潜在分子机制,从而设计适当的治疗干预措施。通过对患病和非患病脑组织的比较研究,获得对疾病发病机制的遗传和分子过程的详细了解,仍然是寻找此类干预措施的主要途径。值得注意的是,对于阿尔茨海默病和帕金森病,现有批准的药物疗法都是基于30多年前对死后大脑的研究中发现的神经递质缺陷。随后,基础科学研究转向体外研究,并没有产生治疗这些疾病的新药。需要利用新的强大技术恢复对人脑的基础研究,以产生新一波的基本发现。

研究人群和研究地点

研究中的主要人口包括大凤凰城西北部的退休社区,尤其是太阳城、太阳城西区和太阳城大区。利用美国人口普查局(2000年)和太阳城地区历史协会档案中的数据构建了这些社区的概况。所有社区都要求居住年龄至少为55岁。太阳城、太阳城西部和太阳城格兰德的人口分别为38306人、26344人和9270人(截至2000年,总数为73920人)。太阳城始建于1960年,是美国最早规划的退休社区之一。随后分别于1978年和1996年推出了太阳城西部和太阳城大酒店。由于缺乏新的可用土地,所有三个社区的人口都停止了增长。太阳城的人口30年来一直保持在40000左右,这表明新退休人员的不断涌入将维持所有社区的人口。未来的新发展已经规划好,太阳城节日牧场目前处于早期阶段。预计到2010年,这一最新社区将再增加12000名居民。此外,周边地区有退休人员和年轻家庭。

虽然退休人员向该地区的迁移最初发生在三次主要浪潮中,与太阳城、太阳城西区和太阳城大区住房开发项目的建立和营销同时发生,但居民都非常相似,绝大多数是老年人、受过良好教育的白种人、,来自美国中西部各州的中高收入人群最为常见。最初,由于施工时间的差异,社区之间必然存在一些年龄差异,但继续用后来的移民替换最初的居民几乎抹去了这一证据,因为太阳城、太阳城西区和太阳城大区的居民中位年龄分别为75岁、78岁和75岁,分别是。太阳城的平均居住时间为12.6年。由于外来移民很少,流动主要是由于死亡。到1990年,太阳城原有人口的90%被第二代退休人员取代。

太阳健康研究所

太阳健康研究所(SHRI)是太阳健康公司(Sun Health Corporation)的附属机构,太阳健康公司是一家非营利性、社区所有和运营的医疗服务提供商。现在被称为太阳健康的项目最初构思于1965年,旨在满足亚利桑那州太阳城的需求,太阳城是首批计划中的退休社区之一。太阳健康现在不仅服务于原太阳城,还服务于邻近的太阳城西部和太阳城大区以及大凤凰城西北部的退休社区,所有这些地区的退休和非退休人口都经历了快速增长。Sun Health提供的服务包括医疗保险、两家急症护理医院、延伸和临终关怀、门诊诊所和老年痴呆症护理居所。Sun Health最近宣布,它将与Banner Health合并,Banner Health是一家规模较大的非营利医疗保健提供商,在大凤凰城、加利福尼亚州、犹他州和科罗拉多州拥有多个设施。

Sun Health Research Institute成立于1986年,资金来自Sun HealthOperations收入和对Sun Healths Foundation的慈善捐款。该研究所最初被称为生物老年学研究所,现已发展成为世界上最大的私人资助的年龄相关疾病研究中心之一。自成立以来,该研究所的科学工作重点一直是阿尔茨海默病,从1996年开始,对帕金森病和关节炎进行了大量研究。最近,纤维肌痛、骨科和前列腺癌的研究得到了扩展。自1998年以来,该研究所一直是亚利桑那州阿尔茨海默病协会(AAC)的一部分,该协会是一个国家资助的联盟,包括太阳健康研究所、亚利桑纳大学、图森退伍军人管理医疗中心、巴罗神经研究所、亚利桑那州梅奥诊所、,亚利桑那州立大学和Banner Health/Good Samaritan医院系统。2001年,该财团被授予国家老年痴呆症研究所核心中心(ADCC),2002年被授予国家资助的亚利桑那州帕金森病中心。这两家公司的总部都设在SHRI。

太阳健康研究所的大脑捐赠计划

脑捐赠计划自1987年开始实施,在此期间招募了2500多名捐赠者,约占周围退休社区当前总人口的2%。其中,1042名捐赠者已过期,他们的大脑已被收集和储存,而有1061名活体捐赠者。捐赠者都是专门为该项目自愿捐款的,而且积极性很高,每年的退学率只有1.8%。招募最初依赖于医院工作人员,他们获得了入院时死亡人员家属的同意。招聘工作几乎完全是在预期的基础上进行的,主要是通过口碑,通过人群与Sun Health供应商网络的医生和护理人员的互动,以及通过研究所工作人员向社区团体和公众举办的公开演讲活动和参观研究所。研究所工作人员每年大约举办60场此类公众互动活动。相对频繁的媒体发布也有助于招聘。该计划的资格标准很简单,因为受试者必须没有危险的传染病,并且必须同意在SHRI进行年度临床评估。此外,在接受之前,至少两年申请人的私人医疗记录必须由脑捐赠计划工作人员接收和审查。病历审查主要是为了排除危险的传染病情况。所有登记的受试者或法律代表签署机构审查委员会批准的知情同意书,允许在生命期间进行临床评估,以及死后进行大脑和/或身体器官捐赠的多种选择。另一部分要求受试者允许或不允许DNA分离和储存以及基因检测。捐赠者可以随时退出该计划。当捐赠人失去精神能力时,通常会指定一名家庭成员作为捐赠人的法定代表人。然后,该法律代表将有权从该计划中撤回捐赠者。知情同意书中有一节充分披露了我们的组织可能的商业用途,说明SHRI、SHRI人员、其他机构人员或使用我们组织的其他组织可能会从使用组织中获得金钱利益。

1987年至1995年间,脑捐赠者没有接受正式的神经心理学测试。他们的精神状态是通过向初级保健医生、神经科医生、心理学家和精神科医生索取医疗记录,以及在登记时和死后立即与家人和护理人员进行电话访谈来确定的。1996年,聘请了一名临床心理学家,从那时起,对参加大脑捐赠计划的大多数受试者进行了标准化的神经心理学筛查评估。同样自1996年以来,大多数捐赠者都接受了专门用于检测显性和早期运动障碍的标准化神经评估。2000年,该计划的临床操作大大扩展,聘用了一名神经科医生、另一名神经心理学家和相关支持人员,允许管理一个完整的神经心理学测试组。如果在年度临床评估过程中发现以前未发现的医疗异常,则会通知并建议捐赠者去看医生进行进一步的调查和/或治疗。SHRI医生还将请求捐赠者的许可,将这一发现告知其私人医生。

考虑抽样问题

太阳城的受试者并不是整个美国老年人口的准确代表性样本,因为他们缺乏种族多样性,受教育程度更高,收入更高,寿命也比普通美国公民长。虽然研究人群缺乏美国普通人群的多样性,但使用更同质的人群有优势。使用具有最小遗传和环境变异性的同质种群减少了获得足够统计能力所需的受试者数量。许多研究人员已经认识到这一点,例如,利用孤立群体研究遗传的群体也使用了这一点(Adachi等人。1992; Johanneson等人。1999; Lio等人。2003; 马修斯等人。2004; 佩斯科恩和埃斯代尔1999). 然而,研究一个同质群体可能会遗漏由等位基因引起的疾病特征,这些等位基因可能在某些种族中富集,但在其他种族中不富集。

必须考虑选择偏差对研究人群的影响,因为尸检研究并不代表随机抽样。最近的一项研究表明,选择进行尸检的受试者与未进行尸检者没有明显差异(Lim等人。1999)但这可能因地区而异。“志愿者偏见”的问题已经被提出,因为一些研究表明,志愿者通常比非志愿者具有更高的社会经济背景(Gustavsson et al。1997; Mandel等人。2000; Sofuoglu等人。2000). 志愿者偏见可能会不同地适用于正常和患病受试者,因为正常受试者几乎总是真正的志愿者,而患病受试人往往在失去独立决策能力后由家庭成员登记。非常年长的正常对照受试者甚至可能被视为“超常者”,具有对疾病的一般遗传抵抗力。我们已经为我们的研究人群考虑了这种可能性。然而,对我们数据库的查询表明,我们的阿尔茨海默病和非痴呆对照受试者的主要疾病患病率大致相似(表1). 对照组受试者的癌症患病率明显高于AD受试者。此外,由于受试者的死亡年龄基本相同,因此排除了两组之间存在“幸存者偏见”的可能性。AD患者冠状动脉粥样硬化疾病和中风病史的更高患病率支持了许多以前的类似报道。

表1

AD和对照受试者死亡年龄和疾病等级流行率的比较

分类阿尔茨海默病非强化控制
死亡年龄80.579.9
冠状动脉疾病,%167
冲程,%7
糖尿病,%97
癌症,%1016
哮喘/慢性阻塞性肺病,%97
黄斑变性,%4
白内障,%79
骨质疏松,%913
听力障碍,%24
甲状腺功能减退症,%1217

脑捐赠计划数据库

1998年之前,记录保存在活页夹中的纸张上。随着计算机化数据库的启动,这些记录的基本方面,包括人口统计学、病史和神经病理学发现,都被提取出来并输入计算机化数据库。自1998年以来,该研究所开发了一套复杂的数据库和数据库管理协议,主要由签约的专业工业数据库顾问设计。大脑捐赠计划数据库的临床和神经病理学组成部分是一起设计的,并且是完全集成的。数据库是Microsoft Access和My Sequel离线程序的定制细化。目前的临床和神经病理学组合组件占用218兆字节。该数据库由51个矩阵组成,其中包含1905个字段(单独的数据类别),这些字段共同包含与基本人口统计信息、病史、标准化临床评估结果有关的数据,对于尸检受试者,还包含神经病理学数据、组织库存以及组织请求和发货记录。该数据库包含53个表单以方便数据输入,75个不同的长期数据报告可通过一次击键生成。该数据库还用于确保以适当的间隔安排临床评估。数据库的当前神经病理学部分有330个字段,其中国家阿尔茨海默病协调中心(NACC)神经病理学数据集是一个子集。除后者之外,还有许多其他领域,包括斑块、缠结、路易体和白质稀疏的内部分级方法,以及固定组织质量、RNA质量和固定组织、冷冻组织、脑脊液和血清的160个领域的当前库存。神经病理学数据库跟踪组织请求和请求者。

该数据库每天在Sun Health Information Services管理的两台服务器上自动备份,这两台服务器位于相距约5英里的两个站点。在两个位置存储数据可确保一台服务器的结构损坏(如火灾)不会导致无法弥补的损失。这两台服务器都存储了前30天的每日数据库副本;旧的副本被发送到为此目的而签约的商业服务器。存储较旧的数据库副本可以在数据库操作、硬件故障或软件故障中出现意外错误时恢复完整的数据库。

SHRI脑捐赠计划数据库由非正式小组管理,其中包括数据库设计者、统计学家、临床和神经病理学核心主管以及主要数据库操作员。这种安排非常奏效,因为它包括日常使用数据库的个人、医生(将收集数据的科学家)和数据库设计者(可以根据需要对数据库进行更改)。

数据库中人体受试者数据的保密性由多重保障措施保证,这些措施限制访问个人身份信息,如姓名、出生日期、死亡日期、地址和性别。数据输入仅限于尽可能少的人员。访问数据库需要唯一的用户名和密码,所有交易都会被跟踪并存储在电子日志中,以便识别任何个人的不当或不正确使用。Sun Health局域网的访问受到Sun HealthInformation Services维护的防火墙的保护。主题记录的纸质副本保存在主要数据库运营商办公室的上锁文件柜中。美国卫生与公众服务部部长向太阳健康研究所颁发了一份保密证书,保护受试者的数据不受法庭传票的影响。

研究所的研究人员可以根据要求随时获得数据库的最新副本,但不包括个人身份信息。使用一个长期查询来生成此结果,然后将数据库副本复制到便携式内存存储设备上,然后研究人员可以将其加载到自己的计算机上。Sun Health提供的标准Microsoft Access软件将运行数据库副本。对于涉及临床或神经病理学标准详细知识的数据库查询,神经病学和神经病理学主任协助研究人员进行查询设计。

所有数据都会自动接受错误检查程序,以识别超出范围、不合逻辑和丢失的数据。此外,定期将受试者记录的随机样本与数据表格(纸质副本)直接进行比较,以减少数据输入错误。

大脑和身体捐赠计划临床核心的受试者流

2001年1月1日至2006年12月31日的5年期间,通过大脑和身体捐赠计划临床核心的受试者流如图所示1请注意,本总结仅适用于在太阳健康研究所就诊的受试者,不包括在参与亚利桑那州ADCC的其他机构就诊的受检者。2001年1月1日,共有255名活体受试者参加了大脑和身体捐赠计划。在接下来的5年中,临床核心招募了1078名新受试者,补充了最初的受试者输入,在此期间,共有1332名受试者流入临床核心。在这5年的时间里,受试者遵循了两条主要途径,这取决于他们是否接受了核心人员的标准化临床评估。尽管该计划要求捐赠者同意在SHRI进行年度标准化临床评估,并且花费了大量精力对每个受试者进行评估,但不可避免的是,我们的一些活体受试者(目前不到10%)在没有标准化评估的情况下死亡。并非所有受试者都进行了评估,原因有很多。当一些受试者在计划中注册时,他们正处于疾病的晚期,在评估完成之前死亡或丧失能力,而其他受试者由于各种原因难以安排预约。一个常见的障碍是,如果他们不能自己开车,就没有人来接他们。在临床评估成为强制性之前,一些捐赠者已经加入了该计划,因此只能作为脑捐赠者保留。对于未在SHRI进行标准化临床评估而死亡的正常对照病例,或其最后一次SHRI评估是在死亡前一年以上,应通过与线人的电话访谈,努力获得死后功能评估。痴呆症问卷(DQ)已用于此目的,在2000年7月1日至2007年8月1日期间获得了42份尸检DQ评估。DQ在既有死亡前临床诊断又有死亡后DQ的受试者中得到验证(Ellis等人。1998). DQ对痴呆的存在具有较高的特异性和敏感性(分别为93%和89%),并且具有较高的评分一致性(98%)。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为10561_2008_9067_Fig1_HTML.jpg

2001年1月1日至2006年12月31日,受试者通过大脑捐赠计划。根据总受试者输入计算百分比

神经病理学核心与脑银行业务

致力于缩短尸检间隔

自脑捐赠计划开始以来,首要的组织原则是必须尽快切除和处理大脑。我们所有1042名尸检受试者的中位尸检间隔(PMI)定义为死亡到脑切除之间的时间间隔,为2.75小时(平均值3.92;标准偏差5.11;范围1-70)。关于PMI和脑组织质量之间的关系,已有相当广泛的文献,本文将不作详尽的总结,但很明显,死亡后分子实体的恶化程度因测量结果而异。高挥发性能量储存分子,如ATP,在几分钟内消失(Ravid等人。1992),儿茶酚胺在最初几个小时内急剧下降(Hynd等人。2003; Palmer等人。1988; 轮辐和科赫1978; 轮辐1979)而高分子量DNA可能在死亡后20天内保持稳定(Ludes等人。1993). 一些酶活性在死亡后实际上会增加,例如,肌酸激酶活性在死后2小时增加了10倍以上(Karkela1993). 大多数蛋白质和RNA物种在死后40–50小时内都非常稳定(Cummings等人。2001; 费雷尔等人。2007; Hynd等人。2003; 约翰逊等人。1986; 麦吉尔和麦吉尔1976; 普莱斯和凯恩斯2003; Stan等人。2006; Tomita等人。2004; Vonsatel等人。1995). 由于大多数生物医学研究都是在蛋白质和RNA上进行的,这可能表明尸检间隔长达36甚至48小时可能足以进行权威研究,但也有证据表明,大量特定蛋白质和RNA转录物显示出PMI依赖性的大幅度减少,甚至在最初的4-8小时内(Catts等人。2005; 费雷尔等人。2007; Hynd等人。2003; Pardue等人。1994). 不同信使核糖核酸转录物死后保存的可变性可能是由于不同的三级结构或正常的生理半衰期,从几分钟到几天不等。例如,c-fos mRNA的半衰期为15分钟,而珠蛋白mRNA的半衰期为50小时(Hynd等人。2003). 一些经过严格研究的蛋白质在死亡的前4-8小时内显著降解,包括α-突触核蛋白和沙克糖不溶性τ(Ferrer等人。2007a) ●●●●。翻译后蛋白修饰的死后完整性在很大程度上尚不清楚,尽管有报道称tau蛋白在死亡后30分钟内脱磷酸化(Gartner等人。1998).

我们使用定性RNA琼脂糖凝胶电泳评估了来自我们大脑库的157例患者(平均PMI 3.1小时)的RNA完整性。由一名不了解所有病例数据的观察者记录,存在两条明显不同且占主导地位的条带,对应于核糖体28S和18S RNA物种,用于定义可接受的RNA。这些条带的丢失或涂抹用于指示降解程度,使样品不适合研究。根据这些标准,133/157或82%的样本适合RNA研究,并已成功使用。对给予合适和不合适RNA的病例的PMI进行比较显示,在合适的样本中,平均PMI显著较短(2.75比3.5小时,双尾不配对t吨-测试;P(P) = 0.04). 这些结果表明,在快速尸检程序中,即使PMI的微小差异也会对RNA完整性产生显著影响。作为进一步的比较,平均PMI为16小时或以上的程序报告了三分之一到一半的病例具有适合分子研究方法的RNA(Vanderburg等人。2005; Vonsatel等人。1995)然而,我们发现82%的病例是合适的。这些结果和本文提供的简要文献综述表明,短的PMI显然可以优化资源的使用,但所有尸检研究都必须评估PMI的影响,因为它取决于研究中的特定分子形式。

现场脑移除团队

快速尸检程序的维护需要足够的人员来防止“倦怠”。大多数快速验尸程序因人员不足而失败。根据我们的经验得出的结论是,建议将任何一个人的待命期限制在每年不超过4个月。出于安全和效率方面的考虑,每个呼叫所需的最少人数为两人。我们有三个轮流待命团队,每个团队由一名组长和一名助理组成。团队领导是大脑捐赠计划神经病理学核心的员工(他们在正常时间内还担任组织学技术员),接受神经病学家和协调员的培训,每三个月随时待命,而助理则来自整个SHRI科学人员中的志愿者,技术和行政人员,一般每年服务1至3个月。团队负责人和助理将获得每一次调遣的奖金。作为另一种避免随叫随到团队倦怠的策略,我们不断优化程序,以尽量减少大脑处理时间。通常,我们在不到2.5小时内完成所有程序,团队成员在通话中花费的总时间(包括往返家中的交通)为3到4小时。为了加快大脑处理,我们一直在为未来的2-3次尸检做准备。拥有一个永久性的专用尸检套件,可以让所有工具和设备都准备好使用;我们还为所有容器和袋子预先贴上标签。

死亡时间电话协议和尸体运输

当注册脑捐赠计划的受试者死亡时,他们的照料者(通常在疗养院)会遵循家人给他们的指示,这些指示是在接受该计划时寄给家人的。说明很简单,只要求护理人员在死亡后尽快给研究所打电话。如果电话是在下班后打的,则会转接给Sun Health的一家急性病医院的接线员。然后,医院接线员呼叫待命小组组长,并打电话接收联系信息。然后,团队负责人致电联系人,通常是疗养院的护理人员,并进行简短访谈,以确定受试者的身份,确认他们已在计划中注册,并记录受试者当前的病历状况。团队负责人还询问受试者是否患有特定的危险传染病(详见下文安全部分)。在大凤凰城地区死亡的受试者由一家签约的商业尸体运输公司运送到SHRI停尸房。距离越远,电荷越大,PMI越长。由于这些原因,我们只接受在大约50英里半径内死亡的病例,知情同意书详细说明了这一点,以便家人知道。这些运输公司通常24小时为殡仪馆提供服务,因此非常适合我们的快速尸检计划。所有费用均由项目承担;捐赠者及其家人不承担任何与捐赠有关的费用。

抽血和脑脊液、脑切除、大体解剖和初始组织处理

在取出大脑之前,先从侧脑室提取脑脊液(CSF),然后通过经胸穿刺从左心室提取心脏血,使用30毫升配有8厘米长18针的一次性注射器。将脑脊液喷射到15毫升的一次性Falcon试管中进行离心,同时在离心之前,通过将血液引入标准血清分离器真空管(7毫升)将其转化为血清。虽然也将一小部分血液放入EDTA真空管(每个4 ml)中以制备血浆,但这与活体受试者的血浆不可直接比较,因为广泛的死后凝血会清除许多凝血因子和其他蛋白质。通常可获得约20-30毫升CSF、5-10毫升血清和4毫升血浆。将2-3毫升的血清样本送往商业临床病理实验室进行梅毒、HIV和甲型、乙型和丙型肝炎血清学检查。将剩余的血清和脑脊液离心,将血清和脑干液的上清液等分到1 ml微型离心管中,并在−80°C下冷冻保存。尸检脑脊液因尸检改变或心室起源而被认为不适合用于研究目的,但这些观点似乎纯粹是传闻,因为我们进行了广泛的文献检索,没有发现支持这些说法的公开证据。我们对死后脑脊液进行了广泛的研究(Castano等人。2006)使用Western blot、ELISA和蛋白质组方法学,获得了与许多其他小组发表的结果类似的结果,这些小组都使用了活体受试者的脑脊液。我们认为,对受试者进行精确的神经病理学诊断所获得的益处远远超过了任何轻微的死后变化所带来的缺点。我们目前正在对活体和已故受试者的脑脊液进行详细的蛋白质组比较。类似的考虑也适用于死后血液成分的使用,我们也对其进行了广泛的研究(Kuo等人。1998,1999,2000年; 罗杰斯等人。2006).

同样,在大脑切除和脑脊液提取之前,还要采集颞肌和头皮的样本。许多神经疾病可以在肌肉或皮肤中进行诊断或研究,因此我们将这些样本与脑组织一起固定和/或冷冻。我们已经公布了这些颞肌样本中Aβ浓度的结果(Kuo等人。2000亿)并对AD和对照受试者的头皮样本进行了未发表的研究(未发现免疫组织化学检测到的Aβ)。

大脑切除是用摆动电锯以标准方式完成的。为了尽量减少脑组织的细菌污染,头皮要用抗菌溶液清洗。取下颅盖后,大脑小组组长换上新的无菌手套,然后将大脑移到切割板上,切割板是用70%乙醇擦拭准备好的。这些预防措施符合我们尸检细胞培养团队的利益,他们定期从尸检脑组织培养胶质细胞和血管细胞(Lue等人。1996; 卢和沃克2002; 罗杰斯等人。2002; Walker和Lue2005). 尽可能多地切除大脑和颈脊髓。脑切除后,从蝶鞍上切除垂体。神经病学家在工作时间对大脑外表面、冠状脑片和副矢状小脑片进行大体神经病理学检查。使用数码相机(尼康D50)和将图像直接传输到计算机硬盘驱动器(尼康Capture 4)的专用软件,在移除、整体和切片后对小时后的大脑进行拍照。通过查看数字图像,神经病学家可以对下班后切除和处理的大脑进行粗略描述。这些图像也可以用于形态分析,而不会出现因固定而导致体积变化的常见并发症。

脑部解剖的细节如下。嗅球、嗅束和松果腺被切除,小脑和脑干被一道横穿脑桥的横切物从大脑上切断。从大脑和小脑/脑干中取出软脑膜作为研究材料储存(Roher等人。2003). 小脑通过切断小脑脚与脑干分离。在副矢状面上将每个小脑半体切成4-5段。脑干被切成左右两半。大脑在冠状面上被切成大约0.8–1厘米的片段。左侧切片用于浸泡固定在新鲜的磷酸盐缓冲的4%多聚甲醛中,而右侧切片则在干冰(20×20×3 cm)之间快速冷冻。

这种大脑处理方法不同于传统的神经病理学检查,在切片之前,将整个或一半大脑浸泡在甲醛中7-14天。尽管有人认为新鲜的切片有损于神经病理学大体检查,但我们认为新鲜的大脑切片是至关重要的,这既可以实现快速冷冻,也可以实现最佳固定。将完整半球缓慢冷冻在干冰上或将其置于超低温冰箱中会导致严重的冰晶伪影(Vonsattel等人。1995),使组织不适合冷冻切片组织学检查,冷冻切片组织学检查作为分子研究的一种方法变得越来越重要,尤其是那些利用共焦激光捕获显微镜分析的方法。此外,长期以来根深蒂固的观点是,在液氮或类似液体中快速冷冻对分子生物学研究至关重要,这种观点过于简单且不正确。事实上,快速冷冻可能会导致膜损伤,而等渗细胞保护剂的缓慢冷冻最适合于突触体的制备(Hynd等人。2003). 我们的经验表明,在干冰片之间快速冷冻可以使组织形态完整,适用于广泛的分子生物学程序,包括Western blot、ELISA、Northern blot、原位杂交、基因微阵列、蛋白质组学和RT-PCR。

同样,将整个大脑或完整的大脑半球固定并不是对资源的最佳利用,因为这会导致整个组织出现极端的固定梯度,即大脑表面固定过度,而内部区域固定不足。这些固定梯度使得即使是半定量免疫组织化学评估也非常困难,尽管少数表位对此具有耐受性。虽然通过Willis环灌注死后大脑(整个大脑或一个半球可以通过这种方式固定)是最佳固定方法,但这很耗时,我们发现在4°C下将1cm厚的切片固定24-48小时是一种合理的折衷方法(Beach等人。1987).

为了帮助制作厚度均匀的新鲜大脑切片用于冷冻和固定,我们开发了一种大脑切片器(夹具),在切片时将大脑固定在一起。在一位居住在太阳城的退休工程师和一家签约制造公司(亚利桑那州凤凰城AvTek,Inc)的协助下,我们通过在计算机上输入设备的三维平面图,实现了半自动复制。我们已经让其他智库了解了这一点。

在4°C下持续固定2天。固定后,从28个脑区取出诊断组织块(表2)用于石蜡包埋;此外,还有8个大组织块(约3×4厘米),代表所有脑叶以及小脑和脑干(表2)在2%二甲基亚砜/20%甘油中进行低温保护后,在雪橇式冷冻切片机上以40μm的厚度进行切片。这些厚切片在银染和免疫组织化学方面优于标准尸检脑石蜡块,因为它们的固定相对较轻(Beach等人。1987; 梁和吉勒姆1989)厚度(允许三维结构的完全可视化)、结构完整性(允许作为自由浮动部分进行处理,从而改善抗体的获取和清洗)以及不接触热石蜡(Pollard等人。1987). 这些大面积切片也为脑室周围白质稀疏分级提供了机会(图2a) 以及对微观梗死的广泛调查。将预切割的40μm自由浮动切片以及未切割的固定湿脑块储存在−20°C的溶液中,该溶液由30%的乙二醇、30%的甘油组成,并置于0.1 m的磷酸盐缓冲液中。以这种方式制备的切片在保存20年后已成功用于免疫组织化学研究。

表2

大脑区域取样用于诊断组织病理学和目录

大脑区域石蜡6μm切片冷冻40μm切片
额上回是的
额叶中回是的是的
中央前回是的
中央后回是的
顶上小叶是的
顶叶下叶是的
前扣带回是的是的
颞上回是的
颞中回是的是的
颞下回是的
梭状回是的是的
杏仁核海马旁回是的是的
头臀海马旁回。是的
lat.genic的海马旁回。是的是的
头部海马是的
身体上的海马是的是的
枕皮质:初级是的是的
枕皮质:联想是的是的
大脑白质:所有脑叶是的
尾核:头部是的
尾核:体是的是的
Putamen:头部是的
苍白球是的是的
无名实体是的是的
丘脑:前部是的是的
丘脑:中点是的是的
下丘脑是的是的
乳头状体是的
丘脑底核是的是的
黑实体是的
中脑被盖是的
Pons:前是的
Pons:中点是的是的
小脑:蚓类是的
小脑:齿状核是的是的
小脑:半球皮层是的是的
髓:前是的
髓:后部是的
嗅球和嗅道是的
脊髓:颈部是的
保存图片、插图等的外部文件。对象名为10561_2008_9067_Fig2_HTML.jpg

根据我们的标准方案染色的40μm冰冻切片的显微照片。()额叶H&E染色,脑室周围白质稀疏;(b条)海马体用Campbell-Switzer银染法染色,显示老年斑和神经纤维缠结;(c(c))Gallyas银染法染色神经纤维缠结;(d日)齿状回颗粒细胞层神经元用AT8抗体进行磷酸化tau蛋白免疫组化染色;(电子)用Gallyas法染色的簇状星形胶质细胞;((f))Gallyas法染色棘状星形胶质细胞;()少突胶质细胞螺旋体Gallyas法染色

诊断性污渍

石蜡切片切割为6μm,并用苏木精和伊红(H&E)染色。对前扣带回、杏仁核、内嗅皮质、额叶中回、颞中回、顶叶下叶、前髓质和嗅球的石蜡切片进行α-突触核蛋白免疫组织化学染色,以识别路易小体和路易相关神经节。大块冰冻石块的切片被Campbell-Switzer、Gallyas(Braak和Braak)染色1991)和硫黄素S法检测斑块、缠结和其他内含物,同时用H&E对额外切片进行染色,以检测和分级室周脑白质稀疏(白质疏松)和微梗死(图2). 在截面厚度为40μm时,我们发现H&E在检测白质变化方面优于Luxol Fast Blue。根据需要使用其他免疫组织化学程序,包括磷酸化tau蛋白检测非典型tau病,泛素检测额颞叶痴呆的神经元内内含物和泛素内含物,和αB-晶体蛋白和/或磷酸化神经丝,以检测皮质基底变性中肿胀的神经元。对于除H&E以外的所有染色,始终包括阳性对照组,以使各批次的染色结果标准化。

神经退行性疾病的诊断

文献中已对诊断标准进行了充分讨论,此处不再赘述。对于当前通用方法的总结,读者可以参考最近出版的算法(Dickson2005). 已发表的临床病理共识标准用于大多数情况,包括认知状态、是否存在其他神经系统体征以及相关病史的临床测定。自1997年以来,脑捐赠计划尸检的病例诊断见表不同情况的发生频率反映了招聘的优先顺序,重点是正常老年人控制、阿尔茨海默病和帕金森病。然而,值得注意的是,非阿尔茨海默病痴呆的发病率相对较高,尤其是路易体痴呆、进行性核上性麻痹和海马硬化,所有这些都经常作为临床诊断的阿尔茨海默氏病进行尸检。同样值得注意的是,在同一受试者中经常同时存在一种以上的主要神经病理学疾病。

表3

1997年至2007年神经病理诊断

神经病理诊断 N个 %
正常 11921
阿尔茨海默病31656
路易氏体型失智症9918
帕金森氏病7814
血管性痴呆438
进行性核上性麻痹417
海马硬化356
痴呆缺乏独特的组织学92
多系统萎缩50.9
运动神经元病伴痴呆0.5
皮质基底变性20.4
皮克氏病20.4
亨廷顿氏病20.4

由于在一个受试者中经常出现不止一种情况,因此百分比总和超过100

无主要临床神经诊断,仅限年龄一致性神经病理学

基因分型和DNA银行

自从发现阿尔茨海默病的风险增加是由于载脂蛋白E基因(apoE)的ε4等位基因的存在,许多研究表明ε4携带者与非携带者的一些临床病理特征不同。因此,在设计涉及阿尔茨海默病组织的研究时,分析考虑ε4基因型的数据非常重要。自1999年1月以来,我们的目标是对每一例尸检病例进行基因分型,迄今为止共完成730例。使用标准技术(Hixson和Vernier1990)如前所述,从我们的轻固定小脑样本中分离出DNA(Beach等人。2003). 我们发现这种方法比使用新鲜冷冻组织更方便,尽管这种方法不适用于福尔马林固定10天到2周的脑组织;在这些情况下,我们使用新鲜冷冻的小脑。我们定期进行质量控制研究,让另一个实验室重复我们的一系列apoE基因型病例。保存载脂蛋白E基因分型后剩余的分离DNA以备将来研究。当家族史、临床特征和/或病理组织学提示存在特定疾病时,由外部合作实验室进行与神经退行性疾病相关的其他突变筛查(例如,三联重复扩张疾病、脊髓小脑变性、前颗粒蛋白突变)。

无意识状态评估

疼痛状态影响组织质量,因为发烧、缺血缺氧和酸中毒对许多相关分子有害(Harrison等人。1995; Hynd等人。2003; Johnston等人。1997; Li等人。2004; Morrison-Bogorad等人。1995; Perry等人。1982; 轮辐1979). 然而,老年受试者的濒死状态很难确定,他们通常在没有密切医疗监督的情况下死于疗养院。CSF和/或脑组织的pH已被用作肛门状态的替代标志物(Ravid等人。1992). 一些研究报告称,当从临床数据推断出濒死状态可能有害时,例如在长期机械通气的情况下,pH值较低(例如pH值5.5–6.0),而在猝死的情况下pH值较高,接近正常值(例如7.0–7.4)(Hardy等人。1985; Perry等人。1982). 一些酶活性和RNA完整性测量与死后pH值相关,但并非所有研究或这些分子的所有亚型都与之相关(Kingsbury等人。1995; Li等人。2004; 轮辐1979; Stan等人。2006; Yates等人。1990). 最近的两项综合研究可能解决了先前报告中的可变性,因为发现只有pH值低于6.5-6.8左右时,RNA完整性降低(Li等人。2004; Stan等人。2006).

我们通过与死后胶质细胞培养中活细胞产量的相关性,对死后脑脊液pH值作为组织活力标记物进行了自己的研究,认为生理性损伤性濒死状态会导致从该组织中提取的活细胞产量减少。

将46例连续细胞培养病例的活细胞产量与其各自的脑脊液pH值和PMI进行比较。培养用脑组织取自卵圆心的脑白质。活细胞产量范围为0.74至6.47×106细胞/g脑组织。脑脊液pH值在6.36至7.19之间(平均值6.73)。尸检间隔为1.5至4.5小时。多元线性回归分析表明,CSF pH值不是活细胞产量的显著独立预测因子( = 0.12,P(P) = 0.45). 然而,死亡间隔与活细胞产量显著相关(呈负相关)( = 0.28,P(P) = 0.06). 令人惊讶的结果是,PMI与CSF pH值显著相关(呈负相关)( = 0.37,P(P)=0.01),与另一组一致(Catts等人。2005)但与其他几份报告不一致(卡卡拉1993; 金斯伯里等人。1995; Stan等人。2006). 我们的结果与其他组的结果之间的差异可能是由于我们的PMI一致较短,因为其他研究包括了许多PMI较长的病例。死亡后幸存的脑细胞很可能通过无氧代谢产生乳酸。随着PMI的增加,存活的细胞越来越少,最终所有细胞都将死亡。在这个过程中的某个时刻,pH值很可能最终会稳定下来。因此,主要涉及较长PMI病例的研究可能没有发现PMI和pH值之间的任何关系。我们尚未对足够多的病例进行RNA完整性评估和CSF pH值测量,以便对这些因素进行有意义的相关性。

因此,我们的结果表明,脑脊液随着死亡间隔的增加而逐渐酸化,但它不是组织存活率的有用预测因子,至少对于1–5小时范围内的PMI患者来说是如此。我们已经决定,直接评估组织保存情况优于间接标记物,如脑脊液pH值或濒死病史收集。由于RNA是用于研究用途的最重要的分子物种之一,我们一直使用RNA质量,如上文所述,在RNA凝胶中进行定性评估,作为组织质量的一般指标。

用于大脑小而重要区域生化研究的冷冻切片

对于神经退行性疾病研究而言,脑库的一个局限性是,一些最重要的大脑区域非常小,仅一两项研究可能会完全耗尽组织。这些小而重要的区域包括内嗅皮层、海马体、杏仁核和黑质。为了克服这一局限性,并将这些区域的组织分发给更多的研究人员,我们一直在低温恒温器上切割这些大脑区域,并为研究人员提供每例5-10个低温恒温仪切片的样本。研究发现,这足以对感兴趣的蛋白质进行5-6次Western blot分析,并对基因表达进行大量RNA分析。保守地说,我们估计这将使利用率提高10倍或更多。

黑质连续切片无偏立体形态测量

精确计算大脑特定区域内的神经元需要无偏见的体视学方法(Gundersen等人。1988; 西部1999)以及大脑感兴趣区域的完整采样。对于临床帕金森综合征病例以及许多对照病例,我们连续切片黑质,以便无偏见地估计神经元数量。在滑动冷冻切片机上以40μm的深度连续切片黑质的整个左侧,收集并妥善保存所有切片。迄今为止,已有146例以这种方式连续切片。然而,该方法非常耗时,作为一种替代方法,研究人员应该考虑对纹状体多巴胺能标记物进行生化分析,这可能是一种更为定量和敏感的黑质纹状体-多巴胺能系统完整性指标(Beach等人。2004).

大脑和身体捐赠计划,包括全面尸检

SHRI脑捐赠计划于2005年9月扩大了其业务范围,向所有注册受试者和新接受再结晶的受试者提供全身捐赠。自那时以来,约有600名前纯脑捐赠者同意全身捐献,我们已经进行了50多次此类尸检,将我们的快速尸检程序扩展到所有主要身体器官和组织。尽管这种扩展是为了研究其他器官系统的疾病,但人们越来越认识到,其他器官系统并发疾病可能会导致神经退行性疾病的临床表现。来自全身的银行组织也有助于分散我们的资金来源,从而实现更大的金融稳定性。

冻融效应和CSF pH值对组织RNA完整性影响的研究

根据我们的组织库经验,我们长期以来一直怀疑,库中组织中发生的大多数分子降解是由于反复的冻融循环造成的,这是由于在组织提取的解剖过程中操作不当或冷冻设备故障造成的。我们的冷冻柜目前由温度感应报警器进行保护,当温度达到一定水平时,这些报警器会自动给维护和组织库人员打电话。更好的保护是可取的,使用CO2储罐进行备用冷却是最佳(但昂贵)方法。我们计划通过在不同的时间间隔和温度下有意解冻和冷冻脑组织的小样本,系统地研究解冻和再冷冻对RNA完整性的影响。

生物材料分配程序

生物材料申请由SHRI科学家委员会根据可用性和科学价值批准。研究人员必须首先通过提供最新的生物样本或简历来建立适当的科学证书。如果请求很小或没有严重消耗特定资源,通常会获得批准,但如果是针对海马体等小而关键的区域,或者是需要几天时间才能完成的大型请求,则会受到更严格的审查。满足一个典型的小额请求需要2000美元的基本费用,以部分收回神经病学家和协调员协助研究设计、病例选择、数据库搜索、检索和/或解剖、包装、运输和持续通信的时间成本。较大的请求按比例分摊较大的成本回收费用。营利性公司的请求是在逐个合同的基础上进行谈判的,通常会收取更高的费用。适用于SHRI所有纸巾交易的一般原则是,用户应帮助支付运行程序的费用。由于学术用户通常没有大笔预算,他们的支付能力有限。我们通常不会拒绝这些用户访问资源,而是会批准他们的请求,即使他们的付款低于我们的成本。由于营利性组织通常能够偿还我们纸巾的全部费用,谈判通常旨在获得这笔费用。我们计算出,每年对一名受试者进行临床评估直至死亡,然后进行尸检、神经病理学检查、组织存储、数据库维护和响应组织请求的费用至少为每个受试者20000美元,根据项目的年度运营费用(临床和尸检费用)除以每年的尸检次数。向用户收取的费用通常不会接近运营成本。在一个典型的年份中,用户费用的回收率不到我们成本的10%。因此,我们认为,从道德上讲,向资源较多的组织寻求更高的报酬是合理的,而这些组织通常是营利性组织。实际上,该计划的大部分资金来自竞争性拨款,包括研究者发起的研究拨款和专用核心拨款的分包合同(SHRI拥有国家老龄研究所亚利桑那州阿尔茨海默病核心中心的神经病理学核心,以及亚利桑纳州资助的亚利桑那州帕金森病中心的神经病理学核心)。

向研究人员分发生物材料

在最近的4年期间(2001年1月1日至2005年8月16日),共进行了270次单独的分发,每个分发代表一组请求样本的单独组织检索和装运。其中,174份分发给20名亚利桑那州ADCC附属研究人员,95份分发给亚利桑那州ADCC以外的33名不同研究人员。在同一时间段内,SHRI脑捐赠计划提供的生物材料为26名研究人员提供了超过49笔赠款,共计71份出版物。在提供的53名研究人员中,50名为“非营利”组织工作,3名为“营利”组织。

保护神经病学核心工作者和组织使用者

通过采取一些预防措施,将接触人体组织的个人的健康风险降至最低。该过程从登记时的病历筛选开始,并在每次临床就诊和死亡时重复筛选。那些有严重感染病原体病史的人被排除在登记或尸检之外。这包括乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病毒、梅毒、结核病、克雅氏病(CJD)和任何类型的急性或慢性活动性中枢神经系统感染的活跃或携带者。由于SHRI是一家私人研究机构,而不是验尸诊断服务机构,我们可以选择拒绝验尸。自该电话协议制定以来的10年中,只有4名受试者因死亡时存在危险传染病而被拒绝,这反映出这些传染病在我们的研究人群中的发病率较低。其中三例被拒绝是因为CJD的高风险,其中一例后来被克利夫兰凯斯储备大学的国家朊病毒疾病监测实验室确认为CJD。第四个排斥反应是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌败血症。

鼓励参与大脑切除和组织加工的员工接种甲型肝炎和乙型肝炎疫苗;在接触新鲜或冷冻人体组织的过程中,工作人员穿戴防护服,包括头巾或帽子、护目镜、口罩、长袍、手套和靴子。每个尸检患者的死后血清被送往诊断血清学,以检测乙型和丙型肝炎、梅毒和艾滋病毒。如果其中任何一种表明存在这些病原体,则丢弃所有新鲜或冷冻组织。如果发生个人潜在的感染性污染,例如将新鲜组织液溅入眼睛或伤口,该个人将在现场接受适当的急救措施,然后被送往附近的急诊室。所有研究所工作人员在第一次聘用时都会接受一整天的实验室安全培训,包括生物危害安全预防措施。

未来战略

预计持续的技术进步将使人们能够对疾病的分子基础进行更加精细的研究。因此,将继续需要建立智库,随着方法变得更加强大,组织的重要性可能会增加。此外,随着存储体组织和神经病理学诊断受试者数量的增加,使用流行病学方法进行人群水平的调查将成为可能。这种“经尸检证实的流行病学”有可能提高以前基于临床诊断的知识库的准确性,因为其固有的较高诊断错误分类率。在SHRI,我们的主要研究领域将继续是正常衰老和与年龄相关的疾病。我们将努力使分子水平的研究结果不仅与生理学有关,而且与卫生保健、行为学、社会学和经济学有关。通过这种多方面的方法,我们希望有助于减少老龄化的负面影响。

致谢

大脑捐赠计划由太阳城、太阳城西部和太阳城格兰德的公民、国家老龄化研究所(P30 AG19610亚利桑那州阿尔茨海默病核心中心)、亚利桑那州卫生服务部(211002号合同,亚利桑纳州阿尔茨海默病联合会)、,亚利桑那州生物医学研究委员会(合同号4001、0011和05-901)和迈克尔·福克斯帕金森病研究基金会的普雷斯科特家庭倡议。

开放式访问

本文是根据知识共享署名非商业许可证的条款分发的,该许可证允许在任何媒体上进行任何非商业性使用、分发和复制,前提是原创作者和来源已获得认可。

工具书类

  • Adachi T、Inanami O、Sato A。在麻醉大鼠中,刺激Meynert基底核后,一氧化氮(NO)参与大脑皮层血流量的增加。神经科学快报。1992;139:201–204. doi:10.1016/0304-3940(92)90552-I。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Beach TG、Tago H、Nagai T、Kimura H、McGeer PL和McGeer EG。免疫组织化学人脑灌注固定:与浸入固定的比较。神经科学方法杂志。1987;19:183–192. doi:10.1016/S0165-0270(87)80001-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Beach TG、Sue L、Scott S、Layne K、Newell A、Walker D、Baker M、Sahara N、Yen SH、Hutton M、Caselli R、Adler C、Connor D、Sabbagh M。海马硬化性痴呆伴τ病。脑病理学。2003;13:263–278. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Beach TG、Walker DG、Sue LI、Newell A、Adler CC、Joyce JN。黑质Marinesco小体与多巴胺能标记物纹状体表达减少有关。神经病理学实验神经学杂志。2004;63:329–337.[公共医学][谷歌学者]
  • Braak H,Braak E.全脑切片中淀粉样沉积和神经原纤维变化的演示。脑病理学。1991;1:213–216. doi:10.1111/j.1750-3639.1991.tb00661.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Castano EM、Roher AE、Esh CL、Kokjohn TA、Beach T。神经病理学证实的阿尔茨海默病和非痴呆老年受试者脑脊液的比较蛋白质组学。神经研究。2006;28:155–163. doi:10.1179/016164106X98035。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Catts VS、Catts SV、Fernandez HR、Taylor JM、Coulson EJ、Lutze-Mann LH。小鼠脑组织死后mRNA降解的微阵列研究。大脑研究摩尔大脑研究。2005;138:164–177. doi:10.1016/j.molbraineres.2005.04.017。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cummings TJ,Strum JC,Yoon LW,Szymanski MH,Hulette CM。死后人脑组织信使RNA的回收和表达。中度病理学。2001;14:1157–1161. doi:10.1038/modpathol.3880451。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Dickson DW(2005)在神经退行性疾病的神经病理学诊断中需要技术和有用的分子标记。神经病理学报(柏林)109(1):14–24[公共医学]
  • Ellis RJ、Jan K、Kawas C、Koller WC、Lyons KE、Jeste DV、Hansen LA、Thal LJ。阿尔茨海默病痴呆问卷的诊断有效性。神经系统科学。1998;55:360–365. doi:10.1001/archneur.55.3.360。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 费雷尔一世(Ferrer I)、桑佩雷(Santpere G)、阿尔茨伯格(Arzberger T)、贝尔(Bell J)、布兰科(Blanco R)、博卢达(Boluda S)、布德卡(Budka H)、卡莫纳(Carmona M)、贾科内(Giaccone G)、克雷布斯(Krebs)、利米多(Limido L)、帕奇(Parchi P)、普伊格。脑蛋白质的保存在很大程度上取决于死后的储存温度:对人类神经系统疾病中蛋白质研究和脑库管理的影响:BrainNet欧洲研究。神经病理学实验神经学杂志。2007;66:35–46.[公共医学][谷歌学者]
  • Gartner U、Janke C、Holzer M、Vanmechelen E、Arendt T。大鼠大脑中牛磺酸蛋白磷酸化状态的死后变化。神经生物老化。1998;19:535–543. doi:10.1016/S0197-4580(98)00094-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Gundersen HJ、Bagger P、Bendtsen TF、Evans SM、Korbo L、Marcussen N、Moller A、Nielsen K、Nyengard JR、Pakkenberg B。新的体视学工具:分离因子、分馏因子、成核因子和点采样截取及其在病理学研究和诊断中的应用。APMIS。1988;96:857–881.[公共医学][谷歌学者]
  • Gustavsson JP、Asberg M、Schalling D。精神病研究中的健康对照对象:冲动性和志愿者偏见。精神病学学报。1997;96:325–328. doi:10.1111/j.1600-0447.1997.tb09924.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hardy JA、Wester P、Winblad B、Gezelius C、Bring G、Eriksson A。长期终末期死亡的患者有酸中毒的大脑;尸检组织生化测量的意义。神经传输杂志。1985;61:253–264. doi:10.1007/BF0125916。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Harrison PJ、Heath PR、Eastwood SL、Burnet PW、McDonald B、Pearson RC。死前酸中毒和死后间隔对人脑基因表达研究的相对重要性:选择性mRNA易损性及其与编码蛋白的比较。神经科学快报。1995;200:151–154. doi:10.1016/0304-3940(95)12102-A。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hixson JE,游标DT。通过基因扩增和HhaI裂解对人载脂蛋白E进行限制性等分型。脂质研究杂志。1990;31:545–548.[公共医学][谷歌学者]
  • Hynd MR、Lewohl JM、Scott HL、Dodd PR。使用人类尸检脑组织进行生化和分子研究。神经化学杂志。2003;85:543–562.[公共医学][谷歌学者]
  • Johanneson B、Steinsson K、Lindqvist AK、Kristjansdottir H、Grondal G、Sandino S、Tjernstrom F、Sturfelt G、Granados-Arriola J、Alcocer-Varela J、Lundberg I、Jonasson I、Truedsson L、Svenungson E、Klareskog L、Alarcon-Segovia D、Gylensten UB、Alarcon-Riquelme ME。不同人群中系统性红斑狼疮多病例家族的基因组扫描比较。J自动免疫。1999;13:137–141. doi:10.1006/jaut.1999.0305。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Johnson SA、Morgan DG、Finch CE。大鼠和人脑RNA的广泛死后稳定性。神经科学研究杂志。1986;16:267–280. doi:10.1002/jnr.490160123。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Johnston NL、Cervenak J、Shore AD、Torrey EF、Yolken RH。用三种不同的RT-PCR方法测量的死后人脑RNA水平的多元分析。斯坦利神经病理学联合会。神经科学方法杂志。1997;77:83–92. doi:10.1016/S0165-0270(97)00115-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Karkela JT公司。对人类尸检池液中死后变化的关键评估。酶、电解质、酸碱平衡、葡萄糖和糖酵解、游离氨基酸和氨。与全脑缺血的相关性。法医学杂志。1993;38:603–616.[公共医学][谷歌学者]
  • Kingsbury AE、Foster OJ、Nisbet AP、Cairns N、Bray L、Eve DJ、Lees AJ、Marsden CD。组织pH值作为人类死后大脑mRNA保存的指标。大脑研究摩尔大脑研究。1995;28:311–318. doi:10.1016/0169-328X(94)00219-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kuo YM、Emmerling MR、Bisgaier CL、Essenburg AD、Lampert HC、Drumm D、Roher AE。阿尔茨海默病患者低密度脂蛋白升高与脑阿贝塔1-42水平相关。生物化学与生物物理研究委员会。1998;252:711–715. doi:10.1006/bbrc.1998.9652。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kuo YM、Emmerling MR、Lampert HC、Hempelman SR、Kokjohn TA、Woods AS、Cotter RJ、Roher AE。阿尔茨海默病患者的血浆蛋白会隔离高水平的循环Abeta42。生物化学与生物物理研究委员会。1999;257:787–791. doi:10.1006/bbrc.1999.0552。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kuo YM、Kokjohn TA、Kalback W、Luehrs D、Galasko DR、Chevallier N、Koo EH、Emmerling MR、Roher AE。淀粉样β肽与血浆蛋白和红细胞相互作用:对其在血浆中定量的影响。生物化学与生物物理研究委员会。2000;268:750–756. doi:10.1006/bbrc.2000.2222。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kuo YM、Kokjohn TA、Watson MD、Woods AS、Cotter RJ、Sue LI、Kalback WM、Emmerling MR、Beach TG、Roher AE。阿尔茨海默病患者骨骼肌中abeta42升高表明AbetaPP代谢的外周改变。《美国病理学杂志》。2000;156:797–805. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Leong AS,Gilham PN。渐进式甲醛固定对组织抗原保存的影响。病理学。1989;21:266–268. doi:10.3109/003130289061071。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Li JZ,Vawter MP,Walsh DM,Tomita H,Evans SJ,Choudary PV,Lopez JF,Avelar A,Shokoohi V,Chung T,Mesarwi O,Jones EG,Watson SJ,Akil H,Bunney WE,Jr,Myers RM。与组织pH值和终末期医疗条件相关的死后人脑基因表达的系统性变化。人类分子遗传学。2004;13:609–616. doi:10.1093/hmg/ddh065。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lim A、Kukull W、Nochlin D、Leverenz J、McCormick W、Bowen J、Thompson J、Peskind ER、Raskind M。阿尔茨海默病在社区病例系列中的临床-神经病理相关性。美国老年学会杂志。1999;47:564–569.[公共医学][谷歌学者]
  • Lio D、Pes GM、Carru C、Listi F、Ferlazzo V、Candore G、Colonna-Romano G、Ferrucci L、Deiana L、Baggio G、Franceschi C、Caruso C。HLA-DR等位基因与寿命的相关性:撒丁岛人群的研究。Exp Gerontal公司。2003;38:313–317. doi:10.1016/S0531-5565(02)00178-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ludes B,Pfitzinger H,Mangin P.可变死后组织的DNA指纹。法医学杂志。1993;38:686–690.[公共医学][谷歌学者]
  • Lue LF,Walker DG。阿尔茨海默病免疫治疗机制建模:人类死后小胶质细胞与抗体-淀粉样β肽的相互作用。神经科学研究杂志。2002;70:599–610. doi:10.1002/jnr.10422。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lue LF,Brachova L,Walker DG,Rogers J.阿尔茨海默病患者和对照患者快速尸检中胶质细胞培养的特征。神经生物老化。1996;17:421–429. doi:10.1016/0197-4580(96)00006-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mandel FS、Weiner M、Kaplan S、Pelcovitz D、Labruna V。志愿者受试者选择中的偏见检查:深度虐待儿童研究的结果。创伤应激杂志。2000;13:77–88. doi:10.1023/A:1007772931154。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 加利福尼亚州马修斯、罗伊斯六世、贝哈拉诺J、马萨诸塞州埃斯卡米拉、福尼尔E、埃雷拉LD、洛TL、洛杉矶麦克因斯、莫利纳J、奥普霍夫RA、拉文特斯H、洛杉矶桑德奎尔、斯洛伐克服务公司、斯佩斯尼M、利昂PE、弗雷默NB。哥斯达黎加神经精神疾病的遗传研究:孤立人群使用的模型。精神病学遗传学。2004;14:13–23. doi:10.1097/00041444-200403000-00003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • McGeer PL,McGeer EG。与人类对照组和帕金森病和亨廷顿舞蹈病患者儿茶酚胺、乙酰胆碱和γ-氨基丁酸代谢相关的酶。神经化学杂志。1976;26:65–76.[公共医学][谷歌学者]
  • Morrison-Bogorad M,Zimmerman AL,Pardue S.人脑中热休克70信使RNA水平:与濒死热的相关性。神经化学杂志。1995;64:235–246.[公共医学][谷歌学者]
  • Palmer AM、Lowe SL、Francis PT、Bowen DM。人类大脑的死后生化研究值得吗?生物化学Soc Trans。1988;16:472–475.[公共医学][谷歌学者]
  • Pardue S,Zimmerman AL,Morrison-Bogorad M.大鼠脑中诱导性热休克蛋白70(hsp70)mRNA的选择性死后降解。细胞分子神经生物学。1994;14:341–357. doi:10.1007/BF02088715。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Perry EK,Perry RH,Tomlinson BE.濒死状态对死后人脑组织某些神经化学活动的影响。神经科学快报。1982;29:303–307. doi:10.1016/0304-3940(82)90334-2。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Peschken CA,Esdaile JM。北美土著人民的风湿病。大黄性关节炎。1999;28:368–391. doi:10.1016/S0049-0172(99)80003-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Pollard K,Lunny D,Holgate CS,Jackson P,Bird CC。固定、处理和免疫化学试剂对石蜡包埋组织中T淋巴细胞表面膜抗原保存的影响。组织化学与细胞化学杂志。1987;35:1329–1338.[公共医学][谷歌学者]
  • 新泽西州凯恩斯Preece P。定量尸检人脑中的mRNA:性别、死亡年龄、尸检间隔、脑pH值、濒死状态和基因间mRNA变异的影响。大脑研究摩尔大脑研究。2003;118:60–71. doi:10.1016/S0169-328X(03)00337-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ravid R、Van Zwieten EJ、Swaab DF。大脑银行和人类下丘脑——匹配的因素、陷阱和潜力。大脑研究进展。1992;93:83–95. doi:10.1016/S0079-6123(08)64565-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Rogers J、Lue LF、Walker DG、Yan SD、Stern D、Strohmeyer R、Kovelowski CJ(2002)《阐明小胶质细胞培养中阿尔茨海默病的分子机制》。Ernst Schering Res Found Workshop,第25-44页[公共医学]
  • Rogers J,Li R,Mastroeni D,Grover A,Leonard B,Ahern G,Cao P,Kolody H,Vedders L,Kolb WP,Sabbagh M。通过补体C3依赖性粘附红细胞对淀粉样β肽的外周清除。神经生物老化。2006;27:1733–1739. doi:10.1016/j.neurobiolaging.2005.09.043。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Roher AE、Kuo YM、Esh C、Knebel C、Weiss N、Kalback W、Luehrs DC、Childress JL、Beach TG、Weller RO、Kokjohn TA。阿尔茨海默病的皮质和软脑膜脑血管淀粉样蛋白和白质病理学。分子医学。2003;9:112–122. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sofuoglu M、Dudish-Poulsen S、Nicodemus KK、Babb DA、Hatsukami DK。住院可卡因研究中研究志愿者的特征:关注选择偏差。上瘾行为。2000;25:785–790. doi:10.1016/S0306-4603(00)00064-2。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 发言人EG.影响人类死后脑组织中多巴胺、去甲肾上腺素、谷氨酸脱羧酶和胆碱乙酰化酶测量的因素分析。大脑。1979;102:333–346. doi:10.1093/brain/102.2.333。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Spokes EG,Koch DJ。在模拟处理人类尸检材料的条件下,小鼠大脑中多巴胺、谷氨酸脱羧酶和胆碱乙酰转移酶的死后稳定性。神经化学杂志。1978;31:381–383. doi:10.1111/j.1471-4159.1978.tb12477.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Stan AD、Ghose S、Gao XM、Roberts RC、Lewis-Amezcua K、Hatanpaa KJ、Tamminga CA。人类尸检组织:什么质量标记物重要?大脑研究。2006;1123:1-11.doi:10.1016/j.rainres.2006.09.025。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Tomita H、Vawter议员、Walsh DM、Evans SJ、Choudary PV、Li J、Overman KM、Atz ME、Myers RM、Jones EG、Watson SJ、Akil H、Bunney WE。,濒死和死后因素对基因表达谱的影响:死后人脑微阵列分析的质量控制。生物精神病学。2004;55:346–352. doi:10.1016/j.biopych.2003.10.13。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Vanderburg CR、Pfanni R、Tian D、Kiehl T-R、Hsi T、Hedley-Whyte ET、Frosch MP。影响人脑死后RNA完整性的因素。神经病理学实验神经学杂志。2005;64:443–443. [谷歌学者]
  • Vonsatel JP、Aizawa H、Ge P、DiFiglia M、McKee AC、MacDonald M、Gusella JF、Landwehrmeyer GB、Bird ED、Richardson EP、。,一种改进的方法,用于为研究准备人脑。神经病理学实验神经学杂志。1995;54:42–56. doi:10.1097/00005072-199501000-00006。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lue LF Walker DG公司。用培养的人类小胶质细胞研究阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病的发病机制。神经科学研究杂志。2005;81:412–425. doi:10.1002/jnr.20484。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • MJ西部。估计神经元和突触总数的体视学方法:精度和偏差问题。《神经科学趋势》。1999;22:51–61. doi:10.1016/S0166-2236(98)01362-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Yates CM、Butterworth J、Tennant MC、Gordon A.阿尔茨海默型痴呆和其他痴呆患者死后大脑中与pH和乳酸有关的酶活性。神经化学杂志。1990;55:1624–1630. doi:10.1111/j.1471-4159.1990.tb04948.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

文章来自细胞和组织银行由以下人员提供施普林格