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基因发育。2008年7月15日；22(14): 1948–1961.
doi（操作界面）：10.1101/gad.1661708
预防性维修识别码：PMC2492740型
PMID：18628400

转录辅激活物PGC-1α和PGC-1β控制围产期心脏成熟所需的重叠程序

凌来,1中，2,7 特雷莎·莱昂,1中，2,7 克里斯托夫·泽切纳,1中，2 保罗·谢弗,1中，2,三 肖恩·凯利,1中，2 丹尼尔·弗拉纳根,1中，2 丹尼斯·梅德罗斯,4 阿提拉·科瓦茨,1中，2和丹尼尔·凯利1中，2,5,6,8
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

氧化组织（如心脏）在围生期经历了大量线粒体生物生成，以满足出生后的高能量需求。PPARγ共激活因子-1（PGC-1）α和β与细胞能量代谢的转录控制有关。PGC-1α和PGC-1β联合缺乏小鼠−/−小鼠），以研究其体内功能的收敛性。PGC-1β的表型−/−小鼠在非应激条件下（包括正常心功能）表现最小，与PGC-1α类似−/−之前生成的小鼠。与单独缺失的PGC-1系形成鲜明对比的是，PGC-1αβ−/−小白鼠出生后不久死亡，心脏变小，心动过缓，间歇性心脏传导阻滞，心输出量明显减少。心脏特异性消融前列腺素C-1βPGC-1α缺陷背景现象上的基因复制了广义PGC-1β−/−老鼠。PGC-1αβ的心脏−/−小鼠表现出成熟缺陷的特征，包括生长减慢、线粒体生物发生的晚期胎儿停滞以及基因表达的胎儿模式持续存在。PGC-1αβ棕色脂肪组织（BAT）−/−小鼠的功能和线粒体密度也出现严重异常。我们的结论是，PGC-1α和PGC-1β共同发挥着对心脏和BAT出生后代谢和功能成熟所必需的作用。

关键词：转录调控、心脏发育、线粒体、能量代谢

转录辅激活物过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）辅激活物-1α（Ppargc1a，俗称PGC-1α）是根据其与棕色脂肪细胞核受体PPARγ的功能相互作用而发现的(Puigserver等人，1998年). 随后，鉴定出两种相关的转录辅活化因子，PGC-1β（Ppargc1b）和PGC-1相关辅活化因子（Pprc1，或通常称为PRC）(安德森和斯卡普拉2001;Kressler等人，2002年;Lin等人2002a). PGC-1α和PGC-1β在PGC-1家族成员中表现出最大程度的同源性，并优先在具有高容量线粒体功能的组织中表达，如心脏、慢转换骨骼肌和棕色脂肪组织（BAT）。PGC-1辅活化因子与特定靶转录因子对接，为蛋白质复合物的招募提供了平台，蛋白质复合物通过重塑染色质对靶基因转录产生强大的影响，并使RNA聚合酶II机制能够进入靶基因转录(Puigserver等人，1999年;Wallberg等人，2003年;Sano等人，2007年). 主要关注PGC-1α的研究表明，它通过协同激活多种核受体（如PPARγ、PPARα、雌激素相关受体[ERR]α）和非核受体（例如核呼吸因子[NRFs]、FOXO1）转录因子靶点发挥生物作用(Wu等人，1999年;Vega等人，2000年;Huss等人，2002年;Puigserver等人，2003年;Schreiber等人，2003年).

与大多数已知的转录辅激活物相反，PGC-1α和（在较小程度上）PGC-1β的表达可高度诱导，以响应发育阶段特异性和生理性线索(Puigserver等人，1998年;Wu等人，1999年;雷曼等人，2000年;芬克和凯利2006;Handschin和Spiegelman 2006). PGC-1α的表达是由冷暴露、运动和组织特异性禁食模式诱导的。对小鼠心脏的研究表明，PGC-1α是在出生时和出生后阶段诱导的，同时伴随着能量代谢的急剧成熟，这涉及到强大的线粒体生物反应，并转变为依赖脂肪酸作为主要燃料(雷曼等人，2000年;雷曼和凯利2002;塔哈和洛巴舒克2007;Buroker等人，2008年). 在培养的哺乳动物细胞或转基因小鼠中的过度表达研究表明，PGC-1α和PGC-1β都能够激活脂肪细胞、心肌细胞和肌细胞中线粒体生物生成和呼吸功能相关基因的级联表达(Wu等人，1999年;雷曼等人，2000年;Lin等人2002a;St-Pierre等人，2003年). 此外，获得功能的研究表明，PGC-1α激活参与肝糖异生的基因调控程序(Herzig等人，2001年;Yoon等人，2001年;Puigserver和Spiegelman 2003;Koo等人，2004年)，肌肉葡萄糖摄取(Michael等人，2001年;Wende等人，2007年)和慢开关肌纤维类型测定(Lin等人2002b).

最近，在小鼠身上进行了功能丧失研究，试图确定PGC-1辅活化剂的特定生物学作用，并确定这些分子在调节体内生物过程中的必要性。两个独立的鼠系具有广泛的灭活前列腺素C-1α基因已经产生(Lin等人，2004年;Leone等人，2005年). 前列腺素C-1α−/−在基础生理条件下，小鼠表现出令人惊讶的最小表型，这表明它对于线粒体生物发生或胎儿发育的基本过程是不可或缺的。然而，增加能量需求的生理条件，如冷暴露、禁食或运动，会导致PGC-1α缺乏小鼠的表型发生改变(Lin等人，2004年;Leone等人，2005年). 考虑到高容量线粒体系统对该器官的重要性，PGC-1α缺陷小鼠的基线心脏表型非常微小。然而，PGC-1α缺陷小鼠在长期压力超负荷后出现心室功能障碍(Arany等人，2006年).

最近，生成了三个独立的广义PGC-1β缺陷小鼠系。前列腺素C-1β−/−小鼠表现出应激诱导的表型，通常较温和，但与PGC-1α非常相似−/−老鼠(Lelliott等人，2006年;Vianna等人，2006年;Sonoda等人，2007年). 这些结果表明，PGC-1α和PGC-1β可能控制重叠靶的子集，因此能够补偿PGC-1功能丧失小鼠中其他因子的损失。为了解决这个问题，并进一步了解PGC-1辅激活剂在体内的作用，我们培育了PGC-1α和PGC-1β（PGC-1−/−)通过靶向所有四个等位基因。如其他人所述，我们发现我们的PGC-1β缺陷小鼠独立系表现出与PGC-1α缺陷小鼠相似的轻度基础表型。相比之下，PGC-1αβ−/−小鼠出生后不久死于心力衰竭，这与围生期心脏成熟发育停滞有关，包括线粒体生物生成受阻。

结果

PGC-1β-缺失小鼠的产生及一般特征

此前，有三个研究小组报告了PGC-1β缺陷小鼠并对其进行了表征(Lelliott等人，2006年;Vianna等人，2006年;Sonoda等人，2007年). 我们建立了一个独立的PGC-1β缺陷小鼠系。简单地说，使用cre-lox策略删除小鼠的外显子4-6前列腺素C-1β基因（补充图1A）。靶向缺失引入了预测的氨基酸移码，导致外显子7中的提前终止密码子。通过PCR、Southern blotting、RNA blotting和免疫印迹研究（补充图1B-D）证实了基因靶向事件和突变转录物生成的有效性。

杂合小鼠（PGC-1β+/负极)繁殖以产生PGC-1β−/−后代。如前所述(Sonoda等人，2007年)，存活率适度，但显著降低（观察到17%，预计25%；补充表1）。幸存的老鼠看起来很正常。鉴于PGC-1α对于对需要增加线粒体氧化能力的应激源的适应性生理反应是必要的(Lin等人，2004年;Leone等人，2005年)，PGC-1β−/−小鼠接受短期冷暴露和运动。六周龄PGC-1β−/−将小鼠置于无食物的寒冷环境（4°C）中4h。PGC-1β−/−小鼠无法将核心体温维持在与性别和体重匹配的野生型对照组相同的水平（补充图2A）。

PGC-1βBAT的电子显微镜分析−/−小鼠的线粒体体积密度或超微结构没有任何明显异常（数据未显示）。在电动跑步机上采用低强度、跑至筋疲力尽的运动方案评估运动表现。PGC-1β的平均运行持续时间−/−小鼠少于PGC-1β+/+小鼠（164±14 vs.202±10 min，P（P）<0.05）（补充图2B）。比目鱼肌的组织学分析和电镜研究未发现PGC-1β有任何明显的细胞或超微结构异常−/−小鼠（数据未显示）。然而，从后肢肌肉中分离出的线粒体的平均状态3呼吸速率略有下降，但在PGC-1β中显著下降−/−小鼠与PGC-1β的比较+/+对照组（73.93±6.12 vs.102.58±3.22 nmol O2每分钟每毫克蛋白质，P（P）<0.05）（补充图2C）。PGC-1β中肌肉状态3呼吸频率降低的发现−/−小鼠与最近的研究结果一致，研究表明，参与线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的基因在骨骼肌中的表达下调(Lelliott等人，2006年;Vianna等人，2006年;Sonoda等人，2007年)和BAT(Lelliott等人，2006年;Sonoda等人，2007年)在PGC-1β缺陷小鼠系中。综上所述，这些结果表明，PGC-1β的肌肉和BAT表型−/−小鼠与PGC-1α缺陷小鼠相似(Lin等人，2004年;Leone等人，2005年)表明PGC-1α和PGC-1β对冷运动和体力运动的适应性产热都是必要的。

为了确定PGC-1β对心脏功能的必要性，对年龄匹配的PGC-1−/−和PGC-1β+/+2个月大的对照小鼠。两组之间的平均左心室（LV）质量（64.87±3.52 vs.73.33±4.13 mg）和心脏收缩功能（LV缩短百分比，64.96±3.53 vs.58.32±0.99）无差异。为了评估心脏对应激的反应，进行了运动超声心动图检查。两组之间运动后心率反应和左室缩短分数相似（数据未显示）。前列腺素C-1β的组织学研究−/−心室未发现任何明显的纤维化或细胞异常（数据未显示）。PGC-1β的电子显微镜分析−/−乳头肌显示正常的肌节结构、线粒体形态和线粒体体积密度（补充图3）。总的来说，这些结果表明，正如我们之前报告的PGC-1α(Leone等人，2005年)，PGC-1β对正常心脏发育、结构和功能是不可或缺的。

PGC-1α可补偿PGC-1β的损失

PGC-1β缺乏心脏表型−/−在非表达条件下的小鼠强烈表明，补偿机制被激活，可能是通过相关的共激活因子PGC-1α的作用。作为探索这种可能性的第一步前列腺素C-1α在几个相关的PGC-1β中测定基因表达−/−组织。在基础条件下，PGC-1β中PGC-1αmRNA的水平−/−心脏与同窝婴儿的PGC-1β没有显著差异+/+控件(图1A). 然而，短期饥饿会增加心脏脂肪酸和酮类线粒体氧化的需求，在短期饥饿后，PGC-1αmRNA水平在PGC-1β中被诱导到较高水平−/−心脏与对照组比较(图1A). 此外，PGC-1β中BAT PGC-1α蛋白的平均水平较高−/−小鼠与PGC-1β的比较+/+基础条件下和暴露于寒冷环境下的小鼠(图1B). 因此，前列腺素C-1αPGC-1β在心脏和BAT中诱导基因表达−/−小鼠，尤其是在生理应激源增加线粒体ATP生成需求的情况下。

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PGC-1α和PGC-1β驱动了重叠基因调控程序的重要子集。(A类,左边)利用从PGC-1β心脏分离的RNA进行Northern印迹的代表性放射自显影+/+和PGC-1β−/−使用标准食物（Fed）或36小时后禁食（fast）的小鼠使用全长PGC-1αcDNA作为探针。PGC-1α转录物用箭头表示。28s核糖体RNA的溴化乙锭染色显示在底部作为加载控件。(赖特)使用心脏总RNA的定量RT-PCR（TaqMan）来表征喂食（灰条）和禁食（黑条）PGC-1β中PGC-1α基因的表达水平+/+和PGC-1β−/−红心。信使核糖核酸水平被标准化为36β4信使核糖核酸含量，并显示为相对于PGC-1β+/+fed值（=1.0）。(*)P（P）与相同基因型的喂养组相比，<0.05；(†)P（P）与PGC-1β禁食组相比<0.05+/+. (B类)PGC-1βBAT全细胞蛋白提取物的Western blot分析+/+和PGC-1β−/−小鼠在室温或4°C下。这个顶部箭头表示全长PGC-1α蛋白。非特异性带（NS）显示为负载控制。(C–D)培养的NRCM感染Ad-GFP、Ad-PGC-1α或Ad-PGC-1-β，并使用Affymetrix大鼠表达集230芯片进行基因表达阵列分析。(C类)Venn图显示了与Ad-GFP感染细胞相比，PGC-1α或PGC-1β上调的基因本体途径。这个左边圆圈表示PGC-1α上调的途径正确的圆圈代表PGC-1β上调的途径，重叠部分（黑色）代表两者上调的途径。(D类)饼图表示基因本体论类别“线粒体”中的基因，与Ad-GFP感染的细胞相比，PGC-1β上调了至少1.5倍(P（P）< 0.05). 白色部分表示PGC-1α也上调了至少1.5倍(P（P）< 0.05).

接下来，我们试图确定PGC-1辅活化子在心肌细胞中是否具有相同的基因靶点，因为PGC-1β的心脏表型最小−/−和PGC-1α−/−老鼠。为此，使用从感染了过度表达PGC-1α、PGC-1β或GFP的腺病毒的新生大鼠心肌细胞（NRCM）分离的RNA进行基因表达谱分析（腺病毒主干控制）。之所以使用NRCM，是因为在培养条件下，心肌细胞具有晚期胎儿代谢表型，包括PGC-1辅活化因子和靶点的最小表达(雷曼等人，2000年). 通路分析显示，38条通路受PGC-1β上调，其中26条通路也受PGC-α调控(图1C). 正如预期的那样，线粒体相关通路主要由这两种辅激活剂靶向（补充表2）。辅激活物共有的线粒体靶点包括参与脂肪酸氧化（FAO）、TCA循环、OXPHOS和葡萄糖氧化的基因（补充表3）。值得注意的是，参与PGC-1β上调线粒体代谢的基因中有70.5%也由PGC-1α诱导(图1D). 这些结果表明，受PGC-1α和PGC-1β调节的心脏代谢基因靶点存在显著重叠。

接下来，我们试图通过生成四种协同激活物都被靶向失活的小鼠来评估这两种协同激活剂的功能冗余前列腺素C-1α和前列腺素C-1β等位基因（PGC-1αβ−/−老鼠）。对于这些研究，PGC-1β+/负极PGC-1α背景为空的小鼠（PGC-1−/−β+/负极)产生并杂交产生双缺陷后代（PGC-1αβ−/−). PGC-1α产生的109只幼崽−/−β+/负极×PGC-1α−/−β+/负极杂交，无双纯合性缺失小鼠（PGC-1αβ−/−)断奶时发现。此外，PGC-1α−/−β+/负极未发现存活至断奶的小鼠与PGC-1α的预期比例为2:1−/−老鼠(表1，顶部），表明PGC-1αβ−/−基因型是致命的。确定PGC-1αβ的死亡年龄−/−组进行定时繁殖。在胎儿晚期对产囊的检查没有发现任何胚胎死亡的证据。出生时，所有PGC-1αβ−/−小鼠存活，基因分型显示预期的孟德尔比率(表1，底部），尽管他们的出生体重低于其他基因型（补充图4）。然而，大多数（～70%）的PGC-1αβ−/−幼崽在出生后24小时内死亡，所有幼崽在14天内死亡(图2). 这些结果证明了至少拥有一个前列腺素C-1α或前列腺素C-1β出生后存活的等位基因。

表1。

PGC-1αβ的存活率−/−老鼠

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结果表示为发现的具有任一基因型的动物总数和占总数的百分比。括号中给出了百分比（四舍五入）。

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PGC-1α和PGC-1β的缺乏是致命的。描述男性和女性PGC-1α存活率的死亡率曲线−/−（钻石，n个=55）和PGC-1αβ缺乏（PGC-1β−/−，正方形，n个=31）幼崽出生后28天。

PGC-1αβ−/−幼崽在出生后的第一个小时内表现出吃力的呼吸模式，暗示着新陈代谢或心肺危机。除了PGC-1αβ的血糖水平外，四种基因型之间的血糖值没有显著差异−/−小鼠的PGC-1αβ水平略低于但显著低于+/+对照组，但与PGC-1α类似−/−和PGC-1β−/−小鼠（补充图5A）。此外，禁食4小时后，所有四种基因型的血乳酸水平没有差异（补充图5B）。PGC-1αβ的尸检组织学分析−/−肺部显示肺泡塌陷的证据，而死亡前的切片是正常的，表明这些异常是继发性的，可能是充血性心力衰竭（补充图6A）。此外，PGC-1αβ的尸检大体和组织学分析−/−小鼠的大脑、肝脏和肾脏没有明显异常（补充图6B、C；数据未显示）。PGC-1αβ−/−心脏明显小于其他基因型的心脏，但没有表现出任何明显的形态学异常；所有四个腔都存在，大血管完好无损，方向正确，动脉导管在出生后适当闭合（数据未显示）。

在分离脂肪细胞中进行的PGC-1功能丧失研究强烈表明，PGC-1α或PGC-1β的存在对于棕色脂肪细胞的体外分化和线粒体成熟是必要的(Uldry等人，2006年). 因此，我们对双突变小鼠的BAT结构和功能进行了表征。PGC-1α棕色脂肪细胞中的脂滴大小和密度更大−/−，前列腺素C-1β−/−和PGC-1αβ−/−用PGC-1αβ与野生型对照组小鼠进行比较−/−组稍有异常（补充图7A）。来自所有四种基因型的BAT中的甘油三酯含量与组织学结果平行（补充图7B）。电子显微镜结合定量形态计量学证明，而BAT线粒体体积密度在PGC-1α中没有差异−/−和PGC-1β−/−BAT与野生型对照相比，PGC-1αβ显著降低−/−老鼠(图3A、B). PGC-1αβ的线粒体−/−BAT也表现出嵴密度降低(图3A). 与超微结构结果一致，关键PGC-1线粒体基因靶点（细胞色素c、体细胞、，周期; 细胞色素氧化酶4，Cox4公司; ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合物、β多肽、，Atp5b)PGC-1αβ显著降低−/−小鼠与其他基因型的比较(图3C). 为了评估BAT组织学和基因表达结果的功能相关性，对5-6周龄的PGC-1α进行了冷暴露研究−/−β+/负极老鼠。由于PGC-1αβ−/−老鼠没有存活下来。2 h后，PGC-1α的核心温度−/−β+/负极与年龄和性别匹配的野生型PGC-1α相比，小鼠的降幅显著降低−/−或PGC-1β−/−老鼠(图3D). 综上所述，这些结果表明，所有四个等位基因都是正常适应性产热反应所必需的，但两个PGC-1辅活化蛋白之间存在一些功能重叠，用于线粒体生物发生。

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PGC-1αβ缺陷小鼠的BAT表型。(A类)野生型（αβ+/+)，PGC-1α−/−(α−/−)，前列腺素C-1β−/−(β−/−)和PGC-1αβ−/−（αβ−/−)两种不同放大倍数的老鼠。每个基因型标签表示其下方的垂直列。横线：顶部行，2μm；底部行，500 nm。(B类)基于电子显微照片分析的线粒体部分细胞体积密度的定量形态测量。条形代表平均值±SEM。（*）P（P）与αβ相比<0.05+/+. (C类)PD0.5野生型PGC-1α心脏提取RNA的实时定量RT-PCR分析−/−，PGC-1β−/−和PGC-1αβ−/−小鼠用于以下方面：氧化磷酸化-细胞色素c，体细胞(周期)，细胞色素氧化酶4(Cox4公司)、ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合物、β多肽(Atp5b). mRNA水平归一化为18s rRNA含量，并相对于PGC-1αβ表达+/+值。条形代表平均值±SEM。（*）P（P）与αβ相比<0.05+/+; (†)P（P）与α相比<0.05−/−; (#)P（P）与β相比<0.05−/−. (D类)36日龄至42日龄PGC-1αβ+/+（开放广场，n个=11），PGC-1α−/−（开口三角形，n个=7），PGC-1β−/−（开环，n个=13）和PGC-1α−/−β+/负极老鼠（黑色方块，n个=13）遭受低温（4°C）。图中显示了岩心温度±SEM的变化随时间的变化。(*)P（P）与αβ相比<0.05+/+; (†)P（P）与α相比<0.05−/−; (#)P（P）与β相比<0.05−/−.

前列腺素C-1αβ−/−老鼠死于心力衰竭

评估PGC-1αβ的心脏结构和功能−/−小鼠出生后～12h进行超声心动图和多普勒检查。PGC-1αβ组的LVM绝对质量（LVM）和LVM体重校正值（LVMI）均显著降低−/−小鼠与野生型PGC-1α的比较−/−和PGC-1β−/−符合生长缺陷的组(表2). 前列腺素C-1αβ−/−心脏在舒张期的平均左室内径（LVID）也显著减小，这与心脏缩小一致(表2). PGC-1αβ组的平均心率显著降低−/−小鼠与其他基因型的比较(表2). 仔细检查代表舒张期左室充盈的被动（E波）和心房收缩（A波）成分的心率和多普勒速度波形，发现它们并不总是与收缩性左室流出流相耦合，这与间歇性二度心脏传导阻滞相一致，发生在各种a:V传导模式中，包括2:1、3:1、4:1、6:1和8:1（补充图8）。

表2。

PGC-1αβ的超声心动图参数−/−出生时的小鼠

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(*)P（P）与PGC-1αβ相比<0.05+/+老鼠；(†)P（P）与PGC-1α相比<0.05−/−老鼠；（#）与PGC-1β相比P<0.05−/−老鼠。（HR）心率；（LVPW）左室后壁（舒张或收缩）；（LVPWdi）左室后壁舒张指数；（LVID）左室内径（舒张或收缩）；（LVM）LV质量；（LVMI）LV质量指数；（RWT）相对壁厚=（LVPWd+IVSd）/LVIDd；（FS）部分缩短。

通过多普勒测量降主动脉近端的主动脉直径和血流速度，对新生小鼠进行心输出量测量。PGC-1αβ显著降低心输出量−/−小鼠与其他基因型的比较(图4A、B)尽管保留了LV部分缩短(表2). 为了进一步分析心脏性能，Tei指数是一个基于心脏周期内事件发生时间的非侵入性衍生的收缩和舒张联合功能参数，它是使用心脏的脉搏波多普勒频谱测定的反式-二尖瓣和左室流出道速度(Tei等人，1995年). 为了解释各组间心率差异的潜在混杂效应，将野生型小鼠的心率降低至PGC-1αβ中测得的心率−/−小鼠通过窦房结抑制剂Zatebradine。PGC-1αβ的平均Tei指数异常−/−小鼠与其他基因型的比较(图4A)反映出指数三个组成部分中的每一个都有显著异常（等容收缩时间和等容松弛时间增加[IVRT]，以及射血时间减少，如图所示图4B). 有趣的是，与PGC-1αβ相比，PGC-1β缺乏的心脏表现出明显的性能下降+/+心脏，尽管没有PGC-1αβ严重−/−老鼠。最后，Doppler-derived舒张充盈参数显示PGC-1αβ的E/A比值降低，IVRT延长−/−小鼠，与心室舒张功能受损一致(图4A). 综上所述，心功能结果表明PGC-1αβ−/−小鼠出生后心输出量明显减少，可能是由于心率过低，同时收缩和舒张功能降低。

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PGC-1αβ缺乏小鼠心力衰竭的证据。为了无创评估所有四种基因型的心脏功能，在出生后数小时内进行了高分辨率超声心动图检查。(A类)条形图显示左心室收缩（心输出量）、舒张（E/A比率，IVRT）和合并（Tei指数）的代表性指数心室功能。(B类)代表性图片反式-野生型（αβ）二尖瓣/左心室流出道（LVOT）多普勒频谱+/+)和PGC-1αβ−/−(αβ−/−)双阴性小鼠的心脏时间间隔明显改变，LVOT速度降低。（IVRT）等容松弛时间；（IVCT）等容收缩时间；（ET）喷射时间。

尽管我们在PGC-1αβ中发现了显著的心脏表型−/−小鼠的心脏外效应，包括但不限于异常产热，可能导致出生后早期死亡。为了解决这个问题，我们生成了小鼠，其中前列腺素C-1β在广泛的PGC-1α缺乏背景（PGC-1−/−βf/f/MHC-Cre公司)通过Cre重组介导的外显子4-6的切除，使用与生成广义PGC-1β-缺失小鼠相同的父靶向载体（策略如补充图9A所示）。心脏特异性前列腺素C-1β通过使用αMHC-Cre小鼠实现基因缺失(Agah等人，1997年)，在心脏α肌球蛋白重链启动子驱动的心肌细胞中特异性表达Cre重组酶（补充图9B；数据未显示）。组合PGC-1α−/−和心肌特异性PGC-1β缺陷小鼠（PGC-1α−/−βf/f/MHC-Cre公司)是通过繁殖产生的。在后代中预期的四种基因型中，有三种是可行的，并且以预期的1:1:1比率生产（补充表4）。类似于广义PGC-1αβ−/−小鼠，PGC-1α−/−βf/f/MHC-Cre公司小鼠出生时是活的，67%的幼崽在出生后24小时内死亡，所有幼崽都在7天内死亡（补充图10）。新生儿PGC-1α的平均超声心动图心输出量测量−/−βf/f/MHC-Cre公司小鼠（对照组，920±40 vs.PGC-1α−/−βf/f/MHC-Cre公司（479±28μL/min）与PGC-1αβ−/−小鼠（αβ+/+，852±52相对于αβ−/−每分钟342±47μL）。这些结果表明，PGC-1α−/−βf/f/MHC-Cre公司小鼠对全身性PGC-1αβ缺陷小鼠进行表型分析，为PGC-1αβ缺陷的结论提供了进一步的支持−/−小鼠死于心力衰竭。

PGC-1αβ心脏线粒体成熟阻滞的证据−/−老鼠

接下来，我们试图研究PGC-1αβ中心力衰竭的基础−/−老鼠。基于TUNEL、caspase和三色染色（数据未显示），没有凋亡或纤维化改变的证据。然而，电子显微镜研究显示PGC-1αβ心脏线粒体异常−/−小鼠，其中最突出的是线粒体数量和大小的显著减少，这与线粒体生物发生的缺陷相一致(图5A). PGC-1αβ的心肌线粒体−/−小鼠还表现出多种超微结构异常，包括空泡和嵴密度降低，表明生物发生缺陷或肿胀(图5A). 定量形态计量学证实，尽管PGC-1αβ心肌细胞的肌原纤维体积密度正常，但平均细胞线粒体体积密度显著降低−/−老鼠(图5B). 重要的是，PGC-1α的心肌细胞线粒体体积密度−/−和PGC-1β−/−心脏没有减少。线粒体DNA定量结果也支持这一结论（补充图11）。

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PGC-1αβ心脏线粒体密度和结构异常−/−老鼠。(A类)野生型（αβ+/+)，PGC-1α−/−(α−/−)，前列腺素C-1β−/−(β−/−)和PGC-1αβ−/−(αβ−/−)三种不同放大倍数的老鼠。每个基因型标签表示其下方的垂直列。横线：顶部行，2μm；中间的行，500nm；底部行，100 nm。箭头表示PGC-1αβ线粒体内的空泡异常−/−老鼠。(B类)线粒体细胞体积密度的定量形态测量(左边)和肌原纤维(正确的)基于电子显微照片分析的分数。条形代表平均值±SEM。（*）P（P）与αβ相比<0.05+/+.

在PGC-1αβ的心室中也观察到多种细胞超微结构异常−/−老鼠。注意到大部分或部分缺乏线粒体、肌节和其他细胞器的肌细胞亚群（补充图12A，B）。类似的细胞和线粒体紊乱，包括线粒体数量和大小的显著减少，也见于PGC-1α的出生后心脏−/−βf/f/MHC-Cre公司小鼠（数据未显示）。

PGC-1αβ心脏线粒体异常−/−小鼠表现出线粒体成熟阻滞。心脏线粒体生物生成的主要激增发生在胎儿晚期的心脏，并持续到出生后早期(Hallman 1971年;Smolich等人，1989年;Marin-Garcia等人，2000年). 确定PGC-1αβ中这种围生期线粒体生物反应是否有缺陷−/−在小鼠胚胎第16.5和17.5天（E16.5和E17.5）和出生后第0.5天（PD0.5）对所有四种基因型的小鼠心脏样品进行了电子显微镜研究。在E16.5，与出生后心室切片相比，所有四种基因型的线粒体都较小且稀疏(图6A). 与之形成鲜明对比的是，在PD0.5时，PGC-1αβ发生了显著的心脏生物反应+/+，PGC-1α−/−和PGC-1β−/−小鼠，但不包括PGC-1αβ−/−组(图6A). E17.5时，除PGC-1αβ外，所有基因型的线粒体密度都有适度增加−/−这表明双突变小鼠线粒体生物生成的后期产前激增受阻。线粒体DNA测量也显示出相同的模式（补充图13）。表达式前列腺素C-1α和前列腺素C-1β在野生型小鼠心脏中，从E15.5到PD0.5的基因被协调诱导，与观察到的线粒体生物反应平行(图6B)提供更多证据支持这些辅活化因子在围生期线粒体生物激增中的作用。

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PGC-1αβ阻断了围生期线粒体的生物生成−/−红心。(A类)E16.5心肌切片（左室游离壁）的典型电子显微照片(顶部面板），E17.5(中间的面板）和PD0.5(底部面板）来自野生型（αβ+/+)，PGC-1α−/−(α−/−)，前列腺素C-1β−/−(β−/−)和PGC-1αβ−/−(αβ−/−)老鼠。棒材，2μm。(B类)E15.5、E17.5、E18.5和PD0.5 C57BL6/J小鼠心脏提取RNA的定量实时RT-PCR分析PGC-1α（白色条）和前列腺素C-1β（黑条）基因。mRNA水平归一化为36B4 mRNA水平，并相对于E15.5值表达（=1.0）。使用NADH脱氢酶（ND1）引物对来自心脏的总DNA进行定量PCR，以量化线粒体DNA（灰色条），并使用脂蛋白脂肪酶（LPL）引物对基因组DNA进行定量。ND1水平归一化为LPL DNA含量，并相对于E15.5值表达（=1.0）。条形代表平均值±SEM。（*）P（P）与E15.5相比<0.05。

PGC-1αβ中发现的小心脏和线粒体生物性停搏−/−小鼠强烈表明心脏成熟存在普遍缺陷。为了进一步探讨这种可能性，在PGC-1αβ中评估了出生后心肌细胞成熟的基因调控特征−/−并与其他基因型进行比较。已知的终末成熟代谢标记物包括参与线粒体氧化途径的PGC-1靶基因，如FAO和OXPHOS。定量RT-PCR分析显示FAO相关基因的表达（乙酰辅酶A脱氢酶，中链[阿卡德姆]，酰基辅酶A脱氢酶，超长链[阿卡德夫]，肉碱棕榈酰转移酶1b[Cpt1b型]，肉碱棕榈酰转移酶2[Cpt2号机组])和OXPHOS(周期,Cox4公司，以及Atp5b)PGC-1αβ显著降低−/−心脏与野生型对照(图7). 还分析了葡萄糖代谢标记物。己糖激酶2(Hk2型)丙酮酸脱氢酶激酶4增加(预测值k4)PGC-1αβ显著降低−/−心脏，表明指导从胎儿期依赖葡萄糖到出生后脂肪酸作为首选燃料的转变的程序被阻止。此外，一些与细胞能量代谢无关的胎儿心脏基因标记物的表达，包括心钠素(Nppa公司)和脑钠肽(无购买力平价)，在PGC-1αβ中保持升高−/−心室(图7)，而α肌球蛋白重链的表达(Mhy6型)，一种成年肌节异构体，PGC-1αβ减少−/−以及PGC-1α−/−红心。这些基因标记结果与心脏成熟的普遍停滞相一致，并表明代谢途径与广泛的心肌细胞成熟程序之间存在调节联系。

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心脏基因表达标记与胎儿-成人过渡期的阻滞相一致。PD0.5野生型（αβ+/+)，PGC-1α−/−(α−/−)，前列腺素C-1β−/−(β−/−)和PGC-1αβ−/−(αβ−/−)小鼠用于以下方面：氧化磷酸化-细胞色素c，体细胞(周期)，细胞色素氧化酶4(Cox4公司)、ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合物、β多肽(Atp5b)；脂肪酸氧化-乙酰辅酶A脱氢酶，中链(阿卡德姆)，酰基辅酶A脱氢酶，超长链(阿卡德夫)，肉碱棕榈酰转移酶1b(Cpt1b型)，肉碱棕榈酰转移酶2(Cpt2号机组)；糖酵解/葡萄糖氧化己糖激酶2(香港2号)，磷酸果糖激酶(Pfk公司)，丙酮酸脱氢酶激酶4(预测值k4)；普通成人心脏基因标记物-试验性利钠素(ANF公司)、脑钠肽(法国巴黎银行)，ATP酶，钙2+运输，心肌，缓慢收缩2(塞尔卡2a)和α-肌球蛋白重链(我的6). mRNA水平归一化为β-肌动蛋白mRNA含量，并相对于PGC-1αβ表达+/+值。条形代表平均值±SEM。（*）P（P）与αβ相比<0.05+/+; （†）与α相比P<0.05−/−; (#)P（P）与β相比<0.05−/−.

讨论

哺乳动物的心脏在生物体的整个生命周期中起着持续泵的作用。出生后，心肌每天燃烧大量ATP，以满足产后生活的能量需求。在胎儿期，心脏主要利用葡萄糖和乳酸生成ATP(Fisher等人，1980年,1981;Girard等人，1992年). 成人心脏的巨大能量需求在很大程度上是通过线粒体中脂肪酸的氧化来满足的(Bing 1955年;伊托伊和洛巴舒克1993;塔哈和洛巴舒克2007). 因此，为了适应出生后生活的严酷，心脏经历了围产期代谢成熟，包括燃料“转换”和线粒体功能能力的急剧增加(Marin-Garcia等人，2000年;塔哈和洛巴舒克2007). 在此，我们表明，PGC-1α和PGC-1β的集体作用构成了分子电路的一个关键组成部分，该分子电路驱动围生期线粒体生物发生，而线粒体生物发生是小鼠心脏和BAT代谢和功能成熟所必需的。

我们的结果表明，关键的晚期胎儿和围产期心脏发育事件在PGC-1αβ中没有激活−/−老鼠。PGC-1αβ的心室和大血管−/−小鼠明显正常，表明主要的早期胎儿发育事件没有受到影响。然而，双突变动物的心脏很小，在出生时发生的显著线粒体生物反应被发现在PGC-1αβ中完全缺失−/−老鼠。双缺陷动物也显示出传导系统不成熟的证据，包括心动过缓和心脏传导阻滞。与这一结论一致的是，ERRγ（PGC-1介导的共激活的已知靶点）缺乏的小鼠最近显示出与心脏围产期从依赖葡萄糖向氧化代谢转变的阻断一致的基因调控特征(Alaynick等人，2007年). 综上所述，这些结果表明，虽然早期线粒体的形成不需要PGC-1α和PGC-1β，但它们对于指导胎儿晚期和出生后心脏成熟的程序是必要的。可能相关因素PRC正在补偿早期胎儿发育过程。此外，考虑到我们的原始前列腺素C-1α基因消融策略并不排除产生较小突变的可能性前列腺素C-1α蛋白质(Leone等人，2005年)，理论上有可能在PGC-1αβ的早期发育阶段有少量残留的PGC-1α活性进行补偿−/−老鼠。

我们的结果强烈表明，PGC-1α和PGC-1β至少在心脏和BAT中共享关键基因靶点和功能的子集。以下证据支持这一结论：（1）前列腺素C-1α在PGC-1β缺陷小鼠的BAT和心脏中诱导基因表达，表明在这种情况下存在代偿反应；（2） 寒冷不耐受表型和BAT线粒体紊乱的严重程度与缺失的数量平行增加前列腺素C-1α和前列腺素C-1β等位基因，结果与之前在分离的棕色脂肪细胞中进行的研究结果一致(Uldry等人，2006年)；（3） 心肌细胞的基因表达谱显示，PGC-1α和PGC-1β靶通路存在高度重叠，尤其是涉及线粒体代谢的靶通路；和（4）虽然PGC-1β缺陷小鼠和PGC-1α缺陷小鼠存活的心脏表型很少，但联合缺乏导致100%的出生后心力衰竭致死。对我们的基因表达阵列结果的进一步分析也提供了一些关于哪些下游转录因子可能参与共享PGC-1功能的想法。两种辅激活剂激活的基因的重要子集（补充表2、3）也是ERRα和ERRγ的直接靶点，根据基因表达谱和ChIP-ChIP启动子占位分析，已知的PGC-1辅激活靶点位于心肌细胞(Dufour等人，2007年). 该比较分析表明，在本研究中，参与线粒体FAO、呼吸和ATP合成的大量ERR靶基因也被PGC-1α和PGC-1β激活。这些结果表明，PGC-1αβ中发生的深层心肌线粒体表型−/−小鼠与ERR基因调控途径的失活有关。

尽管这些结果表明存在显著的基因靶点和功能冗余，但也存在互补性PGC-1辅活化子特异性作用的证据。例如，单个PGC-1-null小鼠的应激诱导表型表明，这两种辅激活物对于满足产后生活的所有生理需求都是必要的。单个PGC-1基因缺失小鼠的冷暴露、跑步机运动或禁食沉淀表型(Lin等人，2004年;Leone等人，2005年;Lelliott等人，2006年;Vianna等人，2006年;Sonoda等人，2007年). 此外，针对非心脏组织的研究结果表明，PGC-1β驱动了与PGC-1α不同的一系列程序，包括肝脏脂肪生成和胆固醇代谢(Lin等人，2005年)和骨骼肌IIx纤维类型测定(Mortensen等人，2006年;Arany等人，2007年). 在培养的棕色脂肪细胞中进行的单个和组合PGC-1α和PGC-1β功能丧失研究也揭示了线粒体功能的互补作用(Uldry等人，2006年). 这两个共激活子很可能由不同的上游电路调节(Lin等人2002a)根据组织或细胞类型之间的特定生理刺激，以辅激活子特异模式规定共同和不同的基因靶点。

广泛的表型分析表明，PGC-1αβ的出生后早期死亡−/−小鼠是由于严重的心脏功能障碍。PGC-1αβ−/−心脏表现为间歇性二度房室传导阻滞，心输出量极低。低心排血量的基础可能与心脏体积相对较小、心动过缓和收缩功能降低有关。收缩功能障碍可能至少部分是由于与未成熟线粒体相关的线粒体ATP产生能力降低，以及产后对FAO相关基因的诱导受阻，FAO是产后的主要能量来源。支持后一结论的是，线粒体FAO酶的先天性错误是儿童遗传性心肌病的重要原因(凯利和施特劳斯1994). 此外，靶向消融编码ERRγ基因（PGC-1α和β的已知靶点）的小鼠(Huss等人，2002年;Kamei等人，2003年;Schreiber等人，2003年)，出生后早逝，心脏较小，心肌FAO相关基因表达减少(Alaynick等人，2007年). 最后，在广泛的PGC-1α缺乏背景下，患有心脏特异性PGC-1β缺乏的小鼠（PGC-1−/−βf/f/MHC-Cre公司小鼠）观察广义PGC-1αβ−/−小鼠，为致命表型是由心脏错乱引起的结论提供了额外的支持。然而，鉴于PGC-1αβ的BAT中发现的严重异常−/−小鼠，这种表型可能也与出生后的存活率不相容。

材料和方法

广义PGC-1β-缺失和心肌特异性PGC-1α-缺失小鼠的产生

使用Sv129基因组DNA作为模板，使用PCR创建三个扩增子，随后将其插入pGKNeo-p1339（GenBank Accession#AF335420型). 3′扩增子还包含一个工程LoxP位点，用于通过Cre重组酶切除外显子4、5和6。该结构用XhoI线性化，并使用G418选择电穿孔到SCC10 ES细胞（源自RW4）。通过Southern blotting和PCR对克隆进行筛选。在筛选出的216个克隆中，有一个克隆的重组事件呈阳性。将该克隆注射到C57BL6/J囊胚中。种皮颜色和尾部DNA PCR分析证实了种系传播。含有靶向等位基因的雌性小鼠与雄性EIIa-Core小鼠杂交，以产生完全和条件敲除小鼠。通过Southern blotting和PCR对后代进行筛选。选择包含带有外显子4-6盒的重组等位基因以及移除新霉素盒的小鼠，以产生广义“敲除”（PGC-1β−/−). 只取下新霉素盒的小鼠被选为条件敲除小鼠。小鼠被维持在杂交背景C57BL6/J×sv129中。只要有可能（如文中所示），就使用Littermates来控制应变效应。

PGC-1aβ双缺陷小鼠的产生

PGC-1α任一基因缺失的小鼠(Leone等人，2005年)或PGC-1β被培育以产生复合杂合子（PGC-1α+/负极β+/负极)将小鼠杂交，产生PGC-1α缺陷和PGC-1β杂合的小鼠−/−β+/负极). 这些小鼠被用作繁殖者，以产生本研究中使用的后代。小鼠保持在杂交背景（C57BL6/J×sv129）和同窝小鼠的PGC-1α−/−和PGC-1αβ−/−用于比较分析，以控制遗传背景效应。前列腺素C-1β−/−和PGC-1αβ+/+小鼠是用不同的繁殖配对产生的。

动物表型研究

所有动物实验和安乐死方案均严格按照美国国立卫生研究院动物人道治疗指南进行，并经华盛顿大学医学院动物护理和使用委员会审查和批准。

在2至8周龄的不同时间点对动物进行称重，并将其直接与性别匹配的室友进行比较。对于冷暴露实验，男性和女性PGC-1β+/+和PGC-1β−/−将小鼠单独饲养，并在4°C下放置3-4小时，不进食。在基线检查时和之后每小时用直肠探头监测核心体温。至少每30分钟对小鼠进行一次监测，以检查其是否嗜睡。在4小时结束时，处死小鼠并采集组织进行RNA和蛋白质提取。在禁食研究中，动物被单独饲养并随意饮水。早上从笼子中取出食物，36小时后采集组织进行RNA和组织学检查。对于产前和死亡率曲线研究，进行了定时繁殖，并通过检测阴道塞（E0.5）来确定怀孕情况。密切监测出生时间，并在出生后12小时内对新生儿进行计数和基因分型χ2分析。每天随访28天的产后存活率。使用一触式超血糖仪（LifeScan，Inc.）测量新生儿的血糖。新生儿的血乳酸用乳酸前血乳酸测试仪（ARKRAY公司）测量。

对于低强度运动研究，9周龄女性PGC-1β+/+(n个=6）和PGC-1β−/−(n个=6）使用电动、速度可控的模块化跑步机系统（哥伦布仪器公司）使小鼠筋疲力尽。跑步机配有电击刺激和可调节的倾斜角度。跑步速度设置为10 m/min，持续一小时，每15分钟增加2 m/min，直到达到筋疲力尽。

对于成年小鼠的超声心动图研究，2月龄雌性PGC-1β+/+(n个=5）和PGC-1β−/−(n个=5）通过腹腔注射3%阿维汀（三溴乙醇，0.01 mL/g）对小鼠进行轻度麻醉。如前所述进行心脏超声检查(Rogers等人，1999年). 如前所述，在PGC-1β耐受的持续时间内，在电动跑步机上进行运动超声心动图−/−小鼠（1–1.5分钟）(Leone等人，2005年).

对于新生儿超声心动图，在出生后12小时内使用Vevo 770超声系统（Visual Sonics，Inc.）对雄性和雌性幼犬进行成像。将未麻醉的小鼠放在加热灯下的成像台上，并将其轻轻限制在左侧卧位。从标准超声心动图视图获得胸骨旁心脏的长轴和短轴图像。左心室的半尖峰长轴视图用于询问合并的反式-二尖瓣和左室流出道血流速度。使用基底短轴视图对肺动脉和降主动脉近端进行成像。将脉搏波多普勒样本量与血流方向平行放置，并在相同水平上测量主动脉直径。心输出量是多普勒描记的主动脉面积和速度时间积分的乘积。Tei指数计算为（IVCT+IVRT）/LVET，其中IVCT是等容收缩时间（二尖瓣关闭和主动脉瓣打开之间的时间段），IVRT是等容舒张时间（主动脉瓣关闭和二尖瓣打开之间），LVET是LV射血时间（主动脉瓣膜打开和关闭之间的时间）。

RNA、DNA、蛋白质和组织甘油三酯分析

使用RNAzol方法（Tel测试）从各种小鼠组织中分离总RNA。Northern印迹(Kelly等人，1989年)并按所述进行定量实时RT-PCR(Huss等人，2004年). 简而言之，总RNA被分离出来，并用塔克曼逆转录试剂（应用生物系统）进行逆转录。使用Prism 7500序列检测器（Applied Biosystems）以96-well格式进行三次PCR反应。用于检测特定基因表达的小鼠特异性引物探针集见补充表5。β-actin（Applied Biosystems）、36B4或18s引物探针组（补充表5）均包含在单独的微孔中（一式三份），并用于规范化图图例中所示的基因表达数据。

使用RNAzol分离基因组/线粒体DNA，然后使用4 M胍硫氰酸盐、50 mM柠檬酸钠和1 M tris进行反萃取，并进行酒精沉淀。线粒体DNA含量通过SYBR绿色分析（应用生物系统）测定。为此，NADH脱氢酶亚单位1（线粒体DNA）的水平被标准化为脂蛋白脂肪酶（基因组DNA）的级别。引物序列见补充表5。

对于Southern blot分析，用SpeI消化5μg基因组DNA，在0.8%TAE凝胶上电泳，然后转移到Gene Screen（Perkin-Elmer）膜上进行杂交。按说明进行蛋白质印迹(Cresci等人，1996年)使用Super Signal West Dura Extended Dura基板（Pierce）进行检测。多克隆PGC-1β抗体是Anastasia Kralli博士慷慨赠送的礼物。前列腺素C-1α抗体先前已有描述(雷曼等人，2000年).

华盛顿大学医学院动物模型研究中心（由CNRU支持）使用改进的Bligh and Dyer技术对冷冻组织进行了总组织甘油三酯分析，如前所述(布莱和戴尔1959).

线粒体呼吸研究

如前所述，在以丙酮酸为底物的后肢肌肉分离线粒体中评估线粒体呼吸(Bhattacharya等人，1991年). 简言之，3个月大的雄性小鼠被CO安乐死2吸入。从骨头上切下整个后肢并切碎，然后在离子培养基（IM）和Nagarse（100 mM蔗糖，10 mM EDTA，100 mM Tris-HCl，46 mM Kcl，pH 7.4，10 mg Nagarse）中孵育5分钟。使用Eberbach均质器均质样品，在500℃下离心克在4°C下保持10分钟，将上清液转移到干净的试管中。上清液在12000℃离心克然后将颗粒重新悬浮在IM+0.5%BSA中。再次旋转样品，并将颗粒再次悬浮在悬浮缓冲液中（230 mM甘露醇、70 mM蔗糖、0.02 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、5 mM K）2高性能操作4pH值为7.4）。通过BCA分析（Pierce）量化总蛋白，并使用光学探针（Oxygen FOXY probe，Ocean Optics）在25°C下进行呼吸。在测量基础呼吸之后，通过将线粒体暴露于1mM ADP来确定最大（ADP刺激的）呼吸。在添加寡霉素（1μg/mL）后评估解偶联呼吸。25°C下呼吸缓冲液中氧的溶解度为246.87 nmol O2每毫升。呼吸速率用“nmol O”表示2●最小值−1●mg蛋白质−1.”

组织学和电子显微镜

成年小鼠被麻醉，并灌注卡诺夫斯基固定剂（2%戊二醛、1%多聚甲醛和0.08%二甲氨基甲酸钠）以避免伪影。新生儿被安乐死，心脏被卡诺夫斯基固定剂固定。解剖心脏乳头肌（成人）、左室游离壁（新生儿）、BAT、比目鱼肌和EDL肌，并将其固定在1%四氧化锇中，在梯度乙醇中脱水，包埋在Poly Bed塑料树脂中，切片进行电子显微镜观察。如前所述，通过电子显微镜测定线粒体和肌原纤维的体积密度(Russell等人，2004年). 对于每只动物，在放大7500倍的条件下，以盲法对三个不同的视野进行量化。数据表示为每个区域线粒体或肌原纤维的平均体积密度。

H&E染色由华盛顿大学医学院（DDRCC）形态学核心进行。组织用10%的福尔马林缓冲液固定过夜，在分级浓度的酒精中脱水，并包埋在石蜡中，从石蜡中制备5μm切片。

基因表达谱分析

用Superscript II（Invitrogen Corp.）逆转录培养的NRCM腺病毒感染Ad-GFP、Ad-PGC-1α或Ad-PGC1β后的总RNA，并用T7启动子-polyA引物（T7T24）引物引物，然后根据制造商的方案进行二链合成。使用T7-coupled ENZO BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit（ENZO Diagnostics，Inc.）合成生物素标记的cRNA。华盛顿大学医学院Alvin J.Siteman癌症中心的生物信息学核心对Affymetrix大鼠表达集230芯片进行了杂交。Affymetrix MAS 5.0软件用于初始分析和背景归一化Z轴使用Spotfire DecisionSite for Functional Genomics 9.0进行得分计算和随后的数据分析。排除了所有Ad-GFP对照、Ad-PGC-1α和Ad-PGC1β中MAS 5.0称为“缺失”的探针组。进行了两项独立试验。学生的t吨-进行了测试，并且P（P）-值<0.05用于确定显著上调的基因。对两项试验的信号强度比进行平均，并计算为Ad-PGC-1α/Ad-GFP或Ad-PGC-1β/Ad-GFP，以确定PGC-1α或PGC-1β外源性表达引起的变化。在培养的NRCM中，计算出的折叠变化≥1.5的基因被视为上调的基因靶点。为了进行通路分析，将过滤后的数据集上传到GenMAPP软件中，以使用基因本体数据库审查生物通路。GenMAPP根据以下标准生成了基因本体论生物类别的排名列表：（1）在选定的GO术语中至少有五个受调控基因；（2） >50%的基因在选定的途径中受调控（>50%“改变”）。“变化百分比”是通过“符合标准的基因/测量的基因*100”计算得出的Z轴分数是通过从观察到的数量中减去符合标准的预期基因数量，然后除以观察到的基因数量的标准偏差来计算的。

统计分析

数据分析使用t吨-测试或方差分析（如适用）。显著性水平设置为P（P）所有情况下均<0.05。除非另有说明，否则数据报告为平均值±平均值的标准误差。

致谢

我们感谢Anastasia Kralli博士（Scripps）提供PGC-1β抗体；Juliet Fong、Michelle Trusgnich和Alicia Wallis帮助饲养老鼠；威廉·卡夫（William Kraft）电子显微镜专家技术援助；Mike Courtois协助进行超声心动图检查；Suellen Greco博士、Erica Crouch博士、Feng Chen博士和Robert Schmidt博士仔细分析组织病理学；Jeffrey Saffitz博士（Beth Israel女执事医疗中心），就电子显微镜提供咨询意见；Patrick Jay博士帮助评估心脏形态学；和玛丽·温盖特协助编写手稿。L.L.获得AHA奖学金（0525743Z）的支持。C.Z.是德国Forschungsgemeinschaft研究奖学金ZE 796/2-1的获得者。这项工作得到了NIH拨款RO1 DK045416、RO1 HL058427、消化疾病研究核心中心（P30 DK052574）、糖尿病研究与培训中心（P60 DK020579）、阿尔文·J·斯特曼癌症中心生物信息学核心和胚胎干细胞核心（P30 CA91842）以及临床营养研究单元核心中心（P30 DK56341）的支持。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社